倍半萜烯合成酶及其使用方法

专利名称：倍半萜烯合成酶及其使用方法
技术领域：
本申请涉及倍半萜烯合成酶及其制备和使用方法。一个实施方案中，本发明提供 了含有本申请所述核苷酸序列的核酸，该核苷酸序列编码至少一种倍半萜烯合成酶。另一 实施方案中，本发明还提供了倍半萜烯合成酶及其制备和使用方法。例如，本发明的倍半 萜烯合成酶可用于将法呢基焦磷酸酯转化为各种氧化的和脂肪族倍半萜烯，包括朱栾倍半 萜、二环_吉马烯、荜澄茄醇和S-杜松烯。
背景技术：
萜烯化合物是一大类结构差异很大的天然分子。植物界中有最为多样性的单萜和 倍半萜烯。通常它们在植物抵抗病虫害及草食动物以及吸引授粉昆虫方面发挥作用。萜烯的生物合成已经在很多种生物体内进行了广泛的研究。萜烯的常见前体为焦 磷酸异戊烯酯(IPP)，催化产生IPP步骤的酶大多数已经研究清楚。IPP生物合成的两个不 同途径现已清楚(图1)。甲羟戊酸酯途径发现于植物细胞液和酵母中，而非-甲羟戊酸酯 途径(或脱氧木酮糖-5-磷酸(DXP)途径发现于植物质体和大肠杆菌中。例如，IPP在IPP异构酶作用下异构化为二甲基烯丙基二磷酸酯，可用异戊烯基转 移酶将这两种C5化合物缩合生成每一类萜烯的脂肪族焦磷酸酯萜烯前体，即对于单萜而 言是栊牛儿基焦磷酸酯(GPP)，对于倍半萜烯而言是法呢基焦磷酸酯(FPP)，对于二萜烯为 栊牛儿基栊牛儿基焦磷酸酯(GGPP)(图2)。催化脂肪族前体环化步骤的酶命名为萜烯环化 酶或萜烯合成酶，在本申请中称之为萜烯合成酶。这些酶还能够催化复合体多步骤环化形成萜烯或倍半萜烯化合物的碳骨架。例 如，催化环化的起始步骤可以是二磷酸酯基团的离子化形成烯丙基阳离子。然后，该底物 进行异构和重排，这些反应可以通过酶活性位点控制。产物可以是，例如非环、单、二或 三-环。然后，质子从碳正离子释放出来或者碳正离子与水分子反应，释放出萜烯烃或醇。 一些萜烯合成酶产生单一产物，但是大部分产生多种产物。自然界中发现了很多种的萜烯结构和倍半萜烯合成酶。现已从不同的植物来源克 隆和定性了几种编码cDNA或基因的倍半萜烯合成酶，例如，源自烟草(Facchini，P. J. and Chappel 1, J. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89，11088-11092.)和辣椒(Back，K.，et al. (1998) Plant Cell Physio. 39 (9)，899-904.)的 5-表-马兜铃烯(aristolochene)合成 酶，源自 Hyoscyamus muticus 的 vetispiradiene 合成酶(Back,K. and Chappe 11, J. (1995) J. Biol. Chem. 270 (13)，7375-7381.)，源自欧薄荷的(E) - β -金合欢烯合成酶(Crock, J.，
3et al. (1997)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. 94(24) ,12833-12838.)，源自北美冷杉的 δ-芹 子烯合成酶和 Y-潷草烯合成酶(Steele，C. L.，et al. (1998) J. Biol. Chem. 273(4), 2078-2089.)，源自亚洲棉的 δ -杜松烯合成酶(Chen, X. Y.，et al. (1995)Arch. Biochem. Biophys. 324 (2), 255-266 ；Chen, X. Y. , et al. (1996) J. Nat Prod. 59，944—951.)，源自 北美冷杉的 E- α -没药烯合成酶(Bohlmann，J.，et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 95 (12)，6756-6761.)，源自番茄的吉马烯 C 合成酶(Colby, S. Μ.，et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 95 (5)，2216-2221.)，源自黄花蒿的表-雪松醇合成酶和紫 H It -4，11- 二 ☆ @ _ (Mercke, P. ， et al. (1999) Arch. Biochem. Biophys. 369(2)， 213-222 ；Mercke, P.，et al. (2000)Arch. Biochem. Biophys. 381(2)，173-180.)，以及 源自莴苣、菊苣和加拿大一枝黄花的吉马烯A合成酶(Bennett，Μ. H.，et al. (2002) Phytochem. 60,255-261 ；Bouwmeester, H. J. , et al. (2002)Plant Physiol. 129(1), 134-144 ；Prosser I，et al. (2002)Phytochem. 60，691-702)。很多倍半萜烯化合物被用于香料(例如，广藿香醇(patchoulol)，诺卡酮，檀香 醇，韦惕酮，甜橙醛)，且很多提取自植物。因此，它们的产量和价格取决于植物来源的波动 以及主产国的稳定性。因此，人们希望获得非植物依赖性的倍半萜烯生产系统。由于一些 倍半萜烯结构的复杂性，所以其化学合成的造价往往让人难以接受。

发明内容
一个实施方案中，本发明涉及编码倍半萜烯合成酶的分离的核酸。本申请中的倍 半萜烯合成酶还可以根据该酶与脂肪族焦磷酸酯萜烯前体例如法呢基焦磷酸酯接触时产 生的至少一种化合物来命名。例如，能生成二环吉马烯作为其一种产物的倍半萜烯合成酶 可称为二环吉马烯合成酶。按照这一惯例，本发明核酸的实例包括编码荜澄茄醇合成酶 (GFTpsC) (SEQ ID NO 1) ； δ -杜松烯合成酶(GFTpsE) (SEQ ID NO 2) ；二环吉马烯合成酶 (GFTpsB) (SEQ ID NO 3)；朱栾倍半萜合成酶(GFTpsDl&GFTpsD2) (SEQ ID NO :4&SEQ ID NO 5)的 cDNAo在一个实施方案中，本发明提供了一种分离的核酸，该核酸选自(a)含有基本上 如 SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO 9 或 SEQ ID NO 10 所示核苷酸 序列的核酸；(b)编码基本上如 SEQ ID NO =USEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4 或 SEQ ID NO :5所示多肽的核酸；以及(c)能够在低度严谨条件下与(a)或(b)中核酸杂交 的核酸，其中由所述核酸编码的多肽是倍半萜烯合成酶。在一个实施方案中，定义的条件为 中度严谨条件，另一个实施方案中为高度严谨条件。其他实施方案包括本发明核酸编码的 多肽；含有本发明核酸的宿主细胞；经修饰含有本发明核酸的非人生物体；以及制备多肽 的方法，其中包括培养本发明的宿主细胞。在另一个实施方案中，本发明提供了一种分离的多肽，其含有基本如SEQ ID N0 USEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID NO :4 或 SEQ ID NO :5 所示的氨基酸序列。在另一个实施方案中，本发明提供了一种含有至少一种核酸的载体，该核酸选自 (a)含有基本上如 SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO 9 或 SEQ ID NO 10所示核苷酸序列的核酸；(b)编码基本上如SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、 SEQ ID NO :4或SEQ ID NO :5所示多肽的核酸；以及(c)能够在低度严谨条件下与(a)或
4(b)中核酸杂交的核酸，其中由所述核酸编码的多肽是倍半萜烯合成酶。其他实施方案包 括，制备重组宿主细胞的方法，其中包括将本发明载体导入宿主细胞。在一个实施方案中，本发明提供了一种制备至少一种倍半萜烯合成酶的方法，该 方法包括将经修饰以含有至少一种核酸序列的宿主在能够产生所述至少一种倍半萜烯合 成酶的条件下培养。在一个实施方案中，所述的至少一种核酸选自(a)含有基本上如SEQ ID N0:6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9 或 SEQ ID NO : 10 所示核苷酸序列的核 酸；(b)编码基本上如 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 4 或 SEQ ID NO :5所示多肽的核酸；以及(c)能够在低度严谨条件下与(a)或(b)中核酸杂交的核酸， 其中由所述核酸编码的多肽是倍半萜烯合成酶。所述宿主可选自，例如，植物、微生物、菌体 细胞、酵母细胞、植物细胞和动物细胞。在另一个实施方案中，本发明提供了一种制备至少一种萜类化合物的方法，该方 法包括1)让至少一种脂肪族焦磷酸酯萜烯前体与由核酸编码的至少一种多肽接触，在一 个实施方案中，所述核酸选自(a)含有基本上如SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO 8,SEQ ID NO :9或SEQ ID NO 10所示核苷酸序列的核酸；(b)编码基本上如SEQ ID NO :1、 SEQ ID N0:2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4 或 SEQ ID NO :5 所示多肽的核酸；以及(c)能够 在低度严谨条件下与(a)或(b)中核酸杂交的核酸，其中由所述核酸编码的多肽是倍半萜 烯合成酶，2)分离(1)中制备的至少一种萜类化合物。在一个实施方案中，所述至少一种萜 类化合物选自倍半萜烯。在另一个实施方案中，所述至少一种脂肪族焦磷酸酯萜烯前体为 法呢基焦磷酸酯。本发明方法制备的倍半萜烯包括，但不限于，二环吉马烯、荜澄茄醇、朱栾 倍半萜、α-荜澄茄油烯、吉马烯D和δ-杜松烯(图3)。应该理解的是上面的概述和下面的详述都只是例举和解释性的，而并不是对本发 明的限制。现在对本发明的范例性实施方案进行详述。


