Rna干扰酶及其使用方法

Rna干扰酶及其使用方法
【专利摘要】本发明涉及的是新型酶家族的发现，该家族在这里被命名为mRNA干扰酶家族，它们表现出核糖核酸内切酶活性。因此，本发明
【发明者】的新发现，提出了新的应用，其中mRNA干扰酶核酸和氨基酸序列以及其组合物可以被有利地使用。本发明还包括筛选方法以鉴定能够调节mRNA干扰酶活性的化合物/因子以及使用这些化合物/因子的方法。还提供了包含mRNA干扰酶核酸和/或氨基酸序列、与mRNA干扰酶活性相容的缓冲液以及使用说明材料的试剂盒。
【专利说明】RNA干扰酶及其使用方法
[0001]本申请是申请日为2004年6月14日、申请号为200480023092.X、发明名称为“RNA干扰酶及其使用方法”的发明专利申请的分案申请。
发明领域
[0002]本发明涉及的是分子生物学领域，特别是新型酶活性的发现。特别地，本发明涉及的是对这里命名为mRNA干扰酶(interferase)的一个新型蛋白质家族的鉴定。这里描述的家族的示例成员包括MazF和PemK，以及它们的同源物和直向同源物(ortholog)。更为特别的是本发明涉及的是对作为核糖核酸内切酶或者mRNA干扰酶的MazF和PemK多肽的生化性质表征。发明还包括了对相关蛋白的分析，这些蛋白的作用是抑制mRNA干扰酶的活性。特别地，这里描述了对MazE蛋白质功能及其对MazF活性影响的表征，以及对PemI蛋白质功能及其对PemK活性影响的表征。这里还提供了对于新型mRNA干扰酶例如MazF和PemK、以及MazF和PemK活性的调节剂例如MazE和PemI的使用方法，它们可以用于研究和治疗性应用。
[0003]发明背景[0004]在大肠杆菌中，程序性细胞死亡是通过由两个基因组成的“上瘾组件”介导的，其中一个基因编码稳定的毒性蛋白(毒素)，另一个基因编码短寿的抗毒素(Engelberg-Kulkaand Glaser, Annu RevMicrobiol53, 43-70 (1999))。毒素和抗毒素由一个操纵子共同表达，相互作用形成一个稳定的复合物，它们的表达由毒素-抗毒素复合物或者抗毒素自身自动调节。例如当逆境条件抑制了它们的共表达时，抗毒素被蛋白酶降解，使毒素作用于其靶标。这种细菌细胞程序性死亡的遗传系统已经在许多大肠杆菌染色体外元件中有所报导，即所谓的分离后杀死效应(Tsuchimoto et al., J Bacteriol 170，1461-6 (1988) ; Robertsand Helinski, J Bacterioll74, 8119-32 (1992))。当细菌丢失了质粒或者其他染色体外元件时，细胞被选择性地杀死，因为不稳定的抗毒素相对于其相关的稳定毒素降解得更快。因此细胞嗜好短寿的抗毒素，因为它们的从头合成对于细胞的存活是必需的。
[0005]在大肠杆菌染色体上已知的上瘾组件(addiction module)中(Gotfredsenand Gerdes,Mol Microbiol29, 1065-76 (1998) ;mittenhuber, J Mol MicrobiolBiotechnoll, 295-302(1999))，大肠杆菌MazEF系统是第一个已知的原核染色体上瘾组件(Aizenman et al., Proc Natl AcadSci USA93, 6059-63 (1996))。mazEF组件由两个重叠的基因mazE和mazF组成，它们位于relA基因的下游。MazF是一个稳定的毒素，而MazE是一个不稳定的抗毒素，很容易在体内被ATP依赖的ClpPA丝氨酸蛋白酶降解(Aizenman etal.,Proc Natl Acad Sci USA93, 6059-63 (1996))。mazEF 的表达被鸟嘌呤核苷 3’，5’- 二焦磷酸(PPGpp)负调控，ppGpp是在严重的氨基酸饥饿条件下由RelA合成的(Aizenman etal.,Proc Natl Acad Sci USA93, 6059-63 (1996))。而且，mazEF 介导的细胞死亡可以被一些抗生素包括利福霉素、氯霉素和壮观霉素(Sat et al., J Bacterioll83, 2041-5(2001))所引发。使用大肠杆菌细胞进行的体内实验结果提示MazF抑制了蛋白质的合成和 DNA 的复制(Pedersen et al.,Mol Microbiol45, 501-10 (2002))。最近报导了无胸腺嘧唳的死亡是通过mazEF组件介导的(B.Sat, M.Reches, H.Engelberg-Kulka, JBacterioll85, 1803-7(2003))。
[0006]在大肠杆菌中，已知染色体外的一些元件含有上瘾组件，并且通过所谓的分离后杀死效应导致细菌的程序性细胞死亡。研究最透彻的染色体外上瘾组件包括噬菌体 Pl 上的 phd-doc 系统(Lehnherr et al.(1993) J Mol Biol233, 414-428;Gazitand Sauer.(1999)J Biol Chem274, 168 13-168 18;Magnuson et al.(1996)J Biol Chem271, 18705-18710;Lehnherr and Yarmo I insky.(1995)Proc NatlAcad Sci USA92, 32743277)，F 因子上的 ccdA-ccdB 系统(Tam and Kline.(1989) JBacterioll71,2353-2360;Bahassi et al.(1999)J Biol Chem274, 10936-10944;Afifet al.(2001)Mol MicrobioI 4 I，73-82;Dao-Thi et al.(2002)J BiolChem277, 3733-3742)，质粒 Rl 上的 kis-kid 系统(Ruiz-Echevarria et al.(1991)MolMicrobiol5, 2685-2693;Hargreaves et al.(2002)Structure (Camb) 10, 1425-1433;Ruiz-Echevarria et al.(1995)J Mol Biol247,568-577;Santos-Sierra et al.