专利名称：甘蓝型油菜低芥酸分子标记及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于油菜分子育种技术领域，具体涉及一种甘蓝型油菜低芥酸分子标记的 制备及应用。所述的分子标记可以作为低芥酸甘蓝型油菜育种标记辅助选择，为培育遗传 稳定的低芥酸油菜新品种提供新的分子标记。
背景技术：
芥酸是一种22碳长链脂肪酸，分子式为CH3(CH2)7CH = CH(CH2) nCOOH。主要存在 于十字花科(Cruciferae)和金莲花科(Tropaeolaceae)植物种子中。十字花科芸薹属 (Brassica spp.)和糖芥属(Erysimum spp.)植物的种子中芥酸含量一般为30% 60%， 金莲花科植物种子的芥酸含量可高达80%，一些海洋动物的油脂中也发现有芥酸存在。芥 酸和其它脂肪酸一样大部分可以被消化吸收和进入代谢。人体对高芥酸菜油基本能够完 全消化(99% )，而老鼠只能消化77%左右。有试验显示，芥酸可以使老鼠等动物患心肌脂 肪沉积症，按每千克体重饲喂6600mg芥酸时老鼠还会发生心肌坏死和纤维化，其原因可能 是，芥酸和其他长链脂肪酸一样，难以被线粒体氧化酶系统作为基质利。但迄今为止， 还没有发现芥酸导致人体心脏疾患的直接证据(武玉花等，植物芥酸合成代谢与遗传调控 研究进展.中国油料作物学报，2005，27 (2) :82 76)。在植物细胞内，脂肪酸的合成系统分为从头合成系统和延长系统，其中从合成系 统只能合成C18以下的脂肪酸；延长系统以油酸为底物，经过两个连续的缩合反应形成C2tl 以上的超长链脂肪酸。超长链脂肪酸的合成过程主要涉及到的酶有β-酮酰-辅酶A合 酶、β -酮酰-辅酶A还原酶、β -羟酰-辅酶A脱水酶以及烯脂酰-辅酶A还原酶，总称 为脂肪酸延长酶。其中β-酮酰-辅酶A合成酶又称为脂肪酸延长酶1或简称KCS，在超 长链脂肪酸的合成中起主要作用，是该反应的限速酶milar等，Very-long-chain fatty acid biosynthesis is controlled through the expression and specificity of the condensing enzyme. PlantJ，1997，12 (1) :121_131)。其他三种酶的作用几乎微乎其微，因 此KCS酶的活性大小成为制约超长链脂肪酸合成的重要因素。目前许多低芥酸品种的原理 都是通过该酶的突变完成的。Fael基因是β-酮酰-辅酶A合酶(KCS)的编码基因，也是控制芥酸等超长链 月旨肪酸合成的关键基因(Kunst 等，Fatty acid elongation in developing seeds of Arabidopsis thaiiana. Plant Physiol Biochem，1992，30 :425_434)。油菜种子中芥酸含 量的遗传受到胚基因型控制(张洁夫等，甘蓝型油菜芥酸含量的遗传与QTL定位.江苏农 业学报，2008，24(1):22-28)。这可能是因fael基因在发育的胚中特异表达。目前分离得 到的野生型fael基因全长1521个核苷酸，不含内含子，编码506个氨基酸。分子生物学研究证实，油菜中从油酰CoA到芥酸的两步延伸反应分别由El和E2 两个位点上的等位基因控制，这两个位点表现加性效应。通过分析高芥酸油菜(E1E1E2E2) 和低芥酸油菜(elele2e2)分离群体的基因型和芥酸含量，发现elele2e2基因型植株的芥 酸含量< 2%，E1E1E2E2植株的芥酸含量> 40%，ElelE2e2植株的芥酸含量中等。虽然目前对两个基因位点对芥酸含量的贡献率大小仍有争议，但一致认为甘蓝型油菜中有两个 基因位点控制芥酸的合成，且表现加性效应(Fourmann等，The two genes homologous to Arabidopsis FAEl co-segregate with the two loci governing erucic acid content in Brassica napus. Theor Appl Genet, 1998,96 :852_858)。Jourdren等通过数量性状座位QTL方法和RAPD分子标记将E1、E2两个位点 定位至Ij了两个独立的连锁群中(Puyanbert 等，Acyl-CoA elongase expression during seed development in Brassica napus. Biochimica et Biophysica Aeta,2001,1533 141-152)。