图1 焦磷酸异戊烯酯生物合成途径的实例(甲羟戊酸酯途径(A)和脱氧木酮糖 途径(B))。图2 由焦磷酸异戊烯酯生物合成萜烯的实例。图3 倍半萜烯化合物实例的结构。图4 两组倍半萜烯合成酶的氨基酸序列比对的中间部分(番茄的吉马烯C δ -杜 松烯合成酶(SEQ ID NO=Il)；欧薄荷的(Ε)-β-金合欢烯(SEQ ID Ν0 12)；北美冷杉的 S-芹子烯(SEQ ID NO 13)；香橙(citrus junos)的倍半萜烯合成酶(SEQ ID NO 14)； 烟草的5-表-马兜铃烯(SEQ ID NO 15)；辣椒的5-表-马兜铃烯(SEQ ID NO 16)；马铃 薯的 Vetispiradiene (SEQ ID NO 17) ；H. muticus 的 Vetispiradiene (SEQ ID N0:18)；亚 洲棉的S-杜松烯(SEQ ID NO 19)；黄花蒿的紫穗槐_4，11-二烯(SEQ ID NO 20)；黄花 蒿的表-雪松醇(SEQ ID NO 21)；北美冷杉的δ-潷草烯(SEQ ID Ν0:22))以及推导的简 并引物的序列(TpsVFl (SEQ ID NO :23)、TpsVF2 (SEQ ID NO :24)、TpsVR3 (SEQ ID NO 25)； TpsCFl (SEQ ID NO :26)、TpsCF2 (SEQ ID NO :27)、TpsCR3 (SEQ ID N0:28))。每一比对列下 面的箭头表示用于设计简并引物及其方向的比对区域。图5 柚子总RNA RT-PCR扩增产物推导出的氨基酸序列比对(GFTpsA (SEQ ID NO 29)、GFTpsB(SEQ ID NO 30)和 GFTpsC(SEQID N0:31))。图6:源自葡萄柚的倍半萜烯合成酶GFTpsA(部分克隆)(SEQ ID NO 32), GFTpsB(SEQ ID NO 3), GFTbsC(SEQ ID NO 1), GFTpsDl(SEQ ID NO 4), GFTpsD2(SEQ ID NO 5)和GFTpsE (SEQ ID NO 2)的氨基酸序列比对。图7 由重组柚子倍半萜烯合成酶制备的倍半萜烯的GC谱。图 8 (a)GFTpsA(SEQ ID NO 32 禾口 SEQ ID NO :33)、(b)GFTpsB (SEQ ID NO :3 禾口 SEQ ID NO :8)、(c) GFTbsC (SEQ ID N0:liPSEQ ID NO :6)、(d) GFTpsDl (SEQ ID NO :4 禾口 SEQ ID NO :9)、(e)GFTpsD2(SEQ ID NO 5 禾口 SEQ ID NO 10)以及(f) GFTpsE (SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO 7)的氨基酸及核苷酸序列。
具体实施例方式萜烯是含有异戊二烯单元(C5H8)的不饱和烃，可以是脂肪族或环状。萜烯衍生 物，包括但不限于樟脑、薄荷醇、萜品醇和莰醇、香叶醇。本申请中的萜烯或萜类化合物包 括萜烯和萜烯衍生物，包括经过一个或多个步骤功能化的化合物，例如羟基化、异构化、氧 化_还原或酰化作用。在本申请中，倍半萜烯是具有C15结构的萜烯，包括倍半萜烯和倍半 萜烯衍生物，包括经过一个或多个步骤功能化的化合物，例如羟基化、异构化、氧化-还原 或酰化作用。本申请中，衍生物是指获自已知或假定化合物且含有亲体结构基本单元的任一化 合物。本申请中，倍半萜烯合成酶是任一种能催化倍半萜烯合成的酶。“等同”、“基本上等同”或“基本如所示”这些词是指相关序列与给定序列之间 具有至少 70%、75%、80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或 99% 的同一性。例 如，所述序列可以是等位变体、来自不同物种的序列，或者它们可以是从给定序列通过截 短、缺失、氨基酸取代或添加得到的。就多肽而言，比对序列的长度通常为至少20、30、50、 100或更多个氨基酸。就核酸而言，比对序列的长度通常为至少50、100、150、300或更多 个核苷酸。两序列之间的同一性百分比可以通过常规对齐算法得到，例如，Altschul et al. (1990)J. Mol. Biol.，215 :403-410 中所述的 Basic Local Alignment Tool (BLAST)、 Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol.，48 :444_453 中的算法、或者 Meyers et al. (1988) Comput. Appl.Biosci.，4 11-17 中的算法。因此，在一个实施方案中，本发明提供了一种分离的核酸，该核酸选自(a)含有 基本上如 SEQ ID N0:6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9 或 SEQ ID N0:10 所示核 苷酸序列的核酸；(b)编码基本上如 SEQ ID NO =USEQ ID NO :2、SEQ IDNO :3、SEQ ID NO 4或SEQ ID NO :5所示多肽的核酸；以及(c)能够在低度严谨条件下与(a)或(b)中核酸 杂交的核酸，其中由所述核酸编码的多肽是倍半萜烯合成酶。在一个实施方案中，定义的条 件为中度严谨条件，另一个实施方案中为高度严谨条件。本申请中，本领域技术人员可以利用本申请实施例中描述的酶特性试验(enzyme characterization assay)测定本发明核酸编码的多肽是否是倍半萜烯合成酶。本申请中，杂交或在特定条件下杂交是用来描述杂交条件，在该条件下相互基本 等同或同源的核苷酸序列在洗涤后仍然保持彼此结合。所述条件可以是具有至少约70%，
6例如至少约80%，以及例如至少约85-90%同一性的序列仍然保持彼此结合。本发明中提 供了低度、中度和高度严谨条件的定义。本领域技术人员可以根据 Ausubel et al. (1995), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley&Sons，一书第 2、4 和 6 章中例举的最小限度试验(minimal experimentation)选择合适的杂交条件。另夕卜，还有 Sambrook et al. (1989)Molecular Cloning :A Laboratory Manual, 2nd ed. , Cold Spring Harbor Press,第 7、9 禾口 11 章中描 述的严谨条件。本申请中的低度严谨条件如下所述。将含有DNA的滤膜40°C下在含下列 物质的溶液中预处理 6 小时:35% 甲酰胺，5xSSC，50mMTris-HCI(pH7. 5)，5mM EDTA，0. 1% PVP,0. 1% Ficolia % BSA, ^P 500 μ g/ml变性的鲑鱼精子DNA0杂交在相同溶液中进行， 除下列改动外0. 02% PVP,0. 02% Ficoll,0. 2% BSA，100 μ g/ml 鲑鱼精子 DNA，10% (wt/ vol)葡聚糖硫酸酯，使用5-20xl06 32P-标记探针。将滤膜在杂交混合液中40°C下孵育 18-20 小时，然后 55°C下用含有 2xSSC，25mM Tris-HCI (pH7. 4), 5mM EDTA禾口 0· SDS 的溶 液洗涤1.5小时。用新鲜溶液取代洗涤溶液，60°C下再孵育1.5小时。滤膜进行印迹干燥 并进行放射自显影。本申请中定义的中度严谨条件如下所述。将含有DNA的滤膜50°C下在含下列物质 的溶液中预处理 7 小时:35% 甲酰胺，5xSSC，50mM Tris-HCI (pH7. 5), 5mM EDTA，0. 1% PVP, 0. l%Ficoll，l%BSA，和500 μ g/ml变性的鲑鱼精子DNA。杂交在相同溶液中进行，除下列 改动外0· 02% PVP, 0. 02% Ficoll, 0. 2% BSA, 100 μ g/ml 鲑鱼精子 DNA，10% (wt/vol)葡 聚糖硫酸酯，使用5-20xl06 32P-标记探针。将滤膜在杂交混合液中50°C下孵育30小时，然 后 55°C下用含有 2xSSC，25mM Tris-HCI (pH7. 4), 5mM EDTA 和 0. 1% SDS 的溶液洗涤 1. 5 小 时。用新鲜溶液取代洗涤溶液，60°C下再孵育1.5小时。滤膜进行印迹干燥并进行放射自 显影。本申请中定义的高度严谨条件如下所述。将含有DNA的滤膜65°C下在由下列物 质组成的缓冲液中预杂交8小时至过夜:6xSSC,50mM Tris-HCI (ρΗ7· 5)，ImM EDTA，0. 02% PVP，0· 02% Ficoll,0. 02% BSA和500 μ g/ml变性的鲑鱼精子DNA。将滤膜在65°C下在含 100 μ g/ml变性鲑鱼精子DNA和5_20χ106 32P-标记探针的预杂交混合液中预杂交48小时。 将滤膜在37°C下用含有2xSSC，0. 01% PVP,0. 01% Ficoll和0. 01% BSA的溶液洗涤1小 时。然后再用0. IxSSC在50°C下洗涤45分钟。如果上面给出的条件不合适(例如，当用于种间杂交时)，还可以选用本领域已知 的其他低度、中度和高度严谨条件(例如，当用于种间杂交时)。在一个实施方案中，本发明所述核酸和/或多肽分离自柑桔类植物，例如柚子或 橙子。