(2003)Plasmid50, 120-130)以及质粒 RlOO 上的 peml-pemK 系统(Tsuchimoto et al.(1992) J Bacterioll74, 42054211;Tsuchimoto et al.(1988)J Bacterioll70,1461-1466;Tsuchimoto and Ohtsub0.(1993)Mol Gen Genet237, 81-88;Tsuchimoto and Ohtsub0.(1989)Mol Gen Genet215，463-468)。有趣的是，大肠杆菌染色体也含有一些上瘾组件系统，例如 relBE 系统(Gotfredsen and Gerdes.(1998)Mol Microbiol29, 1065-1076;Christensen et al.(2001)Proc Natl Acad Sci USA98, 14328-14333;Christensen and Gerdes.(2003)Mol Microbiol48, 1389-1400;Pedersen et al.(2003)Cellll2, 131-140)，mazEF系统(Aizenman et al.(1996) Proc Natl Acad Sci USA93, 6059-6063;Marianovsky etal.(2001) J Biol Chem276, 5975-5984;Kamada et al.(2003)Mol Cel111, 875-884;Zhanget al.(2003) J Biol Chem278,32300-32306)以及 chpB 系统(Santos Sierra etal.(1998)FEMS Microb iol Lettl68, 51-58;Masuda et al.(1993)J Bacteriol175，6850-6856;Christensen et al.(2003)J Mol Biol332, 809-819)。
[0007]与上瘾组件相关的毒素的细胞作用已经被深入研究。ccdA-ccdB系统中的毒素ccdB与DNA解旋酶相互作用阻止了 DNA的复制(Bahassi et al.(1999)同上；Kampraniset al.(1999) J Mol Biol293，733-744)，relBE系统中的毒素RelE以高度的密码子特异性切割核糖体A位点的mRNA，但是不能降解自由的RNA(PederSen et al.(2003)，同上)。但是最近表明，A位点的mRNA切割可以在没有RelE的情况下出现(Hayes and Sauer.(2003)Mol Celll2，903-911)。因此，A位点mRNA切割的确切机制还不知道。mazEF系统编码的毒素MazF (ChpAK)和chpB系统编码的毒素ChpBK被认为通过一个与RelE的作用相似的机制，通过核糖体依赖和密码子特异的方式抑制翻译(Christensen et al.(2003),同上)。但是本发明的
【发明者】最近证明MazF是一个序列特异的核糖核酸内切酶，它只对单链RNA起作用，优先切割ACA序列处的mRNA，切割方式不依赖于核糖体和密码子，因此在功能上与RelE不同(Zhang et al.(2003)Mol Celll2, 913-923)。
[0008]peml-pemK系统和kis-kid系统分别参与了对两个密切相关的incFII低拷贝质粒即质粒 RlOO (Tsuchimoto et al.(1992)同上；Tsuchimoto et al.(1988)同上)和 Rl (Ruiz-Echevarria et al.(1991)同上；Bravo et al.(1987)Mol GenGenet210, 101-110)的稳定维护。现在知道这两个系统是相同的(Engelberg-Kulka andGlaser.(1999)，同上)。已经证明Kid(PemK)抑制了 ColEl质粒的复制，它在DNA合成的起始时起作用，但是不抑制P4DNA的体外复制(Ruiz-Echevarria et al.(1995)同上)。至今为止，还没有证据显示Kid(PemK)抑制染色体DNA的复制。毒素Kid(PemK)和解毒剂Kis(PemI)不仅仅在细菌中起作用，而且在许多真核生物中有效作用。Kid(PemK)抑制酵母、非洲爪蟾(Xenopus Iaevis)和人细胞的增殖,其中Kis (PemI)解除了这种抑制(de IaCueva-Mendez et al.(2003)Embo J22, 246-251)。已经证明 Kid(PemK)引发了人细胞的凋亡(de la Cueva-Mendez et al.(2003)同上)。这些结果提示Kid (PemK)在原核和真核生物中有一个共同的靶标。
[0009]这里引用的文献不应该被理解为承认它们是本发明的现有技术。
[0010]本发明的其他特点和优点从发明详述、附图和权利要求中会变得明确。
[0011]发明概述
[0012]在第一方面，本发明涉及的是一个新型酶家族的发现，该酶在这里也被称为“RNA干扰酶”。正如这里所描述的，mRNA干扰酶家族中示例性的核糖核酸内切酶包括MazF和PemK及其同源物和直向同源物。因此本发明包括具有与MazF或PemK多肽同源的序列和/或同源的结构的核糖核酸内切酶。
[0013]值得注意的是，在本发明的发现以前，MazF的细胞靶标还没有被发现。而且，本发明还涉及了以下发现 ，即PemK通过以序列特异的方式切割细胞mRNA阻断蛋白质的合成。因此本发明
【发明者】的新发现提出了 mRNA干扰酶(例如MazF和/或PemK)的新型应用，其中mRNA干扰酶的核酸和氨基酸序列及其组合物可以被有利地使用。这种使用包括，但是不限于，多种不同的研究和治疗性应用，如在这里以下描述的。还提供了包含mRNA干扰酶(例如MazF和/或PemK)核酸和/或氨基酸序列、与mRNA干扰酶活性相容的缓冲液以及用法说明材料。