Fourmarm等通过聚丙烯酞胺凝胶电泳检测fael扩增产物的多态性，定位了两 个fael基因拷贝(Bn-fael. 1和Bn-fael. 2)，这两个基因拷贝与控制芥酸含量的上述两 个QTLs (El和E2)分离。在高芥酸油菜(Gaspard)和低芥酸油菜(ISLR4)中，这两个基 因都转录表达,但Bn-fael. 2的表达水平比Bn-fael. 1低(Fourmann等，The two genes homologous to Arabidopsis Faelco-segregate with the two loci governing erucic acid content in Brassica napus. Theor AppI Gene,1998,96 :852_858)。Barret等利用拟南芥fael的部分序列标记探针，筛选甘蓝型油菜幼胚的cDNA 文库，分离到两个与fael同源的cDNA克隆(CE7和CE8)，CE7和CE8DNA同源性达97%， 氨基酸同源性达98%，定位克隆结果显示CE7与El位点紧密连锁，并调控油菜中芥酸的 含量(Barret 等，A rapeseed FAEI gene is linked to the Ellocus associated with variation in the content of erucic acid. Theor AppI Genet, 1998,96 :177-186)。Han 等从高芥酸油菜品种(Askari)和低芥酸油菜品种(Drakkar)中均分离到了 Bn-fael. 1的 序列，这两条序列同源性很高，有一个不含内含子的连续编码区，都编码507个氨基酸的 蛋白质，其差异在于第282位的氨基酸不同，高芥酸品种中是丝氨酸(Ser)，低芥酸品种中 是苯丙氨酸(Phe) (Han J. X.等· Functional characterization of β-ketoacyl-CoA synthase genes from Brassica napus L. Plant Mol Biol,2001,46 (2) :229_239)。Gupta等人通过实验发现fael. 1和fael. 2分别在高低芥酸油菜中含有4个和3 个单核苷酸位点不同(SNPs)，因此他们提出根据上述SNPs差异既可以通过这7个SNPs来 判断高低芥酸品种，又可以仅通过fael. 1独有的4个SNPs中的前3个位点直接判断，也就 是说如果3个位点中存在el的特征核苷酸，则属低芥酸品种，若无则属高芥酸品种(Gupta ^,Molecular tagging of erueic acid trait in oil seed mustard (Brassica juncea) by QTL mapping and single nucleotide polymorphisms in FAEI gene. Theor AppI Genet, 2004,108 :743_749)。Fael被克隆后，对KCS的酶活性进行了大量研究。利用定点突变，将低芥酸品种 (westar)FAEI蛋白第282位的Phe替换成ser，Kes活胜恢复；而将有活性的FAEI蛋白第 282位的Ser替换成中性氨基酸，包括极性(Cys、Thx、和Gly)和非极性(Ala)的脂肪族氨基 酸，酶的活性并未丧失，而且替换成Cys还使酶的活性提高，因此第282位的ser并不是酶 活性所必须的。利用酵母表达系统，进行定点突变研究，还证实了 CyS223、HiS3oZ、HiS387、 His391和His420都是β -酮酰-CoA合酶的活性位点，这些氨基酸任何一个发生突变都会 导致酶的活性丧失，其中Cys223与酞基链的转移有关，若将Cys223定点突变成Ala，即使 有18 I-CoA底物存在，突变体也不能催化丙二酸单酰-CoA的去羧基反应，从而不能进行缩 合反应(Katavica 等，Gaining insight into the role of serine282 in B. napus FAEIcondensing enzyme. FEBS Letters, 2004, 562 :118_124)。
发明内容