在一个具体实施方案中，本发明涉及特定的分离的核苷酸序列，包括那些基本上不含 内源性污染物质的核苷酸序列。术语“核酸”或“核酸分子”是指单链或双链形式的脱氧核糖 核酸或核糖核酸多聚体，除另有说明外，其中还包括与天然生成核苷酸具有类似功能的天 然核苷酸的已知类似物。“核苷酸序列”还指以单个片段或作为更大核酸组分形式存在的多 核苷酸分子或寡核苷酸分子。所述核苷酸序列或分子还被称为“核苷酸探针”。本发明中的 一些核酸分子源自分离的DNA或RNA，这些分离的DNA或RNA至少一度曾以基本纯化形式存 在，其量或浓度足以保证能够用常规生化方法对其组分核苷酸序列进行鉴定、扩增和回收。 这些方法的实例，包括本申请中PCR方案所使用的方法，参见Sambrook et al. ,MolecularCloning :A Laboratory Manual,2nd ed. ,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor，NY(1989)，Current Protocols in Molecular B iology edited by F. A. Ausubel et al.，John Wiley and Sons，Inc. (1987)，禾口 Innis，M. et al.，eds.，PCR Protocols :A Guide to Methods and Applications，Academic Press (1990)。在本申请中，本发明所述核酸分子包括单链和双链形式的DNA及其RNA互补链。 DNA包括，例如，cDNA、基因组DNA、化学合成DNA、PCR扩增的DNA及其组合。基因组DNA包括 翻译区、非翻译区及调控区，可以用常规技术来分离，例如使用本发明的任一种cDNA或其 合适的片段作为探针对一段基因组DNA进行鉴定，然后可以使用本领域常规方法克隆该基 因组DNA。通常，本发明范围内的核酸分子包括在上述杂交和洗涤条件下能够与本发明所 述序列杂交的序列，比本发明所述序列DNA双螺旋熔融温度低5°C、10°C、15°C、2(TC、25°C 或30°C的序列，包括被这些范围囊括在内的任意范围的条件。在另一个实施方案中，本发明所述核酸包括基本如SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、 SEQ ID N0:8、SEQ ID NO :9，或SEQ ID N0:10所示的序列。在一个实施方案中，所述核酸 与 SEQ ID N0:6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9 或 SEQ ID N0:10 所示核苷酸之 间具有至少85%、至少90%或至少95%的同一性。在一个实施方案中，所述核酸包含SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO 9 或 SEQ ID NO 10 所示的核苷酸序列。 在另一个实施方案中，所述核酸编码一种蛋白质，该蛋白质是一种倍半萜烯合成酶，如实施 例部分酶测定中所述。本发明还提供了含有不同物种间保守区域的核酸。在另一实施方案中，所述核酸包含由SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、 SEQ ID NO :9或SEQ ID NO :10中的至少50、100、250、500或750个连续核苷酸组成的连 续片段。所述的这些核苷酸的连续片段还包括至少1处突变，只要突变体序列仍然保留原 序列的功能，仍然能够与这些核苷酸在低或高度严谨条件下杂交，例如，中度或高度严谨条 件。所述片段可以源自，例如，SEQ ID N0:6、SEQ ID NO :7、SEQ ID N0:8、SEQ ID NO :9 或 SEQ ID NO 10 中的第 200-1600 位核苷酸(nt)、第 800-1600 位 nt、第 1000-1600 位 nt、第 200-1000 位 nt、第 200-800 位 nt、第 400-1600 位 nt 或第 400-1000 位 nt。如上所述，由本发明所述核酸编码的多肽也在本发明范围之内。本发明所述的分 离的核酸可选自编码基本如SEQ ID NO 1, SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4或 SEQ ID NO :5所示多肽的核酸。在一个实施方案中，所述多肽与SEQ ID NO =USEQ ID N0:
2、SEQID N0:3、SEQ ID NO :4 或 SEQ ID NO :5 之间具有至少 85%、至少 90%或至少 95% 的序列同一性。在一个实施方案中，本发明的多肽含有SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO
3、SEQID NO :4或SEQ ID NO :5所示的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述多肽含有 基本如 SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID NO :4 或 SEQ ID NO :5 所示的氨 基酸序列。另一个实施方案中，所述多肽含有与SEQ ID NO 1, SEQ ID NO :2、SEQ ID N0: 3、SEQ ID NO :4或SEQ ID NO :5所示氨基酸序列间具有至少85%、至少90%或至少95% 序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述多肽是一种倍半萜烯合成酶，如下面实 施例部分酶测定中所述。由于遗传密码子的简并性，能够编码同一氨基酸的密码子不止一个，所以多个DNA 序列能编码同一多肽。这些变体DNA序列可以获自遗传漂变或人工操作(例如，发生于PCR
8扩增过程中或者作为天然序列目的诱变(deliberate mutagenesis)的产物)。因此，本发 明包括能够编码源自 SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO 9 或 SEQ ID NO 10蛋白质的任一核酸或其变体。天然序列的目的诱变可以用本领域已知的许多种技术完成。例如，可以使用寡 核苷酸_定点-特异性诱变方法，特别是在期望使基因突变从而通过取代、缺失或插入使 预定限制性位点的核苷酸或密码子变化的情况下。进行所述变化的方法的实例见Walder et al. (Gene 42 133,1986) ；Bauer et al. (Gene 37:73,1985) ；Craik(BioTechniques, January 12-19,1985) ；Smith et al. (Genetic Engineering Principles and Methods, Plenum Press, 1981) ；Kunkel (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488,1985) ；Kunkel et al. (Methods in Enzymol. 154 :367,1987)；和美国专利 US4, 518，584 和 US4, 737，462。在一个实施方案中，本发明提供了分离的多肽。本申请中的“多肽”是指一类多肽 或肽片段，其中含有本申请鉴定出的氨基酸序列，以及更小的片段。替代地，可以根据多肽 与本发明核酸序列编码的任一肽之间的抗原性相关程度来对该多肽进行定义。因此，在一 个实施方案中，本发明范围内的多肽定义为其中含有与本发明核酸序列编码的任一肽相同 线性或三维表位的氨基酸序列。替代地，本发明范围内的多肽是能够被具有下述特性的抗 体识别的，即该抗体能够特异性识别本发明核酸序列编码的任意一种肽。如果抗体与本发 明多肽结合时的Ka值大于或等于约Ι ΛΓ1，例如大于或等于IO8M4,那么就将该抗体定义为 特异性结合。本申请中的多肽“变体”是指基本上与天然多肽同源的多肽，但是其氨基酸序列因 为一处或多处缺失、插入或取代而不同于本发明任一核酸所编码的多肽。变体可以包括保守取代序列，即一特定氨基酸残基被一具有类似理化特性的残基 所取代。保守取代的实例包括用一个脂肪族残基取代另一个脂肪族残基，例如，Ile、Val、 Leu或Ala之间相互取代，或者用一个极性残基取代另一个极性残基，例如在Lys和Arg; Glu和 Asp ；或Gln和 Asn之间相互取代。参见，Zubay，Biochemistry，Addison-Wesley Pub. Co.，(1983)。这类取代的效果可以用取代打分矩阵(substitution score matrices)来计 算，如 Altschul，(J. Mol.Biol. 219 :555_65，1991)中所述的 PAM-120、PAM_200 和 PAM-250。 其他这类保守取代，例如具有近似疏水特性的完整区域的取代，已为本领域熟知。天然生成的肽变体也在本发明范围之内。这种变体的实例是本申请所述多肽由于 改变mRNA剪接事件或者蛋白水解切割得到的蛋白质。蛋白水解引起的变化包括，例如，在 不同类型宿主细胞中表达时，本发明序列编码的多肽由于蛋白水解除去了一个或多个末端 氨基酸而导致N-或C-末端的差异。本发明倍半萜烯合成酶的变体可以用于实现酶促活性的增强或减弱，区域化学 (regiochemistry)或立体化学的变化，或者底物利用或者产物分配的改变。可以用本领域 已知的任一方法得到变体或实现定点诱变。如上所述，本发明提供了重组及非重组、分离且纯化的多肽，例如从柑桔类植物。 天然多肽的变体及衍生物可以通过下列方法得到从其他或同一植物品系或品种中分离天 然生成的变体或变体的核苷酸序列，或者对编码天然柑桔多肽的核苷酸序列的突变进行人 工设计。