[0014]本发明还提供了检测mRNA干扰酶或者其功能性片段活性的方法，其中所述的活性是核糖核酸内切酶活性，所述的方法包括:(a)提供编码所述mRNA干扰酶或者其功能性片段的核酸序列；(b)表达(a)步骤中的核酸序列；(c)将步骤(b)中表达的核酸序列与核糖核酸内切酶底物共同孵育；以及(d)测量所述底物的切割，其中所述底物的切割显示了核糖核酸内切酶活性并且提供了检测手段或者是mRNA干扰酶或者其功能性片段的核糖核酸内切酶活性的阳性指示。
[0015]本发明还包括了鉴定能够调节mRNA干扰酶或者其功能性片段活性的因子的筛选方法，其中所述的活性是核糖核酸内切酶活性，所述的方法包含:(a)提供编码所述mRNA干扰酶或者其功能性片段的核酸序列；(b)表达(a)步骤中的核酸序列；(C)在能够促进核糖核酸内切酶活性的条件下将步骤(b)中表达的核酸序列与核糖核酸内切酶底物共同孵育；(d)加入至少一种有可能调节mRNA干扰酶或者其功能性片段的核糖核酸内切酶活性的因子；以及(e)测量所述底物的切割，其中所述底物的切割显示了核糖核酸内切酶活性并且提供了检测核糖核酸内切酶活性的手段或者是mRNA干扰酶或者其功能性片段的阳性指示，其中在至少一种能够调节mRNA干扰酶或者其功能性片段核糖核酸内切酶活性的因子存在时被切割底物量的改变鉴定出了一种能够调节mRNA干扰酶或者其功能性片段核糖核酸内切酶活性的因子。这些方法在体外或者在细胞内进行。[0016]这种使用本发明的方法确定的因子，能够调节mRNA干扰酶或者其功能性片段的核糖核酸内切酶活性，可以引起底物切割增加或者减少。本发明还包括了使用本发明的方法鉴定出的因子。
[0017]另一方面，提出了调节mRNA干扰酶或者其功能性片段活性的方法，其中所述的活性是核糖核酸内切酶活性，所述的方法包含:(a)提供编码所述mRNA干扰酶或者其功能性片段的核酸序列；(b)表达(a)步骤中的核酸序列；(c)在能够促进核糖核酸内切酶活性的条件下将步骤(b)中表达的核酸序列与核糖核酸内切酶底物共同孵育；(d)加入能够调节mRNA干扰酶或者其功能性片段核糖核酸内切酶活性的因子；以及(e)测量所述底物的切害I]，其中所述底物的切割显示了核糖核酸内切酶活性并且提供了检测核糖核酸内切酶活性的手段或者是mRNA干扰酶或者其功能性片段的阳性指示，其中在该因子存在时被切割底物量的改变提供了调节mRNA干扰酶或者其功能性片段核糖核酸内切酶活性的手段。
[0018]示例性的编码mRNA干扰酶的核酸序列包括，但是不限于，SEQ ID NO:1或者3，和编码SEQ ID NO:2或者4的核酸序列，以及在这里以下描述的其同源物和直向同源物。其一个示例性的同源物/直向同源物是MazF-mtl，包含分别包含SEQ ID NO:69和74的核酸和氨基酸序列。
[0019]在另一个实施方案中，提供了检测mRNA干扰酶或者其功能性片段活性的方法，其中所述的活性是核糖核酸内切酶活性，所述的方法包含:(a)提供包含mRNA干扰酶的氨基酸序列；(b)在能够促进核糖核酸内切酶活性的条件下将步骤(a)的氨基酸序列与核糖核酸内切酶底物共同孵育；以及(c)测量所述底物的切割，其中所述底物的切割显示了核糖核酸内切酶活 性并且提供了检测手段或者是mRNA干扰酶或者其功能性片段的核糖核酸内切酶活性的阳性指示。
[0020]本发明还包括了鉴定能够调节mRNA干扰酶或者其功能片段活性的因子的筛选方法，其中所述的活性是核糖核酸内切酶活性，所述的方法包含:(a)提供包含mRNA干扰酶的氨基酸序列；(b)在能够促进核糖核酸内切酶活性的条件下将步骤(a)的氨基酸序列与核糖核酸内切酶底物共同孵育；(c)加入至少一种有可能调节mRNA干扰酶或者其功能性片段的核糖核酸内切酶活性的因子；以及(d)测量所述底物的切割，其中所述底物的切割显示了核糖核酸内切酶活性并且提供了检测mRNA干扰酶或其功能性片段的核糖核酸内切酶活性的手段，其中在所述至少一种因子存在时被切割底物量的改变确定了能够调节mRNA干扰酶或者其功能性片段核糖核酸内切酶活性的因子。这些方法可以在例如体外或者在细胞内进行。
[0021]使用这些方法确定的因子，能够调节mRNA干扰酶或者其功能性片段的核糖核酸内切酶活性，可以实现底物切割的增加或者减少。这种调节性因子是在本发明范畴内的。应当理解这种因子可以，例如通过作用于mRNA干扰酶(毒素)或者其抗毒素(例如各自PemI，MazE，或者二者中一个的功能性和/或结构性同源物或直向同源物的抗毒素)，或者通过改变自我调节反馈机制(毒素-抗毒素复合物借此下调毒素和抗毒素基因的表达)，调节mRNA干扰酶的核糖核酸内切酶(例如PemK，MazF或者功能性和/或结构性同源物或直向同源物)活性。能够改变自我调节反馈机制(毒素-抗毒素复合物借此下调毒素和抗毒素基因的表达)的因子能够改变这些基因的协调调控。在该实施方案的一方面，能够降低毒素-抗毒素复合物形成的因子抑制了抗毒素的作用，导致毒素活性的增加，最终导致细胞死亡。另一方面，涉及了能够阻断抗毒素和毒素基因表达的因子，其中该因子导致毒素水平由于毒素的稳定性质，相对于抗毒素水平的增加。这种不平衡也会导致细胞毒性。
[0022]因此，这种因子可以有利地用于治疗具有细菌感染的受试对象，特别是那些被对抗生素有抗性的细菌菌株感染的受试对象。这种因子属于本发明的范畴内并且可以单独使用或者联合使用。
[0023]还提供了调节mRNA干扰酶或者其功能性片段活性的方法，其中所述的活性是核糖核酸内切酶活性，所述的方法包含:(a)提供mRNA干扰酶的氨基酸序列；(b)在能够促进核糖核酸内切酶活性的条件下将步骤(a)的氨基酸序列与核糖核酸内切酶底物共同孵育；(c)加入能够调节mRNA干扰酶或者其功能性片段的核糖核酸内切酶活性的因子；以及(d)测量所述底物的切割，其中所述底物的切割显示了核糖核酸内切酶活性并且提供了检测核糖核酸内切酶活性的手段或者是mRNA干扰酶或者其功能性片段的阳性指示，其中在该因子存在时被切割底物量的改变提供了调节mRNA干扰酶或者其功能性片段核糖核酸内切酶活性的手段。这些方法可以在例如基于细胞的检测中(在培养中或者在受试对象如非人类的动物或者人类患者中)或者在体外使用。
[0024]根据本发明，包含mRNA干扰酶的示例性氨基酸序列包括，但不限于，SEQ ID NO:2或者4以及这里在下面描述的其同源物和直向同源物。其示例性的同源物/直向同源物是MazF-mtl,它包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列。