本发明的目的在于获得一种适用于选育具有低芥酸性状的甘蓝型油菜的分子标 记，为甘蓝型油菜低芥酸育种提供一种简单、快速和有效的辅助选育方法。本发明是通过以下方案实现申请人:通过试验获得一种适用于选育具备低芥酸性状的甘蓝型油菜共显性SNP 分子标记，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 7和SEQ ID NO 8所示。制备适用于甘蓝型油菜低芥酸性状的显性SNP分子标记的方法，按照以下步骤利用本申请人设计的引物HY-fael (其DNA序列见实施例1所示)扩增低芥酸甘蓝 型油菜品系甲A254和高芥酸甘蓝型油菜品系4185B-2基因组DNA，得到两个DNA扩增片段， 然后对所述2个DNA扩增片段进行克隆、测序，其中从甲A254中扩增得到如SEQ ID NO=I 和SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列，从4185B-2中扩增得到如SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 4所示的核苷酸序列。与序列表SEQ IDNO :2相比，在序列表SEQ ID NO 1的存在1个单碱基突变(见附 图2)，申请人利用SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2中存在的突变位点845C —845T的单核苷酸 多态性(SNP，Single Nucleotide Polymorphisms)，采用引物3’端错配技术策略(Drenkard 等，A simple procedure for the analysis of single nucleotide polymorphisms facilitates map-based cloning in Arabidopsis. Plant Physiol, 2000124 1483-1492) 设计了引物对YQ-fael-1及YQ-fael-2(其DNA序列见实施例)。与序列表SEQ ID NO 4 相比，在序列表SEQ ID N0:3的第1422-1423bp处存在一个2bp的缺失突变，缺失碱基是 M(见附图3)，申请人根据序列SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4中所示的核苷酸序列差异设计 引物对HD-f ae 1 -1及HD-f ae 1 -2 (其DNA序列见实施例1)。将引物对YQ-f ae 1 -1、YQ-f ae 1 -2、 HD-fael-1和HD-fael-2进行PCR扩增，得到与甘蓝型油菜低芥酸基因连锁的共显性SNP分 子标记(即本发明的目标分子标记)，其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:5、SEQ ID NO :6、 SEQ ID NO 7 和 SEQ ID NO 8 所示。在上述方法中，所用引物对的核苷酸序列如下所示引物对(1)，编号为HY-fael 正向引物5，-CATGCCATGGATGACGTCCGTTAACGTAAAG-3，，反向引物5，-CATGGCTAGCTTAGGACCGACCGTTTTGGAC-3，。引物对(2)编号为YQ-fael-Ι 正向引物 5，-GGGCCGCTATTTTGCTATT-3，，反向引物5，-GTGTTCCCAAGGACTATTTGAC-3，。引物对(3)编号为YQ-fael-2 正向引物5，-GGCCGCTATTTTGCTCAC-3，，反向引物5，-GTGTTCCCAAGGACTATTTGAC-3，。引物对(4)编号为HD-fael-Ι 正向引物5，-GAGACGGAGCAAGTTATC-3，，
反向引物5，-TCCCAAGGACTATTTGGA-3引物对(5)编号为HD-fadl-2 正向引物5，-GAGACGGAGCAAGTTATC-3，，
反向引物 5，-TCCCAAGGACTATTTGTT-3，。其中，引物对HY-fael 用于扩增序列表中 SEQ ID NO =USEQ ID NO :2、SEQ ID NO: 3以及SEQ IDNO :4所示的核苷酸序列；引物对YQ-fael-lJQ-fael-2分别用于扩增序列表 中SEQ ID NO 5和SEQ IDNO 6所示的核苷酸序列；引物对HD-fael-1、HD-fael-2分别用 于扩增序列表中SEQ ID NO 7和SEQ IDNO 8所示的核苷酸序列。本发明的积极效果本发明采用引物3’端错配策略应用于甘蓝型油菜SNP多态性标记的开发和检测； 利用正向引物和反向引物同时错配手段在异源多倍体作物甘蓝型油菜中开发出基于PCR 扩增和琼脂糖凝胶电泳SNP标记。本发明成功得到甘蓝型油菜低芥酸的共显性SNP分子标 记，运用该标记在低芥麻酸甘蓝型油菜的辅助选择中可以克服传统育种中依靠表型进行选 择的缺点，减少育种工作量，缩短育种年限，加快了甘蓝型油菜低芥酸育种的进程。更详细的技术方案参见《具体实施方式