改变天然氨基酸序列可以用许多种常规方法中的任一种来完成。可以通过下述方 法将突变导入特定位置合成含有突变序列的寡核苷酸，与限制性酶切位点侧接以能够与天然序列的片段连接。连接后，得到的重构序列编码含有预期的氨基酸插入、取代或缺失的 类似物。替代地，可以使用寡核苷酸-定点-特异性诱变方法提供一种经过改变的基因，其 中预定的密码子因取代、缺失或插入而改变。在一个实施方案中，本发明涉及含有本发明所述核酸的载体。例如，含有至少一 种选自下列核酸的载体(a)含有基本上如SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID NO :9或SEQ ID NO : 10所示核苷酸序列的核酸；(b)编码基本上如SEQ ID NO =USEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 4或SEQ ID NO 5所示多肽的核酸；以及(c)能够在低度 严谨条件下与(a)或(b)中核酸杂交的核酸，其中由所述核酸编码的多肽是倍半萜烯合成 酶。本发明使用的载体包括任一种重组载体，包括但不限于病毒载体、噬菌体及质粒。含有本发明所述核酸序列的重组载体可以用熟知的方法制备。在一个实施方案 中，所述表达载体中含有编码多肽的cDNA序列，该cDNA序列可操作地连接有合适的转录或 翻译调控核苷酸序列，例如源自哺乳动物、细菌、病毒或昆虫基因的调控序列。调控序列的 实例包括转录启动子、操纵子、或增强子，mRNA核糖体结合位点、以及调控转录及翻译起始 和终止的合适序列。当调控序列与本发明的cDNA序列功能性相连时那么核苷酸序列就是 “可操作地连接”。因此，如果一启动子核苷酸序列能够调控cDNA序列的转录，那么该启动 子序列就是可操作地连接于该cDNA序列。此外还可以向表达载体中引入在预期宿主细胞 中的复制能力和选择基因，所述复制能力通常由复制起点赋予，选择基因可以是转化株得 以通过其鉴定的那些。此外，还可以向表达载体引入信号肽编码序列，天然状态下该信号肽与本发明多 肽并不相连。例如，可以将编码信号肽(分泌前导肽)的DNA序列与本发明的核苷酸序列 融合在同一阅读框内从而使得本发明的多肽最初翻译为含有信号肽的融合蛋白。在预期宿 主细胞中发挥作用的信号肽可以增进所表达多肽的胞外分泌。可在分泌离开细胞时将信号 肽从多肽上切除。可以在本发明多肽的氨基及羧基端融合其他的肽序列，用以提高多肽的表达或者 促进蛋白质的纯化。在一个实施方案中，本发明包括含有本发明所述核酸的宿主细胞。本发明的另一 实施方案是一种制备重组宿主细胞的方法，该方法包括将本发明载体导入宿主细胞。在另 一个实施方案中，提供了制备多肽的方法，该方法包括将本发明宿主细胞培养于能够产生 多肽的条件下。一个实施方案中，对所述多肽进行回收。本发明所述方法包括制备至少一 种本发明所述倍半萜烯合成酶的方法，该方法包括培养含有本发明所述核酸的宿主细胞， 然后回收积聚的倍半萜烯合成酶。适于表达本发明多肽的宿主细胞包括原核细胞、酵母或高等真核细胞。适用于细 菌、真菌、酵母及哺乳动物细胞宿主的克隆和表达载体的描述参见，例如，Pouwels et al., Cloning Vectors :A Laboratory Manual, Elsevier, New York, (1985)。另夕卜还可以米用 无细胞翻译系统，用源自本发明所述DNA构建体的RNA制备公开的多肽。原核细胞包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如，大肠杆菌或杆菌。适于转化 的原核细胞包括，例如，大肠杆菌、枯草杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和假单胞属的其他菌种、链霉 菌、以及葡萄球菌。原核宿主细胞中，例如大肠杆菌中，所述多肽可以含有有助于重组多肽
10在原核细胞中表达的N-末端甲硫氨酸残基。可以将N-末端甲硫氨酸残基从表达的重组多 肽上切除。适用于原核宿主细胞的表达载体的实例包括从可商购的质粒如克隆载体pET质 粒(Novagen, Madison, WI, USA)或 pBR322 (ATCC37017)得到的载体。pBR322 中含有氨节 青霉素及四环素抗性基因，因而提供了鉴定转化细胞的便捷方法。就使用PBR322构建表达 载体而言，可以将合适的启动子和编码一种或多种本发明所述多肽的DNA序列插入pBR322 载体。其他可商购的载体包括，例如，PKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden)禾口 pGEM-1 (Promega Biotec，Madison，WI，USA)。其他可商购的载体包括为蛋白表 达专门设计的载体；这些载体包括用于与麦芽糖结合蛋白融合的蛋白质表达的pMAL-p2和 pMAL-c2 载体(New England Biolabs, Beverly, MA, USA)。重组原核宿主细胞表达载体常用的启动子序列包括细菌噬菌体Τ7启动子 (Studier F. W. and Moffatt B. Α.，J. Mol. Biol. 189 :113，1986)、β-内酰胺酶(青霉素 酶)、乳糖启动子系统(Chang et al.，Nature 275 :615，1978 ；和 Goeddel et al.，Nature 281 :544，1979)、色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel et al.，Nucl. Acids Res. 8 :4057， 1980 ；禾口 EP-A-36776)、以及 tac 启动子(Maniatis, MoLecular Cloning :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, p. 412，1982)。一种特别有用的原核宿主细胞 表达系统使用λ噬菌体PL启动子和cl857ts热敏感抑制序列(thermolabile repressor sequence)。可从美国典型培养物保藏中心(“ATCC “)获得的其中引入PL启动子衍生物 的质粒载体，包括质粒PHUB2 (存在于大肠杆菌JMB9菌株(ATCC 37092))和pPLc28 (存在 于大肠杆菌RRl菌株(ATCC 53082))。另外还可以将本发明所述多肽表达于酵母宿主细胞、优选来自酵母属(例如，酿 酒酵母)。其他酵母属也可使用，例如毕赤酵母属或克鲁维酵母属(例如，乳酸克鲁维酵 母)。酵母载体通常含有来自2μ酵母质粒复制序列起点、自主复制序列(ARS)、启动子区 域、聚腺苷酸化用序列、转录终止序列和可筛选标志基因。其中适于酵母载体的合适启动子 包括，例如，金属硫蛋白、3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman et al.，J. Biol. Chem. 255 =2073, 1980)的启动子，或其它糖酵解酶的启动子(Hess et al. , J. Adv. Enzyme Reg. 7 :149，1968 ； 和Holland et al.，Biochem. 17 :4900，1978)，例如烯醇化酶，甘油酸_3_磷酸脱氢酶、己 糖激酶、丙酮酸脱羧酶、果糖磷酸激酶、葡糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸 激酶、丙糖磷酸异构酶、葡糖磷酸异构酶和葡糖激酶。其他适于酵母表达的载体和启动子的 描述参见 Hitzeman，EPA-73，657 或 Fleer et. al.，Gene, 107 285-195 (1991)；和 van den Berg et. al.，Bio/Technology, 8 135-139 (1990) 另一种替代方案是葡萄糖-抑制 ADH2 启动子，其描述见Russell et al. (J. Biol. Chem. 258 :2674，1982)和Beier et al. (Nature 300 :724，1982)。通过将来自pBR322中在大肠杆菌中负责筛选和复制的DNA (Ampr基因和复 制起始位点)插入上述酵母载体，可以构建出在大肠杆菌和酵母中均可复制的穿梭载体。本发明的一个实施方案是经过修饰以含有本发明所述核酸的非人生物体。可以通 过本领域已知的任一种基因转移方法对所属非人生物体和/或宿主细胞进行修饰，包括， 例如，使用递送载体，如脂质及病毒载体、裸露DNA、电穿孔及微粒介导基因转移。在一个实 施方案中，所述非人生物体是植物、昆虫或微生物。例如，在一个实施方案中，本发明提供了一种制备至少一种倍半萜烯合成酶的方法，该方法包括将经修饰以含有至少一种核酸的宿主培养在利于所述至少一种倍半萜烯合 成酶产生的条件下，其中所述的至少一种核酸选自(a)含有基本上如SEQ ID N0:6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO 9或SEQ ID NO 10所示核苷酸序列的核酸；(b)编码基本 上如 SEQ ID N0:1、SEQ ID NO :2、SEQ ID N0:3、SEQ ID NO :4 或 SEQ ID NO :5 所示多肽的 核酸；以及(c)能够在低度严谨条件下与(a)或(b)中核酸杂交的核酸，其中由所述核酸编 码的多肽是倍半萜烯合成酶。在另一个实施方案中，所述宿主是一种植物(如烟草)、动物或微生物，还包括但 不限于菌体细胞、酵母细胞、植物细胞和动物细胞。在本申请中，植物细胞和动物细胞包括 用植物和动物作为宿主。例如，在本方明的一些实施方案中，表达是在经过基因修饰后的非 人生物体中进行。在一个实施方案中，使用哺乳动物或昆虫宿主细胞培养系统表达本发明的重组多 肽。