[0025]本发明还包括在细胞中检测mRNA干扰酶或者其功能性片段活性的方法，其中所述的活性是核糖核酸内切酶活性，所述的方法包括:(a)提供包含表达载体的细胞，该载体包含编码mRNA干扰酶的核酸序列，和/或编码包含mRNA干扰酶的氨基酸序列，以及该载体可选择地包括至少一个调控序列；(b)在促进至少一种细胞底物核糖核酸内切酶活性的条件下孵育步骤(a)中的细胞；以及(c)测量所述的至少一种细胞底物的切割，其中所述的至少一种细胞底物的切割显示了核糖核酸内切酶活性并且提供了检测细胞中mRNA干扰酶或者其功能性片段的核糖核酸内切酶活性的手段。
[0026]一方面，提出了在细胞中调节mRNA干扰酶或者其功能性片段活性的方法，其中所述的活性是核糖核酸内切酶活性，所述的方法包含:(a)提供包含表达载体的细胞，该载体包含编码mRNA干扰酶的核酸序列，和/或编码包含mRNA干扰酶的氨基酸序列，以及该载体可选择地包括至少一个调控序列；(b)在促进至少一种细胞底物核糖核酸内切酶活性的条件下孵育步骤(a)中的细胞；(c)加入能够调节mRNA干扰酶或者其功能性片段核糖核酸内切酶活性的因子；以及(d)测量所述的至少一种细胞底物的切割，其中所述的至少一种细胞底物的切割显示了核糖核酸内切酶活性并且提供了检测细胞中mRNA干扰酶或者其功能性片段的核糖核酸内切酶活性的手段，且其中在该因子存在的情况下至少一种被切割底物量的改变提供了调节mRNA干扰酶或者其功能性片段的核糖核酸内切酶活性的手段。
[0027] 还提出的是筛选方法，以鉴定在细胞中能够调节mRNA干扰酶或者其功能片段活性的因子，其中所述的活性是核糖核酸内切酶活性，所述的方法包含:(a)提供包含表达载体的细胞，该载体包含编码mRNA干扰酶的核酸序列，和/或编码包含mRNA干扰酶的氨基酸序列，以及该载体可选择地包括至少一个调控序列；(b)在促进至少一种细胞底物核糖核酸内切酶活性的条件下孵育步骤(a)中的细胞；(c)加入至少一种有可能调节mRNA干扰酶或者其功能性片段活性的因子；以及(d)测量所述的至少一种细胞底物的切割，其中所述的至少一种细胞底物的切割显示了核糖核酸内切酶活性并且提供了检测细胞中mRNA干扰酶或者其功能性片段的核糖核酸内切酶活性的手段，且其中在该因子存在的情况下至少一种被切割底物量的改变鉴定出了能够调节mRNA干扰酶或者其功能性片段的活性的因子。
[0028]根据本发明，包含表达载体(表达载体包含编码mRNA干扰酶的核酸)的细胞包含的核酸序列包括，但是不限于，SEQ ID NO:1或3，以及这里描述的其同源物和直向同源物；以及编码SEQ ID NO:2和4的核酸序列及这里描述的其同源物和直向同源物。示例性的其同源物和直向同源物是MazF-mtl，分别包含含有SEQ ID NO:69和74的核酸和氨基酸序列。
[0029]还提供的是组合物，组合物包含至少一种mRNA干扰酶或者其功能性片段、编码mRNA干扰酶的核酸序列，和/或使用本发明的方法确定的mRNA干扰酶调节性因子，以及药物上可以接受的缓冲剂。
[0030]一方面，提供了用于治疗具有疾病的患者的方法，所述的方法包含向所述的患者施用治疗上有效量的本发明组合物，以减轻所述疾病的症状。组合物包含至少一种能够增加或者降低核糖核酸内切酶底物切割的因子，这取决于困扰患者的疾病，以缓解疾病的症状。
[0031]因此，本发明包括使用治疗有效量的mRNA干扰酶或者其功能性片段、编码mRNA干扰酶的核酸序列或者mRNA干扰酶调节性因子来制备药物，用于治疗具有疾病的患者以缓解所述疾病的症状。这种药物还可以进一步包含药物上可以接受的缓冲剂。
[0032]疾病例如细菌感染是可以通过向患者施用包含治疗有效量的至少一种分子或者因子的组合物而被治疗的，所述的分子或者因子能够增加核糖核酸内切酶底物的切割，通过减少患者体内细菌的数目来缓解细菌感染的症状。在细菌感染包含至少一种抗生素抗性细菌菌株时使用这种方法 具有特别的优势。
[0033]本发明的方法在过度增生性疾病的治疗中也是有用的，其中将包含治疗有效量的至少一种分子或者因子(能够增加对核糖核酸内切酶底物的切割)的本发明组合物施用给患者，以通过减少患者中的过度增生性细胞，缓解过度增生性疾病的症状。可以使用本发明的组合物和方法治疗的过度增生性疾病(其特征是细胞增殖的失调)，包括，但是不限于，不同组织的发育异常和组织变形、炎性病症、自体免疫疾病、过度增生性皮肤疾病、牛皮癣、过敏/哮喘、动脉粥样硬化、血管成形手术后的再狭窄以及癌症。
[0034]本发明还包括治疗具有疾病的患者的方法,所述的方法包含向患者施用治疗有效量的本发明组合物，其中至少一种所述组合物的因子实现了对核糖核酸内切酶底物的切割的降低，以缓解所述疾病的症状。
[0035]还包括在细胞中制备多肽的方法，所述的方法包括:(a)用编码所述多肽的核酸序列转染所述的细胞，其中编码所述多肽的核酸序列被突变，使用另外的三联体密码子替换mRNA干扰酶识别序列，其中由所述的突变核酸序列编码的所述多肽的氨基酸序列没有因为所述的突变而改变；(b)使用编码mRNA干扰酶的核酸序列转染所述的细胞，其中所述的mRNA干扰酶识别所述的mRNA干扰酶识别序列；以及(c)在所述的细胞中表达步骤(a)和(b)的核酸序列，其中在所述的细胞中表达步骤(a)和(b)的核酸序列提供了在所述细胞中制备多肽的方法。
[0036]根据本发明，编码多肽或者mRNA干扰酶的核酸序列可以分别被包括在第一和第
二表达载体中。而且，步骤(a)和(b)的转染步骤可以分开或者同时(例如通过共转染)进行。正如在这里以上所表明的，核酸序列中mRNA干扰酶识别序列突变为不同的三联体序列或者密码子不会改变由突变核酸序列编码的多肽的氨基酸序列。因此，就被编码多肽的氨基酸序列而言，突变是沉默突变。突变核酸序列的目的是显著降低该核酸转录出的mRNA对于所讨论的mRNA干扰酶的核糖核酸内切酶活性降解的敏感性。步骤(b)的核酸(例如编码例如PemK多肽或者其功能性片段、或者MazF多肽或者其功能性片段、或者MazF或PemK的同源物或直向同源物的核酸序列)的表达降低或者抑制了由包含mRNA干扰酶识别序列的核酸序列编码的细胞多肽的合成。因此，该方法产生了几乎没有细胞蛋白的所需多肽，所述细胞蛋白的RNA转录本包含被所表达的mRNA干扰酶识别的mRNA干扰酶识别序列。因此该方法提供了在细胞中制备“纯化的”多肽的方法。对于一些应用，该方法还包含在步骤(c)之前或者当中，将细胞在包含至少一种放射性标记同位素的培养基中孵育。这些应用包括，但是不止限于，制备标记的多肽，用于使用核磁共振(NMR)技术进行接下来的分析。