》。
序列表SEQ ID NO :1_4是本发明扩增的低芥酸甘蓝型油菜品系甲A254和高芥酸 甘蓝型油菜品系4185B-2基因组DNA的基因组DNA获得的4个DNA片段(核苷酸序列)。序列表SEQ ID NO :5_8是本发明制备的甘蓝型油菜芥酸含量分子标记的核苷酸序 列。序列表SEQ ID NO :9_18是本发明制备的甘蓝型油菜芥酸含量分子标记的引物对 序列。图1 利用引物对HY-fael在甘蓝型油菜品系甲A254和4185B-2以及F1的基因 组DNA中的扩增结果。图中=P1代表4185B-2 ;P2代表甲A254 A代表4185B-2X甲A254 ； M 代表 DNA marker (片段大小依次为 3000，2600，2050，1650，1000, 700，500 和 278bp)。图2 利用引物对HY-fael在甘蓝型油菜品系甲A254和4185B-2基因组中的扩增 的DNA片段序列比对，图中:N0_1、N0_2分别代表序列表中SEQ ID NO :1禾口 SEQ ID NO 2的 序列，实心黑三角形“▲”表示序列的第845C — 845T的单碱基突变，设计的引物位置(即 引物对YQ-fael-1、YQ-fael-2的正向引物位置)参见下划线处，空心三角形“▽，，表示引物 设计错配碱基。图3 利用引物对HY-fael在甘蓝型油菜品系甲A254和4185B-2基因组中的扩增 的DNA片段序列比对，图中:N0_3、N0_4分别代表序列表中SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4的 序列，实心黑三角形“▲”表示序列的第1422-1423bp的AA缺失突变，设计的引物位置(即 引物对YQ-fael-1、YQ-fael-2的正向引物位置)参见下划线处。图4 利用引物对HY-fael在甘蓝型油菜品系甲A254和4185B-2基因组中的扩增 的DNA片段序列比对，图中N0_1、N0_2、N0_3、N0_4分别代表序列表中SEQ ID NO :1、SEQ ID N0:2、SEQ ID NO :3和SEQ IDNO :4的序列，实心黑三角形“▲”表示引物对HY-fael、 HD-fael在同一亲本中扩增的甘蓝型油菜fael基因的不同拷贝之间的单碱基差异；Pri. 1
6代表引物对YQ-fael-1、YQ-fael-2的反向引物，Pri. 2代表引物对HD-fael-l、HD-fael-2 的正向引物，设计的引物位置参见下划线处，箭头代表引物方向，空心三角形“V”表示引物 设计错配碱基。图5 本发明获得的引物 YQ-fael-1、YQ-fael-2, HD-fael-l 和 HD-fael-2 在甘蓝 型油菜品系甲A254、4185B-2、F1以及利用(4185B-2X甲A254)F2群体的部分单株检测结 果。图中=P1代表4185B-2 ;P2代表甲A254 A代表4185B-2X甲A254 ； 1-19代表F2群体 中不同芥酸含量单株(图中正下方数值为单株芥酸含量，单位％)；片段长度为所述引物 扩增产物长度。图6 是本发明的技术流程图。
具体实施例方式实施例11、制备F1代杂交种和建立F2群体在本实施例中，以本申请人选育的低芥酸含量(芥酸含量为2. 74% )的甘蓝型油 菜品系甲A254(该材料的种子已于2009年11月20日送交湖北省武汉市武汉大学内的中 国典型培养物保藏中心保藏，其保藏号为CCTCC-P200909)为父本，以高芥酸含量(芥酸含 量为47. 76% )甘蓝型油菜品系4185B-2(该材料的种子已于2009年11月20日送交湖北 省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏号为CCTCC-P200907，该材料 在本发明的在前专利申请(2009年11月25日提交的说明书中已经公开)其专利申请号为 200910272868. 6，
发明者周永明, 杨庆勇, 淮东欣 申请人:华中农业大学