用于在昆虫细胞中制备异源蛋白的杆状病毒系统的综述见Luckow and Summers,Bio/ Technology 6 :47 (1988)。另外还可以使用从哺乳动物来源建立的细胞系。合适的宿主细胞 系的实例包括 C0S-7 猴肾细胞系(ATCC CRL1651) (Gluzman et al. ,Cell 23 175，1981)，L 细胞、C127细胞、3T3细胞(ATCC CCL163)、中华仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞和BHK (ATCC CRL10)细胞系，以及源自非洲绿猴肾细胞系CVI (ATCC CCL70)的细胞系CV-1/EBNA-1 (ATCC CRL10478)，描述见 McMahan et al. (ΕΜΒ0 J. 10 :2821，1991)。为将DNA导入哺乳动物细胞而建立的方法现已公开(Kaufman，R. J.，Large Scale Mammalian Cell Culture，1990，pp. 15-69)。其他使用可商购的试剂例如 Lipofectamine (Gibco/BRL)或 Lipofectamine-Plus 的方法，也可用于转染细胞(Feigner et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7417,1987)。此外，可以使用常规方法通 过电穿孔转染哺乳动物细胞，例如Sambrook et al. Molecular Cloning :A Laboratory Manual, 2ed. Vol. 1-3,Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所描述的方法。可 以用细胞毒性物质抗性作为筛选方法筛选得到稳定的转化体。Kaufman et al.，Meth. In Enzymology 185 =487-511,1990中描述了几种筛选方案，例如二氢叶酸还原酶(DHFR)抗 性。适于DHFR筛选的宿主细胞株有CHO细胞株DX-Bl 1，该细胞株是DHFR缺陷型的(Urlaub and Chasin,Proc. Natl. Acad. Sci. USA77 :4216_4220，1980)。可以将能表达DHFR cDNA的质 粒导入细胞株DX-B11，这时只有那些含有该质粒的细胞才能在合适的筛选培养基中生长。哺乳动物细胞表达载体用的转录及翻译调控序列可以从病毒基因组切取。常用的 启动子序列和增强子序列源自多瘤病毒、腺病毒2、猴病毒40 (SV40)和人巨细胞病毒。源自 SV40病毒基因组的DNA序列，例如SV40起点、早期和晚期启动子、增强子、剪接(位点)以 及聚腺苷酸化位点，可用于提供哺乳动物宿主细胞表达用的其他基因元件。病毒早期和晚 期启动子特别有用，因为它们容易以片段形式从病毒基因组获得，片段中还含有病毒复制 起点(Fiers et al. , Nature 273 :113,1978 ；Kaufman, Meth. in Enzymology, 1990)。现已有数种本领域已知的用于制备转基因植物的方法。这些方法包括，但不限于 植物原生质体电穿孔、脂质体介导的转化、聚乙二醇介导的转化、植物细胞的微注射以及使 用病毒进行的转化。在一个实施方案中，使用的是粒子轰击定向基因转移。粒子轰击定向基因转移为转化植物组织提供了一个实例。该技术中，包被了 DNA 的粒子或微抛射体被射出穿越细胞的物理屏障。粒子轰击可用于将DNA导入DNA包被粒子
12可穿透的任一靶组织，但是为了稳定转化，必须使用可再生的细胞。通常，粒子由金或钨制 成。可以使用CaCl2或乙醇沉淀的方法将DNA包被在粒子上，这些方法都是本领域已知的 常规方法。DNA包被粒子用粒子枪射出。合适的粒子枪可从Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA)购买。粒子的穿透由改变参数来控制，例如爆裂强度、粒子大 小或者粒子到达靶组织必须行经的距离。包被粒子用的DNA包括适于驱动目的基因表达的表达框，其中含有与目的基因可 操作连接的启动子。粒子轰击定向基因转移方法的描述参见Tomes等人的美国专利US5，990，387。在一个实施方案中，本发明的cDNA可用产生正义或反义RNA的方法表达。反义RNA 就是与基因编码mRNA(正义RNA)反向互补的RNA。驱动反义RNA表达的载体是这样一种 载体，cDNA以相对于启动子而言“相反方向”放入其中从而使得非编码链(而不是编码链) 被转录。反义RNA的表达被用于下调该反义RNA互补mRNA编码的蛋白质的表达量。产生 反义RNA的载体可用于制备转基因植物，如上所述。在一个实施方案中，转染后的DNA整合入非人生物体的染色体从而得到稳定的重 组系统。本领域已知的任一染色体整合方法都可用于实施本发明，包括但不限于，重组酶介 ^W^iitilS^ (recombinase-mediated cassette exchange) (RMCE)
色体插入、腺病毒以及原核注射。本发明的另一实施方案是制备萜类化合物和倍半萜烯化合物的方法，例如，使用 本发明所述核苷酸及多肽。实施例包括用于制备至少一种萜类化合物的方法，该方法包括 让至少一种脂肪族焦磷酸酯萜烯前体与核酸编码的至少一种多肽接触，该核酸选自(a)含 有基本上如 SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO 9 或 SEQ ID NO 10 所 示核苷酸序列的核酸；(b)编码基本上如SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ IDNO :4或SEQ ID NO :5所示多肽的核酸；以及(c)能够在低度严谨条件下与(a)或(b)中 核酸杂交的核酸，其中由所述核酸编码的多肽是倍半萜烯合成酶，然后将制备得到的至少 一种萜类化合物分离出来。另一实施例是制备至少一种萜类化合物的方法，该方法包括让 至少一种脂肪族焦磷酸酯萜烯前体与至少一种基本如SEQID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID N0:3、SEQ ID NO :4或SEQID NO :5所示多肽接触，然后将制备得到的至少一种萜类化合物 分离出来。本申请中使用的脂肪族焦磷酸酯萜烯前体是任意的脂肪族焦磷酸酯化合物，其是 用于制备至少一种萜烯的前体，包括但不限于，栊牛儿基焦磷酸酯(GPP)，法呢基焦磷酸酯 (FPP)和栊牛儿基栊牛儿基焦磷酸酯(GGPP)。在一个实施方案中，所述的至少一种萜类化合物选自倍半萜烯。在一个实施方案 中，所述的脂肪族焦磷酸酯萜烯前体是法呢基焦磷酸酯。在另一个实施方案中，所述的至少 一种倍半萜烯选自二环吉马烯((E，E)-3，7，11，11-四甲基-二环[8. 1. 0]十一 _2，6_ 二 烯)、荜澄茄醇((1R，4S，5R，6R，7S，10R) -7-异丙基-4，10- 二甲基-三环[4. 4. 0.0(1,5)] 癸-4-醇，朱栾倍半萜((+) - (IR) -1，2，3，5，6，7，8，8A-八氢-7-异丙烯基- , 8Ai- 二甲基 萘)、α-荜澄茄油烯、吉马烯D和δ-杜松烯(rel-(lR，8AS)_l，2，3，5，6，8A-六氢-1-异 丙基-4，7-二甲基萘)(图2)。本发明的萜类化合物可以用本领域使用的任一方法分离，包括但不限于层析、提取及蒸馏。在一个实施方案中，可以通过改变合成酶与脂肪族焦磷酸酯萜烯前体(例如法呢 基焦磷酸酯)接触时的PH值来调整产物分配或形成的实际产物。在一个实施方案中，pH为 7。另一实施方案中，pH小于7，例如，6、5、4和3。另外，本发明还提供了一种生物体(例如，微生物或植物)，该生物体用于构建一 种平台，用于以高水平生产倍半萜烯合成酶底物(例如，FPP)以及将本发明核酸导入该生 物体。例如，将至少一种编码倍半萜烯合成酶的本发明所述核酸引入制备FPP的非人生物 体，从而完成FPP向倍半萜烯的转化以及随后的倍半萜烯的代谢产生。在一个实施方案中， 这样就得到一种用于高水平生产倍半萜烯的平台。在一个实施方案中，本发明所述核酸可用于制备编码倍半萜烯合成酶的其他核 酸。例如，本发明提供了一种鉴定倍半萜烯合成酶的方法，该方法包括用本发明所述核 酸构建DNA文库，从该文库中筛选出编码至少一种倍半萜烯合成酶的核酸。本发明所述核 酸的文库可以用本领域已知的任一方法构建，其中用本发明核酸作为起始位点制备DNA序 列，包括但不限于DNA重构(DNA shuffling)。在该方法中，用功能试验发现编码倍半萜烯 合成酶的目标核酸从而从所述文库中筛选倍半萜烯合成酶。倍半萜烯合成酶的活性可以用 例如本申请所述方法测定。在一个实施方案中，使用高通量筛选分析编码多肽的活性。本申请中的“核苷酸探针”是指能够通过形成一种或多种化学键、通过互补碱基配 对或者通过形成氢键，与互补序列的目标核酸结合的寡核苷酸或多核苷酸。如上所述，所述 寡核苷酸探针可以含有天然(即A，G，C或T)或者修饰碱基(7-脱氮鸟嘌呤、次黄嘌呤核苷 等)。此外，核苷酸探针中的碱基可以通过磷酸二酯键以外的键连接，只要其不妨碍杂交即 可。因此，寡核苷酸探针中可以含有通过磷酸二酯键以外的肽键连接的连续碱基。本申请中的“目标核酸”是指能够与所述核苷酸探针或分子特异性杂交的核酸。可 以设计探针测定目标核酸的存在与否以及目标核酸的含量。目标核酸的序列与将相应探针 中导向目标的核酸序列互补。正如本领域技术人员理解的那样，所述探针还可以含有与目 标不能特异性杂交的其他核酸或其他部分，例如标记物。术语目标核酸可以是探针指向的 较大核酸中的特定的核苷酸序列也可以是全序列(例如，基因或mRNA)。本领域技术人员可 以认识到各种条件下的所有用途。除操作实施例或者另有说明之外，所有表示组分含量、反应条件的数值以及说明 书和权利要求中使用的数值应理解为全部用“约”进行了限定。因此，除有相反说明外，说 明书和权利要求中的所有数值参数都是近似值，可以根据本发明期望获得的理想特性来变 动。绝对无意限制等同原则在权利要求范围上的应用，所以每一个数字参数都应该是根据 有效数字的数目和常规舍入法得到的。尽管表示本发明较宽范围时使用的数值范围和参数是近似值，但是特定实施例中 列出的数值却是尽可能精确的。但是，任一数值中都必然含有因各自测量存在的标准差所 不可避免带来的一定误差。下列实施例是为了阐述本发明但决不对本发明的范围构成限 制。百分比是根据重量计算出的。下列实施例是为了阐述本发明但决不对本发明的范围构成限制。实施例材料