[0037]在一个特别的实施方案中，在细胞中制备多肽的方法使用了 mRNA识别序列腺嘌呤-胞嘧啶-腺嘌呤(ACA)以及包含SEQ ID NO:2的mRNA干扰酶MazF或者其功能性片段。在该实施方案中，编码MazF或者其功能性片段的核酸的表达降低或者抑制了由包含ACA序列的核酸序列编码的细胞多肽的合成。
[0038]在另一个实施方案中，在细胞中制备多肽的方法使用了 mRNA识别序列尿嘧啶-腺嘌呤-X (UAX)，其中X是胞嘧啶(C)，A，或U，以及包含SEQ ID NO:4的mRNA干扰酶PemK或者其功能性片段。在该实施方案中，编码PemK或者其功能性片段的核酸的表达降低或者抑制了由包含UAX序列的核酸序列编码的细胞多肽的合成。
[0039]在另一个实施方案中，在细胞中制备多肽的方法使用了 mRNA识别序列尿嘧啶-腺嘌呤-C(UAC),以及包含SEQ ID NO:74的mRNA干扰酶MazF-mtl或者其功能性片段。在该实施方案中，编码MazF-mtl或者其功能性片段的核酸的表达降低或者抑制了由包含UAC序列的核酸序列编码的细 胞多肽的合成。
[0040]在本发明的一个方面中，提出了制备多肽的方法，包含:(a)提供编码所述多肽的核酸序列，其中编码所述多肽的核酸序列被突变，以用另外的三联体密码子替代mRNA干扰酶的识别序列，其中由所述突变核酸序列编码的所述多肽的氨基酸序列没有由于所述的突变而被改变；(b)提供编码mRNA干扰酶的核酸序列，其中所述的mRNA干扰酶识别所述的mRNA干扰酶识别序列；以及(c)表达步骤(a)和(b)的核酸序列，其中表达步骤(a)和(b)的核酸序列提供了制备多肽的手段。该方法可以在体外进行，例如在试管内或者类似地进行。在本领域内以及以下的描述中已知适宜的体外转录/翻译系统或者无细胞表达系统。mRNA干扰酶或者其片段可以可选择地作为表达蛋白提供，而不是以需要表达的核酸序列形式。
[0041]在一个特别的实施方案中，制备多肽的方法使用了 mRNA识别序列ACA以及包含SEQ ID NO:2的mRNA干扰酶MazF或者其功能性片段。
[0042]在另一个实施方案中，制备多肽的方法使用了 mRNA识别序列UAX以及包含SEQ IDNO:4的mRNA干扰酶PemK或者其功能性片段，其中X是C、A或U。
[0043]在另一个实施方案中，制备多肽的方法使用了 mRNA识别序列UAC以及包含SEQ IDNO:74的mRNA干扰酶MazF-mtl或者其功能性片段。
[0044]本发明还涉及使用本发明的mRNA干扰酶制备多个多核糖核苷酸序列的方法。该方法包含:(a)提供第一和第二核酸序列，其中所述的第一核酸序列的一个区域与所述的第二核酸序列的一个区域互补，且所述的第一和第二核酸序列的互补区域都不包含与mRNA干扰酶识别位点互补的序列，且所述的第一和第二核酸序列在它们的5’末端都被磷酸化；(b)通过所述的第一和第二核酸序列的互补区域使所述的第一和第二核酸序列退火，形成双链的核酸序列，其包含侧翼为单链突出端的互补区域，其中每一个单链突出端包含至少一个与mRNA干扰酶识别位点互补的序列，且所述的单链突出端互相互补；(c)通过互补的单链突出端连接已经退火的第一和第二核酸序列，形成包含多个退火的第一和第二核酸序列的串联重复的多联体(concatamer) ； (d)使用第一引物(包含T7启动子以及与所述的第一核酸序列互补的区域)和第二引物(与所述的第二核酸序列互补)扩增所述的多联体，其中所述的扩增产生多个包含T7启动子的多联体；(e)使用T7RNA聚合酶从所述的多个多联体转录出RNA分子，其中每一个所述的RNA分子包含多个侧翼为mRNA干扰酶识别位点的多核糖核苷酸序列的串联重复；以及(f)使用能够在所述的干扰酶识别位点处切割RNA的mRNA干扰酶消化所述的RNA分子，其中所述的消化产生多个所述多核糖核苷酸序列。
[0045]在制备多个多核糖核苷酸序列的方法的一个特别方面，mRNA识别序列是ACA序列，且mRNA干扰酶是包含SEQ ID NO:2的MazF或者其功能性片段。[0046]在制备多个多核糖核苷酸序列的方法的另一个方面，mRNA识别序列是UAX序列，其中X是C、A或者U，且mRNA干扰酶是包含SEQ ID NO:4的PemK或者其功能性片段。
[0047]在制备多个多核糖核苷酸序列的方法的另一个方面，mRNA识别序列是UAC序列，且mRNA干扰酶是包含SEQ ID NO:74的MazF-mtl或者其功能性片段。
[0048]本发明还涉及分离的核酸序列，其编码的多肽与SEQ ID NO: 2或者SEQ ID NO:4或其功能性片段具有序列和/或结构同源性，其中所述的多肽能够表现出核糖核酸内切酶活性。在一个实施方案中，具有与SEQ ID NO:2或其功能性片段序列和/或结构同源性的多肽是MazF的直向同源物，它能够表现出核糖核酸内切酶活性。能够表现出核糖核酸内切酶活性的多肽包括，但是不止限于，耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans)MazF(NP_244588.1),表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis) MazF(AAG23809.1),金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) MazF(NP_372592.1),枯草芽抱杆菌(Bacillus subtil is) MazF (1NE8_A),脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitides)MazF(NP_266040.1),摩氏摩根氏菌(Morganella morgani)MazF(AAC82516.1)和结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis) MazF (NP_217317.1)。