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用柚子(葡萄柚)皮作为本申请所述试验的起始原材料。皮(果皮外部有颜 色的部分)内含有油腺，油腺是萜烯生物合成的部位。用新鲜采摘的成熟果实在Simone Gatto(Sicily)制得新鲜的柚子皮。将皮(3_4mm厚)剥离后，立即冷冻，而且在运输过程和 随后的所有步骤中都保持冷冻以防降解。实施例1 用RT-PCR分离倍半萜烯合成酶cDNA。将植物倍半萜烯合成酶的推导氨基酸序列进行比对，鉴定保守区并设计植物倍半 萜烯合成酶-特异性寡核苷酸。为了获得较高的序列同源性，将序列分成两组(图4)。第 一组包括下列酶的序列源自蕃茄(Lycopersicon esculentum) cv. VFNT cherry (Colby et al，1998)的吉马烯 C 合成酶、源自欧薄荷(Mentha χ piperita) (Crock et al，1997)的 (Ε)-β-金合欢烯合成酶、源自北美冷杉(Steele et al,1998)的δ-芹子烯合成酶、源自 香橙(GenBank登记号AF288465)的倍半萜烯合成酶、源自烟草(Facchini和Chappel 1， 1992)和辣椒(Back et al，1998)的5_表-马兜铃烯合成酶、源自马铃薯和Hyoscyamus muticus (Back and Chappel, 1995)的 vetispiradiene 合成酶。第二组包括下列酶的序列 源自亚洲棉(Chen et al. 1995)的(+)_ δ -杜松烯合成酶，源自黄花蒿的紫穗槐-4，11-二 烯合成酶(Mercke et al,2000)和表-雪松醇合成酶(Merck et al,1999)以及源自北美 冷杉(Steele et al,1998)的潷草烯合成酶。最高序列同源性发现于序列的中间部 分。选择三个含有足够保守氨基酸的区域，设计这些区域的特异性简并寡核苷酸(即，从每 一比对组得到两个正向和一个反向引物)(图4)。用从Hot Borate技术制备柚子皮得到的总RNA以及正向和反向简并引物的不 同组合，进行RT-PCR。提取总RNA用的Hot Borate方法是由Wan and Wilkins (Wan et al. (1994)Anal. Biochem. 223,7-12.)改进得到的。在液氮中将这些组织用研钵和杵研 磨成细粉。将得到的细粉加入5ml提取缓冲液(200mM硼酸盐、30mM EGTA，IOmM DTT, 1% 305，1%脱氧胆酸钠、2% ￥ ，0.5%乙基苯基聚乙二醇(NP40))80°C预热。将上述混合物用 UltraturaxTM勻浆器均质化，然后用两层MiraclothTM滤膜(Calbiochem)过滤。将混合 物在0. 5mg/ml蛋白酶K(用于蛋白质/核糖核酸酶消化)存在条件下42°C孵育90分钟。 然后加入KCl至IM终浓度，置于冰上孵育1小时，将混合物置于4°C离心机中IOOOOg离心 10分钟。回收上清，加入1/3体积的8M LiCl0将混合物4°C孵育过夜，然后4°C下IOOOOg 离心20分钟。弃上清，用2M LiCl洗涤沉淀，用上述条件再次离心。然后，将沉淀重悬于无 RNase的蒸馏水，然后加入0. 15倍体积的2M乙酸钾溶液和2. 5倍体积的无水乙醇。_20°C 下孵育2小时沉淀RNA，然后照前述条件离心。用80%乙醇洗涤RNA沉淀，然后重悬于无 RNase的蒸馏水。 RNA浓度由260nm处的OD值估测。用琼脂糖凝胶通过查证核糖体RNA条带的整齐 度测定RNA纯度。 用 Qiagen OneStep RT-PCR 试剂盒禾口 Eppendorf Mastercycler 梯度热循环仪 进行RT-PCR。常用反应混合物50 μ 1终体积中含有10 μ 15XQiagen OneStep RT-PCR缓 7中液、400μΜ 每一 dNTP、400nM 每一弓I 物、2μ 1 Qiagen OneStep RT-PCR Enzyme Mix、 1 μ 1 RNasin 核糖核酸酶抑制剂(Promega Co.)和1 μ g总RNA。热循环仪条件为50°C、 30分钟(反转录)；95°C、15分钟(DNA聚合酶活化)；94°C、45秒，42_45°C、10秒(根据使 用引物而定)，72°C、45-90秒(根据待扩增DNA片段长度而定)共40个循环；然后72°C、
1510分钟。用琼脂糖凝胶测算PCR产物的大小。将出现在预期大小对应位置上的条带从 凝胶上切割下来，用QIAquick 凝胶提取试剂盒(Qiagen)纯化，然后用TOPO TA克隆试 剂盒(Invitrogen)克隆入pCR 2. 1-T0P0载体。然后对插入的cDNA进行DNA测序，将该序 列用 BLASTX算法(Altschul et all990)与 GenBank 非冗余蛋白质数据库(non redundant protein database) (NCBI)进 亍比对。对预期长度(80_240bp大小)PCR产物进行DNA测序和Blast搜索表明有三种倍 半萜烯合成酶片段，命名为GFTpsA、GFtpsB和GFTpsC。180_bp的GFTpsA片段用引物TpsVF 1 和 TpsVR3 扩增，115-bp 的 GFtpsB 片段用 TpsVF2 和 TpsVR3 扩增，115-bp 的 GFTpsA 片段 用TpsVFl和TpsVR3扩增。推导的氨基酸序列表明这三种片段之间差异显著(图5)。实施例2:用5' /3' -RACE分离倍半萜烯合成酶cDNA为了分离倍半萜烯合成酶的全长序列，首先使用5' /3' -RACE方法，用 Marathon cDNA扩增试剂盒(Clontech)，从纯化自Hot Borate技术制备总RNA的1 μ g mRNA起始。合成cDNA的质量较差，基本上都是很小的cDNA (平均大小为0. 5Kb)。但是，用 该cDNA，通过基因特异性引物得到了 GFTpsB和GFTpsC的3，末端，GFTpsB使用GFTpsBRFl 和GFTpsBRF2，GFTpsC使用GFTpsCRFl和GFTpsCRF2 (参见表1)。用硫氰酸胍/苯酚提取 方法制备的mRNA得到了较高质量的cDNA，平均大小为2Kb，从而可以用基因特异性引物 GFTpsCRRl和GFTpsRR2 (参见表1)分离GFTpsC的5'-末端序列，从而完成该克隆的全长 序列。GFTpsB的5'-末端和GFTpsA的5'-末端及3'-末端用该方法不能获得。硫氰酸胍/苯酚提取法采用Chomczynski和Sacchi所述技术，使用ThermoHybaid 的 RNAClean 溶液(Chomczynski，P.，and Sacchi, N.，(1987)Anal.Biochem. 162， 156-159.)。简而言之，在液氮中将2g冷冻组织用研钵和杵研磨成细粉。将得到的细粉转 移到20mlRNAClean 溶液，将悬液用UltraturaxTM勻浆器均质化，然后用MiraclothTM滤 膜(Calbiochem)过滤。加入0. 1倍体积的氯仿后，将试管置于冰上，然后4°C下12000g离 心20分钟。回收上层水相，加入1倍体积的异丙醇。-20°C孵育20分钟后，将样品在4°C下 12000g离心20分钟。将得到的白色沉淀大块用70%乙醇洗涤，室温干燥。将这种含有总 RNA的沉淀立即用FastTrack 2. OmRNA分离试剂盒(Invitrogen)通过oligodT-纤维素 亲和层析进行mRNA纯化。按照厂商推荐方法进行，除下述改动外在将总RNA重悬于裂解 缓冲液后，将样品由65°C改为100°C下加热。cDNA3‘和 5'末端快速扩增(RACE)用 Marathon cDNA 扩增试剂盒(Clontech) 完成。该方法从合成第一链cDNA开始，用oligo (dT)引物从mRNA起始。第二链合成后，将 特异性衔接子连接于双链cDNA(ds cDNA)末端。该方法提供了一种衔接子连接的ds cDNA 的非克隆文库。用纯化的柚子mRNA(lyg)作为起始材料。用琼脂糖凝胶测算cDNA的质和量。使用Advantage 2聚合酶Mix，用基因特异性和衔接子特异性寡核苷酸的组合 扩增cDNA的3，-或5，-末端。常规RACE反应混合物50 μ 1终体积中含有5 μ llOXcDNAPCR 反应缓冲液(clontech)、200nM 每一 dNTP、1 μ 1 Advantage 2 聚合酶 Mix、200 μ M 衔接子 特异性引物(Clontech)、200 μ M基因特异性引物(参见表1)和5 μ 1经50-250倍稀释后 的衔接子连接的cDNA。扩增在Eppendorf Mastercycler梯度热循环仪中进行。热循环仪
16条件为94°C、1分钟；94°C、30秒，72°C、2-4分钟，共5个循环；94°C、30秒，70°C、2-4分钟， 共5个循环；94°C、30秒，68°C、2-4分钟，共20个循环。必要时用巢式衔接子特异性引物 (Clontech)和巢式基因特异性引物进行第二轮扩增。按照上文RT-PCR产物使用的方法，对扩增产物进行评定、亚克隆及序列分析。表1:3' /5' -RACE试验中使用的引物
名称定义序列(从5’到3’端)GFTpsARFI (SEQ ID NO:33)3’-RACE正向引物CTGGGAGTGTCCTATGAGCT CAATTTGGGFTpsARF2 (SEQ ID NO-.34)GFTpsA 3'-RACE正向巢式？ |物GTAGAATTTTTGCATCCAMG TGOTGTGCGFTpsARRI (SEQ IO NO:35)GFTpsA 5'-RACE 反向引物CACACCACTTTGGATGCAAA AATTCATCGFTpsARR2 (SEQ ID NO:36)GFTpsA S'-RACE反向巢式引物CCAAATTGGGCTCATAGGAC ACTCCCAGGFTps8RF1 (SEQ ID NO:37)GFTpsB 3’-RACE 正向引物TAGGGACGTAT7TTGAACCA AAGTACGFTpsBRF2 (SEQ ID NO:38)GFTpsB 3’-RACE正向巢式引物AAATAATGACCAAAACAATTT ACACGGGFTpsBRRI (SEQ ID NO:39)GFTpsB 5’-F ACE 反向引物GCACTTTCATGTATTCTGGM GGFTpsBRR2 (SEQ ID N0:40)GFTpsB 5'-RACE反向巢式引物GTTTGAGCTCTTCAAAGAAA CCGFTpsCRFI (SEQ ID NO:41)GFTpsC 3’-RACE 正向引物AArGGGAGHJlAI 丨丨 IUAGC CTCGATACTCCGFTpsCRF2 (SEQ ID NO:42)GFTpsC 3'-RACE正向巢式引物GATATTTTCCAAAGTAATTGC AATGGCATCCGFTpsCRRI (SEQ ID NO:43)GFTpsC 5’-RACE反向引物 ΠUGΓΑΑΤΑΙCCCACC_I I IT GATAGCGFTpsCRR2 (SEQ ID NO:44)GFTpsC 5_-RACE反向巢式引物AAGTGTGCCATAGGCGTCGT AGGGFTpsDRRI (SEQ ID NO:45)GFTpsD 5’-RACE反向引物CTGTTCCGCAAGCTTAGGGG TTACATGGFTpsDRR2 (SEQ ID NO:46)GFTpsD 5'-RACE反向巢式引物CTGAGCTACCAATGACTTCA GGTGAGTGGGFTpsERRI (SEQ ID NO:47)GFTpsE 5’-RACE 反向引物CAATTTTGCCATACACATCAT AGATATCATCGFTpsERR2 (SEQ ID NO:48)GFTpsE 5'-RACE反向巢式引物AACAGAAGTCATGGAGATCA CTTTCGTCGFTpsERR3 (SEQ ID NO:49)GFTpsE 5’-RACE 反向引物CGCMGAGATGTTTTAAAGTT CCCATCCGFTpsERR4 (SEQ ID N0:50)GFTpsE δ'-RACE反向巢式？]物TGAACATCAGCGGAAATTTTA TAGCC 发现用3 ‘ -RACE得到的部分GFTpsB cDNA与公共数据库(GeneBank登记号 AF288465)中的及分离自香橙的推定萜烯合成酶cDNA之间具有高度序列同一性。这种萜烯
17合成酶的特异性引物设计为根据香橙(C. jimos)萜烯合成酶非编码区设计一个正向和反 向引物对(junosFl和junosRl)，根据含有起始和终止密码子在内的编码区设计一正向和 反向引物对(junosF2 和 junosR2)。用引物对 junosFl 和 junosRl 对柚子 Marathon cDNA 文库进行PCR扩增没有得到任何扩增子。用引物对jimoSF2和junoSR2扩增出了一 1. 6Kb 的片段。DNA测序证实该PCR产物是GFTpsB克隆的1669_bp全长倍半萜烯合成酶(图6)。实施例3 cDNA文库筛选和EST测序.为了得到PCR方法获得的部分克隆的全长cDNA，构建了从柚子皮mRNA制备的 cDNA文库。用Uni- ZAP XR文库构建试剂盒(Stratagene)，按照厂商推荐方法，从7. 5 μ g 柚子皮mRNA(用硫氰酸胍/苯酚法制得)起始进行cDNA合成和文库构建。文库的初始滴 度为2xl07PFU(噬斑形成单位)，插入片段的平均长度为1. 1Kb。使用两种方法从上述cDNA文库分离编码cDNA的倍半萜烯合成酶EST测序以及 用DNA探针筛选。就EST (已表达序列标志)测序而言，使用文库的一部分，用Stratagene 的大量切除法(mass excision protocol)切除Uni-ZAP XR载体中的pBluescript噬菌粒。 随机挑取得到的转化菌落(576)，纯化质粒。对于每一克隆都用T3引物进行一测序反应。 首先对序列进行编辑除去载体序列，然后用BLASTX算法(Altschul et all990)与GenBank 非冗余蛋白质数据库(NCBI)进行比对。用地高辛(DIG)标记的DNA探针对文库进行筛选。该探针是用PCR DIG(地高 辛)探针合成试剂盒(Roche Diagnostics)通过PCR扩增将DlG_dUTP掺入DNA片段而 合成的。从一等份文库中扩增出149-bp的GFTpsA-来源DNA探针，使用的引物为正向 引物 GFTpsAproF(SEQ ID NO 51) (5 ‘ -ACGATTTAGGCTTCCCTAAAAAGG-3 ‘)和反向引物 GFTpsAproR(SEQ ID NO 52) (5' -TATTATGGAATATTATGCACACCAC-3‘)。从pET_GFTpsB2_2 质粒中扩增出1036-bp的GFTpsB-来源探针，使用的引物为正向引物junosF2 (SEQ ID NO: 53) (5' -AAATGTCCGCTCAAGTTCTAGCAA CGG-3 ‘)和反向引物 GFTpsBRR2 (SEQ ID NO 54) (5' -GTTTGAGCTCTTCAAAGAAACC-3 ‘)。从pET-GFTpsC质粒中扩增出 1008-bp 的 GFTpsC-来 源DNA探针，使用的是正向引物 GFTpsCpetFl (SEQ IDNO 55) (5 ‘ -ATGGCACTTCAAGATTCAGAA GTTCC-3‘)和反向引物GFTpsCRRl(SEQ ID NO 56) (5' -GTTGCTAATATCCCACCTTTTGATAGC-3')。探针在40°C下在Dig Easy Hyb杂交溶液(Roche Diagnostics)中杂交出噬斑 挑取物(plaques lifts)，噬斑挑取物制备自含有5，000-25，000PFU的平板。通过化学发 光检测膜上的探针-目标杂合体，使用抗_地高辛-碱性磷酸酶(Roche Diagnostics)和 CDP-Star (Roche Diagnostics), M VersaDoc Imaging System(BioRad) 显色。从琼脂糖平板上挖髓取出阳性信号的噬菌体，进行第二轮筛选，如果必要在进行 第三轮筛选，直至获得单一噬斑阳性信号。体内切割阳性分离物，按照上述方法对插入片段 测序。用从GFTpsA、GFTpsB和GFTpsC制备的DNA探针对文库进行筛选。该方法生产出三 种不同倍半萜烯合成酶cDNA。其中两种此前已有克隆一种克隆名为GF2-30-1，是GFTpsC cDNA的5’-末端300-bp截短形式；第二种名为9_13_6，是GFtpsA的部分克隆，与其他倍半萜烯合成酶相比5’ -末端截短了大约168-bp。与上述通过RT-PCR得到的部分GFTpsA克 隆相比，9-13-6克隆提供了 618-bp 5’ -末端附加序列的信息。在其3’ -末端，9-13-6克 隆也是不完整的。大约丢失了 680个核苷酸，取而代之的是一功能未知的600-bp片段。筛 选获得的第三种编码cDNA的倍半萜烯合成酶，GF2-5-11，其编码出一种新的名为GFTpsD的 倍半萜烯合成酶。该克隆5’ -末端截短，但是用表1中的引物通过5' -RACE回收到了所 丢失的414-bp。然后，从Marathon cDNA文库扩增出全长GFTpsD，并将其克隆入上述细菌 表达载体。几种全长GFTpsDcDNA的DNA序列分析发现有两种倍半萜烯合成酶密切相关， 只有极小的序列差异，将其命名为GFTpsDl和GFTpsD2 (图6)。这两种变体的推导氨基酸序 列彼此间相差4个碱基。就EST测序方法而言，对576个克隆进行了测序。其中只有3个克隆编码推定萜 烯合成酶-样蛋白，更确切地说，是两种不同的倍半萜烯合成酶_样蛋白和一种单萜合成 酶-样蛋白。两个倍半萜烯合成酶-样克隆中的一个(克隆GF002-G3)此前被鉴定为克隆 GFTpsDl。第二个克隆(克隆GF006-G7)是一种截短的cDNA，其编码一种新的名为GFTpsE 的倍半萜烯合成酶。该克隆在5’ -末端也是截短的(大约800bp)，但是该丢失的片段可 以按照下述两个步骤通过5' -RACE扩增得到。第一个5' -RACE使用引物GFTpsERRl和 GFTpsERR2(参见表1)提供了 500个附加的5，-末端核苷酸，第二个5' RACE使用引物 GFTpsERR3和GFTpsERR4 (参见表1)提供了丢失的5，-末端DNA序列，重构得到了全长 GFTpsE cDNA(图 6)。实施例4 质粒构建和酶表达表达质粒的构建将cDNA亚克隆入pETlla表达质粒(Novagen)，进行倍半萜烯合成酶的功能表达。 就GFTpsB，GFtpsD和GFTpsE而言，通过PCR扩增全长cDNA，以向5，-末端导入其中含有 起始密码子的Ndel位点，在3，-末端紧接终止密码子之后导入BamHl位点。