[0049]在另一个实施方案中，具有与SEQ ID NO:4或其功能性片段序列和/或结构同源性的多肽是PemK同源物或者直向同源物，它能够表现出核糖核酸内切酶活性。能够表现出核糖核酸内切酶活性的多肽包括，但是不止限于，PemK蛋白质家族的73个已知成员，包括MazF(ChpAK)，ChpBK以及其他的类PemK蛋白。下面是一个在网站上找到的这些蛋白名称的清单(http://pfam.wustl.edu/cg1-bin/getdesc?acc=PF02452): Q9RX98; Q8F5A3; Q9K6K8;CHPA_EC0LI;Q7NPF9;Q88TP7;Q7WWW1;Q8YS80;Q8DW95;Q82YR2;Q7X3Y1;Q93S64;Q8PRN1;Q8GFYl;052205;PEMK_EC0LI Q7N4H2;Q88PS7;Q8XCF2CHPB_EC0LI;Q82VU0;Q8UGU5;Q9RWK4;Q9PHH8;Q7TXU4;P71650;Q7U1Y5;P96295;Q9JWF2;Q9JXII;Q8E882;Q82VB5;Q8KJS3;Q7NMY4;Q9KFF7;P96622;Q81IT4;Q81VF4;Q8ESK5;Q92DC7;Q8Y8L0;Q97LR0;Q8XNN7;Q8R861;Q88Z43;007123;Q837I9;Q9F7V5;Q8CRQ1;005341;P95840;Q9FCV0;Q837L1;Q93M89;Q99IU9;Q82UB5;Q93MT8;YJ91_MYCTU;Q97MV8;Q7NHW0;Q7NI95;Q8YML2;Q7NHR3;YE95_MYCTU;Q9PCB9;Q8YZW8;Q7TZ90;P95272;Q8VJR1;Q7U0N2;053450;006780;和 Q7U118。
[0050]本发明还包括了表达载体，它们包含了分离的核酸序列，其编码的多肽具有SEQID NO:2或4或其功能性片段的序列和/或与SEQ IDNO:2或4或其功能性片段具有结构同源性，其中所述的多肽能够表现核糖核酸内切酶活性。还包括包含这些表达载体的细胞以及包含本发明分离核酸序列的转基因动物，其中核酸序列在转基因动物的至少一个细胞中表达。
[0051]在本发明的另一方面，提出了分离的氨基酸序列，其包含的多肽具有SEQ ID NO:2或4或其功能性片段的序列和/或与SEQ ID NO:2或4或其功能性片段具有结构同源性，其中所述的多肽能够表现核糖核酸内切酶活性。还包括了编码本发明氨基酸序列的表达载体，其中氨基酸序列的表达由表达载体内的调控序列控制，也包括包含这种表达载体的细胞以及包含本发明氨基酸序列的转基因动物，其中氨基酸序列在转基因动物中的至少一个细胞中表达。
[0052]在本发明的另一方面，提供了包含SEQ ID NO:1或者SEQ ID NO:3的分离核酸序列。其中的核酸序列编码能够表现出核糖核酸内切酶活性的mRNA干扰酶或者其功能性片段。
[0053]本发明还描述了包含SEQ ID NO:1或者SEQ ID NO:3的核酸序列的表达载体，其中的核酸序列编码能够表现出核糖核酸内切酶活性的mRNA干扰酶或者其功能性片段，且SEQ ID NO:1或者SEQ I D NO:3与调控序列有效连接。而且包含这种表达载体的细胞也属于本发明的范畴。
[0054]另一方面，提出了转基因动物，其核酸序列包含SEQ ID NO:1或者SEQ ID NO:3，其中的核酸序列编码能够表现出核糖核酸内切酶活性的mRNA干扰酶或者其功能性片段，且其中核酸序列在转基因动物中的至少一个细胞中表达。
[0055]还提供了编码包含SEQ ID NO:2或者SEQ ID NO:4的多肽的分离的核酸序列，其中的多肽是mRNA干扰酶或者其功能性片段，能够显示核糖核酸内切酶活性。
[0056]另一方面，提供了包含分离核酸序列的表达载体，所述的核酸序列编码包含SEQID NO:2或者SEQ ID NO:4的多肽，其中的多肽是能够表现出核糖核酸内切酶活性的mRNA干扰酶或者其功能性片段，并且核酸序列与调控序列有效连接。本发明还包括了包含这些表达载体的细胞。
[0057]另一方面，提出了转基因动物，其包含的分离核酸序列编码包含SEQ ID N0:2或者SEQ ID NO:4的多肽，其中多肽是能够表现出核糖核酸内切酶活性的mRNA干扰酶或者其功能性片段，且核酸序列在转基因动物中的至少一个细胞中表达。
[0058]在本发明的一个实施方案中，提供了包含SEQ ID NO:2或者SEQ ID NO:4的分离氨基酸序列，其中的氨基酸序列是mRNA干扰酶或者其功能性片段，且mRNA干扰酶或者其功能性片段能够表现出核糖核酸内切酶活性。
[0059]本发明还描述了表达载体，其编码的分离氨基酸序列包含SEQ ID NO:2或者SEQID NO:4，其中的氨基酸序列是mRNA干扰酶或者其功能性片段，且mRNA干扰酶或者其功能性片段能够表现出核糖核酸内切酶活性，且氨基酸序列的表达受到表达载体中调控序列的控制。本发明还包括包含这种表达载体的细胞。[0060]另一方面，提出了包含分离多肽的转基因动物，所述多肽包含SEQID N0:2或者SEQ ID NO:4，其中多肽是能够表现出核糖核酸内切酶活性的mRNA干扰酶或者其功能性片段，且多肽在转基因动物中的至少一个细胞中表达。
[0061]本发明还包括试剂盒，其包含下列成分:分离的核酸序列，所述核酸序列包含SEQID NO:1或者SEQ ID NO:3，其中的核酸序列编码mRNA干扰酶或者其功能性片段；包含SEQID NO:2或者SEQ ID NO:4的分离氨基酸序列，其中的氨基酸序列是mRNA干扰酶或者其功能性片段；与mRNA干扰酶活性相容的缓冲剂；以及用法说明材料。
[0062]本发明还包括了本发明中mRNA干扰酶在涉及基因治疗方面的应用。也可以通过工程化使细胞表达分子，该分子在受试对象(例如人受试对象)中有缺陷或者缺乏，使该细胞通过整合本发明的mRNA干扰酶而自毁，mRNA干扰酶的表达受到可诱导调控元件的控制。在基因治疗应用中使用的用于细胞自毁的可诱导手段的整合，提供了一种自动防故障机制，这样可以在这种细胞为受试对象带来有利影响之后和/或在它们导致有害影响之前被清除掉。 [0063]附图的简要描述:
[0064]图1A和IB显示在不同固体培养基上的细胞增殖以及MazF RNA干扰酶家族不同成员的序列比对。图1A显示了分别转化了 pBAD-MazF, pBAD-MazF R29S或者pBAD_MazFR86G质粒的大肠杆菌BW25113 (AaraBAD)细胞的生长性质。图1B描绘了来自大肠杆菌的 MazF(GenBank Accession N0.NP_289336.1)与来自耐盐芽抱杆菌(GenBank 登录编号NP_244588.1),表皮葡萄球菌(GenBank登录编号AAG23809.1),金黄色葡萄球菌(GenBank登录编号NP_372592.1),枯草芽孢杆菌(GenBank登录编号1NE8_A)，脑膜炎奈瑟氏球菌(GenBank登录编号ΝΡ_266040.I),摩氏摩根氏菌(GenBank登录编号AAC82516.1)以及结核分枝杆菌(GenBank登录编号ΝΡ_217317.1)的MazF的序列比对。
[0065]图2Α-Ε显示了曲线图，描绘了 MazF对于甲苯处理的大肠杆菌细胞35S-Met的掺入(Fig.2A)、[ a -32PldTTP 的掺入(Fig.2B)以及[a -32P]UTP 掺入(Fig.2C)的影响；以及MazF对于体内35S-Met掺入到大肠杆菌细胞中(Fig.2D)的影响；以及SDS-PAGE分析MazF诱导后体内蛋白质的合成(Fig.2E)。
[0066]图3A-C显示了线性示踪(line trace)，描绘了多核糖体性质的光密度分析(图3A),它显示了 MazF对于多核糖体性质的影响，并且显示了蛋白质凝胶,表明MazF(His)Jf于原核(图3B)和真核(图3C)的无细胞蛋白质合成的影响。
[0067]图4A-D显不MazF对mRNA合成的影响。图4A显不在MazF存在时mazG mRNA的足止纹分析。图4B显示了用酹抽提后mazG mRNA的趾纹分析。图4C显示了 MazE对于MazF对mazG mRNA切割的影响。图4D显示加入阿拉伯糖后(如所示)在不同时刻从含有pBAD-MazF的大肠杆菌BW25113细胞中提取总细胞mRNA进行Northern印迹分析的结果，使用放射性标记的ompA和Ipp ORF DNA作为探针。
[0068]图5A和B显示线性示踪，显示了春日霉素不存在(图5A)和存在(图5B)时多核糖体性质的光密度分析。70S、50S和30S核糖体的位置如所示。
[0069]图6显示了趾纹分析,显示了核糖体对MazF对mazG mRNA切割的抑制。
[0070]图7显示了趾纹分析,显示了 mazG mRNA的Shine-Dalgarno序列由GGAG突变为UUUG对MazF功能的影响。[0071]图8显示了趾纹分析,显示了 mazG mRNA起始密码子的突变对于MazF功能的影响。
[0072]图9显示了趾纹分析，显示了在切割序列处UACAU(U1A2C3A4U5)的突变对MazF功能的影响。
[0073]图10显示了丙烯酰胺凝胶，显示了 MazF和MazE对于16S和23SrRNA切割的影响。
[0074]图11显示了对于纯化的MazE-MazF(His)6复合物、MazF以及(His)6MazE蛋白的分析，使用tricine SDS-PAGE分离蛋白和考马斯亮蓝染色观察。
[0075]图12A和12B显示了天然的聚丙烯酰胺凝胶,表明了在(His)6MazE和MazF之间化学计量形成的复合物。
[0076]图13显示了蛋白质分子量标准曲线的图线，图示了 MazF和MazE-MazF(His)6复合物的确定的分子量。
[0077]图14A, 14B 和 14C 显示了 EMSA 凝胶，图示了 (His)6MazE 和 / 或 MazF 与 mazEF 启动子DNA的结合。
[0078]图15显示了 MazE同源物氨基酸序列的比对。显示了 8个MazE家族蛋白质的序列比对。
[0079]图16A和16B显示了 EMSA凝胶，图示了蛋白质和DNA的相互作用。如图16A和16B所示，MazE的N端结构域介导了 DNA分别与MazE-MazF(His)6复合物以及(His)6MazE蛋白质的结合。
[0080]图17图示了 MazE及其截断产物，以及酵母双杂交试验的结果，表明了 MazF和MazE或者其截断产物/片段的相互作用。
[0081]图18A和18B分别显示了非变性聚丙烯酰胺凝胶，图示了蛋白质相互作用；以及图示了蛋白质一 DNA相互作用的EMSA凝胶。
[0082]图19图示了 MazE-MazF复合物的X射线结构。
[0083]图20A和20B显示了大肠杆菌MazF的核酸和氨基酸序列。
[0084]图2IA和2IB显示了大肠杆菌MazE的核酸和氨基酸序列。
[0085]图22A-22H显示了大肠杆菌MazF直向同源物的核酸序列。
[0086]图23A-23H显示了大肠杆菌MazF直向同源物的氨基酸序列。
[0087]图24A-24G显示了大肠杆菌MazE直向同源物的核酸序列。
[0088]图25A-25G显示了大肠杆菌MazE直向同源物的氨基酸序列。
[0089]图26A-C显示了 PemK对于DNA和蛋白质合成的影响。图26A和26B是曲线图，图示了 PemK对于体内DNA(A)和蛋白质⑶合成的影响。图26C显示了在PemK诱导之后总细胞蛋白的SDS-PAGE分析。
[0090] 图27A-C显示了 SDS-PAGE分离的蛋白质的放射性自显影。结果表明了 PemK和PemI对于无细胞蛋白质合成的影响。
[0091]图28A-E显示了聚丙烯酰胺凝胶(A)或者聚丙烯酰胺凝胶放射性自显影(B-E)的结果，表明PemK介导的核糖核酸内切酶活性。
[0092]图29A-B显示了聚丙烯酰胺测序凝胶(A)和聚丙烯酰胺凝胶放射性自显影(B)的结果，表明PemK介导的核糖核酸内切酶活性对单链RNA的特异性。
[0093]图30A-D显示了 Northern印迹分析(A)或者聚丙烯酰胺凝胶放射性自显影(B-D)的结果，图示了 PemK在体内介导了对各种不同的mRNA的内切核酸酶活性。[0094]图3IA和3IB显示了大肠杆菌PemK的核酸和氨基酸序列。