就GFTpsB 而言，使用正向引物 GFTpsBNdel (SEQ ID NO 57)5' -GCATGTTC CATATG TCCGCTCAAGT TCTAGCAACGGTTTCC-3 ‘ (Ndel位点用斜体表示，起始密码子用下划线标出)和反向引物 GFTpsBBam (SEQ ID NO 58)5' -CGCGGA 7Υ7ΓTCAGATGGTAACAGGGTCTCTGAGCACTGC-3 ’ (Ba m Hl位点用斜体表示，起始密码子用下划线标出)。同样，正向引物GFTpsDNdel (SEQ ID NO 59) 5 ‘ -GCATGTTC CATATG TCGTCTGGAGAAACATTTCGTCC-3 ‘和反向引物 GFTpsDBam(SEQ ID NO 60)5' -CGC GGATCC TCAAAATGGAACGTGGTCTCCTAG-3 ‘用于 GFTpsD ；以及正向引 物GFTpsENdel (SEQ ID NO 61)5' -GCATGTTCCATATG TCTTTGGAAGTTTCAGCCTCTCCTG-3‘ 和反向引物 GFTpsEBam (SEQ ID NO 62)5' -CGC GGATCC TCATATCGGCACAGGATTAATAAACA AAGAAGC-3 ‘用于 GFTpsE。扩增反应是使用Pfu DNA聚合酶(Promega)在含下列物质的50 μ 1终体积中进行 的5μ1 Pfu DNA聚合酶IOX缓冲液、每一种dNTP各200 μ Μ、正向和反向引物各0.4 μ Μ、 2. 9单位Pfu DNA聚合酶以及5 μ 1经100倍稀释的cDNA (按照上述方法用Marathon cDNA 扩增试剂盒(Clontech)制备)。热循环条件为95°C、2分钟；95°C、30秒，55°C、30秒，72°C、 4分钟，共25个循环 ’然后72°C、10分钟。PCR产物在琼脂糖凝胶上纯化，用QIAquick 凝胶提取试剂盒(Qiagen)洗脱，接着用Ndel和BamHl消化，然后将其连接入经同样消化后 的pETlla质粒。
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就GFTpsC-pETlla表达载体的构建而言，分别进行两次PCR扩增，使插入片段 与Ndel和BamHI粘性末端侧接。第一次PCR在同上所述条件下进行，使用正向引物 GFTpsCpETFl (SEQ ID NO 63)5 ‘ -TAATGGCACTTCAAGATTCAGAAGTTCCTC-3 ‘和反向引物 GFTpsCpETRl (SEQ ID NO 64)5' -AAAAGGGAACAGGCTTCTCAAGCAATG-3 ‘，第二次 PCR 使用正 向引物 GFTpsCpETF2 (与 GFTpsCpETFl 相比 5，-末端少了 AT) (SEQ ID NO 65)5' -ATGGCA CTTCAAGATTCAGAAGTTCCTC-3‘和反向引物 GFTpsCpETR2 (与 GFTpsCpETRl 相比 5，-末端多 出了 GATC)(SEQ ID NO 66)5' -GATCAAMGGGAACAGGCTTCTCAAGCAATG-3 ‘。将两次 PCR 产 物用上述方法纯化后合并，通过下述操作变性煮沸5分钟然后冰上冷却5分钟。将得到的 cDNA直接连接入pETlla质粒。起初将连接产物转化入JM109大肠杆菌细胞，通过限制性酶切消化和DNA测序验 证构建体。倍半萜烯合成酶表达就蛋白表达而言，将含倍半萜烯合成酶cDNA的pETlla质粒和pETlla空质粒转化 入BL21(DE3)大肠杆菌细胞(Novagen)。将得到的单菌落接种5ml LB培养基。37°C孵育 5-6小时后，将培养物转移到20°C孵箱，放置1小时平衡。加入0.5mM IPTG诱导蛋白质的 表达，然后将培养物在20°C孵育过夜。第二天，离心收集细胞，重悬于0. 5ml提取缓冲液(50mMM0PS0 pH7,5mM EDTA, 5mM EDTA，10%甘油)，然后超声处理3次，每次30秒。18，OOOg离心30分钟沉淀细胞碎片，回 收含可溶蛋白的上清液。通过下述操作对倍半萜烯合成酶的表达进行评估将蛋白提取物 用SDS-PAGE (SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离，然后用考马氏亮蓝染色，然后与用空质粒转 化细胞得到的蛋白提取物进行比较。所有构建体都观察到了一具有预期计算分子量的明显条带，但是用空质粒转化的 大肠杆菌得到的可溶性蛋白中没有出现该条带。实施例4酶功能测定酶促试验在密封的玻璃试管中进行，使用终体积中含50-100 μ 1蛋白提取物的提 取缓冲液，该提取缓冲液补加了 15mM MgC12和100-250 μ M FPP (Sigma)。培养基上层用Iml 戊烷覆盖，试管置于30°C孵育过夜。回收含有倍半萜烯的戊烷相，用第二体积的戊烷提取培 养基。将合并后的戊烷级分在氮中浓缩，用Hewlett-Packard6890Series GC系统的气相色 谱分析，使用内径0. 25mm长30m的SPB-I (Supelco)毛细管层析柱。载气为恒定流速1. 6ml/ min的He气。注射按2 1的比例分开进行，注射器温度设定为200°C，烤箱(oven)程序 设定为从80°C (保持0分钟)开始以7. 5°C /分钟的速率升至200°C (保持0分钟)，接 着以20°C/分钟的速率升至280°C (保持2分钟)。检测使用火焰离子化检测器。在权威 标准能够获得的情况下，化合物识别是根据与权威标准具有相同保留时间进行的。为了证 实产物身份(identities)，使用HeWlett-Packard6890GC-四极质谱检测器，用安装有内径 0. 25mm 长 30m 的 SPB-I(Supelco)毛细层析柱的组合毛细(combined capillary)GC-MS 对 样本进行分析。烤箱程序设定为从80°C (保持0分钟)以7.5°C速率升至200°C，He气流 的恒定流速为1. 5ml/min。用2200V电压的电子倍增器记录70eV时的光谱。用该试验测定不同重组酶的酶活性，使用可溶性蛋白级分，以法呢基-二磷酸酯 作为底物。从所测的所有克隆获得倍半萜烯合成酶活性，生成的产物用保留时间以及气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)(图7)来定性。GFTpsB cDNA编码出的倍半萜烯合成酶，产 生主产物二环_吉马烯(图3)和至少15种次要的倍半萜烯链烯烃或氧化的倍半萜烯例如 δ -杜松烯(图3)(由二环-吉马烯热重排得到的二环_榄香烯(图3)，也出现在了 GC图 中)。GFTpsC cDNA编码出一种生成多产物的倍半萜烯合成酶，主产物鉴定为荜澄茄醇(图 3)。该酶还生产出了占相当大比例的3种其他倍半萜烯_荜澄茄油烯和2种氧化 后的倍半萜烯，以及少量的至少11种倍半萜烯链烯烃或氧化后的倍半萜烯。GFtpsD编码出 的倍半萜烯合成酶，可以生产出主产物朱栾倍半萜。10个其他的小峰也被鉴定为倍半萜烯 链烯烃或醇。其中，榄香烯是吉马烯A的热降解产物。GFTpsE编码出的倍半萜烯合成 酶，生产出的是倍半萜烯化合物与S-杜松烯(图3)的复合混合物，其中δ-杜松烯以微 弱优势成为含量最丰富的组分。另外，从GFTpsE生成的产物中还鉴定出了荜澄茄醇和吉马 烯D (图3)。 上述试验中，分离的倍半萜烯合成酶表现出生成多产物的特性。例如，荜澄茄醇合 成酶和δ-杜松烯可以生成占相对较大比例的3或5种产物。二环吉马烯合成酶产生了主 产物倍半萜烯和几种微量的次产物。
权利要求
一种核酸，其编码由氨基酸序列SEQ ID NO4或SEQ IDNO5构成并具有朱栾倍半萜合成酶活性的多肽。
2.权利要求1所述的核酸，其包含核苷酸序列SEQID NO 9或SEQ ID NO=IO0
3.权利要求1所述的核酸，其由核苷酸序列SEQID NO 9或SEQ ID NO 10构成。
4.由氨基酸序列SEQID NO :4或SEQ ID NO :5构成并具有朱栾倍半萜合成酶活性的 多肽。
5.一种含有核酸的载体，该核酸编码由氨基酸序列SEQ IDNO 4或SEQ ID NO 5构成 并具有朱栾倍半萜合成酶活性的多肽。
6.权利要求5所述的载体，其中该核酸包含核苷酸序列SEQIDNO :9或SEQ ID NO=IO0
7.权利要求5所述的载体，其中该核酸由核苷酸序列SEQIDNO :9或SEQ ID N0:10构成。
8.权利要求5所述的载体，该载体含有与cDNA可操作地连接的合适的转录或翻译调控 核苷酸序列，所述cDNA编码由氨基酸序列SEQ ID NO :4或SEQ ID NO :5构成的多肽。
9.权利要求8所述的载体，其中所述转录或翻译调控核苷酸序列源自哺乳动物、细菌、 病毒或昆虫基因。
10.权利要求8所述的载体，其中所述转录或翻译调控核苷酸序列是从由转录启动子、 操纵子或增强子和mRNA核糖结合位点构成的群组中选出的。
11.权利要求5所述的载体，该载体还含有合适的信号肽，天然状态下该信号肽不与由 氨基酸序列SEQ ID NO :4或SEQ IDNO 5构成的多肽连接。
12.权利要求5所述的载体，该载体的形式为病毒载体、噬菌体或质粒。
全文摘要
本发明涉及倍半萜烯合成酶及其制备和使用方法。一个实施方案中，本发明提供了含有文中所述核苷酸序列的核酸，该核苷酸序列编码至少一种倍半萜烯合成酶。另一实施方案中，本发明还提供了倍半萜烯合成酶及其制备和使用方法。例如，本发明的倍半萜烯合成酶可用于将法呢基焦磷酸酯转化为各种氧化的和脂肪族倍半萜烯，包括朱栾倍半萜、二环-吉马烯、荜澄茄醇和δ-杜松烯。
文档编号C12N15/00GK101914559SQ201010239230
公开日2010年12月15日 申请日期2003年10月2日 优先权日2002年10月4日
发明者安东尼·克拉克, 米歇尔·沙尔克 申请人:弗门尼舍有限公司