[0095]图32A和32B显示了大肠杆菌PemI的核酸和氨基酸序列。
[0096]图33显示了 PemK、ChpBK和MazF多肽的序列比对。
[0097]图34 显不了 PemK, ChpBK, MazF 和来自隐藏分枝杆菌(Mycobacterium celatum),恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida) KT2440 和弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri) 2astr.301的三个类PemK蛋白的序列比对。
[0098]图35显示了成熟人嗜酸性粒细胞趋化蛋白(eotaxin)的核酸和氨基酸序列(分别是 SEQ ID NO:67 和 68)。
[0099]图36是pCold I载体的示意图。
[0100]图37显示了聚丙烯酰胺凝胶放射性自显影的结果，显示了在没有背景蛋白质合成的情况下成熟人嗜酸性粒细胞趋化蛋白的产生。
[0101]图38A-F是显微镜照片，显示了被诱导表达MazF毒素(D-F)和未诱导(A-C)的人细胞的形态。
[0102]图39A-B显示了(A)用pET28a表达的MazF (E24A)突变体N端延伸的氨基酸序列；以及(B)聚丙烯酰胺凝胶的照片，显示了对应于切割的MazF突变体融合蛋白的条带(泳道O以及凝血酶切割的MazF突变体融合蛋白(泳道2)。
[0103]图40显示了 MazF-mtIm RNA干扰酶活性的引物延伸分析。图41A-B显示了(A)大肠杆菌MazF及其在结核分枝杆菌中的同源物的序列比对以及(B)大肠杆菌MazF及其在枯草芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)和金黄色葡萄球菌中的同源物的序列比对。
[0104]图42显示了 mazF开放阅读框(ORF)的RNA序列。所有的ACA序列用灰色显示，替换了 ACA序列而没有改变由其编码的MazF氨基酸序列的碱基改变在RNA序列的上方显
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[0105]图43A-E显示了在结核分枝杆菌中的大肠杆菌MazF同源物的核酸序列。
[0106]图44A-E显示了在结核分枝杆菌中的大肠杆菌MazF同源物的氨基酸序列。
[0107]图45A-D显示了来自隐藏分枝杆菌，恶臭假单胞菌KT2440和弗氏志贺氏菌2astr.301的三个类PemK和ChpBK的核酸序列。
[0108]图46A-D显示了来自隐藏分枝杆菌，恶臭假单胞菌KT2440和弗氏志贺氏菌2astr.301的三个类PemK蛋白和ChpBK的氨基酸序列。发明详述
[0109]在描述这里的发现及其使用方法之前，应当理解本发明不止限于这里描述的特定试验方法，或者试验化合物及试验条件，因为这些方法和化合物可能是多样的。还应当理解这里使用的术语目的仅仅是描述特定的实施方案，而不是要限制，因为本发明的范畴仅仅限于所附的权利要求。
[0110]因此，在说明书和权利要求中使用的术语"MazF"或"PemK"指的既有一般类型的核糖核酸内切酶，还有具有特定名称的特定酶，包括与其具有结构和序列同源性的酶。同样地，本发明包括的酶家族这里称为“RNA干扰酶”，这是这里的
【发明者】发现的新家族。而且，本发明还包括了与其在本发明中的角色相一致的结构和功能相似性的分子。
[0111]而且，在说明书和权利要求中使用的术语"MazE"或"PemI"指的既有一般类型的MazE (或者MazF调节性分子)或者PemI (或者Pem K调节性分子)，还有具有这一名称的特定分子，包括与SEQ ID NO:6或者SEQ ID NO:8具有结构和/或序列同源性的MazE (或者MazF调节性分子)或者PemI (或者Pem K调节性分子)。的确，本发明还包括了与其在本发明中的角色相一致的具有结构和功能相似性的分子。
[0112]细菌细胞的死亡和生长抑制是由细菌基因组中的内源毒素基因对于某些压力条件的响应而引发。MazF是一个内源的毒素，它导致细胞的死亡，由大肠杆菌中被称为"MazEF上瘾组件〃的操纵子编码。MazE是一个对抗MazF的不稳定的抗毒素。正如这里所描述的，在通透化的细胞中检查MazF对DNA、RNA和蛋白质合成的作用。简而言之，在MazF诱导之后10分钟，ATP依赖的35S-甲硫氨酸的掺入被完全抑制，而[a -32P] dTTP和[a -32P]UTP的掺入没有被抑制，表明MazF是蛋白质合成的特异抑制因子。而且，纯化的MazF在原核和真核的无细胞系统中都抑制蛋白质的合成，且这种抑制在MazE存在的情况下被阻断。在使用蔗糖密度梯度离心进行分析的时候，MazF的诱导阻断了多核糖体的形成，同时增加了 70S核糖体的组分，而50S和30S核糖体组分没有受到MazF表达的影响。
[0113]显著的是，趾纹分析显示MazF是一个序列特异的核糖核酸内切酶，它识别ACA序列，独立于核糖体起作用。而且，Northern印迹分析表明在MazF诱导后总细胞mRNA被降解。因此本发明的
【发明者】有了一个令人惊奇的发现，MazF是一个新型核糖核酸内切酶家族第一个被确定的成员，考虑到其干扰细胞mRNA作用的能力，它在这里被命名为“mRNA干扰酶”。正如这里显示的，干扰酶的功能由mRNA转录物在特异序列(ACA)处的切割产生，这导致细胞生长的迅速停止和/或细胞死亡。正如这里表明的，mRNA干扰酶的作用在正常的细胞生理和/或由压力条件诱导的受损细胞生理中具有广泛的含意。
[0114]本发明的
【发明者】还发现纯化的PemK (由“peml-pemK上瘾组件”编码的毒素)抑制了在大肠杆菌无细胞系统中蛋白质的合成，而加入抗PemK的抗毒素PemI，恢复了蛋白质的合成。这里描述的其他研究显示PemK是一个序列特异的切割mRNA的核糖核酸内切酶，因此抑制了蛋白质的合成。PemI阻断了 PemK介导的核糖核酸内切酶活性，这样恢复了蛋白质的合成。PemK只切 割单链RNA，优选在“UAX (X是C、A或者U)”识别位点的A残基的5’或者3’ 一侧切割。在诱导之后，PemK切割细胞mRNA，有效地阻断大肠杆菌中蛋白质的合成。pemK的同源物已经在很多细菌的基因组中被发现，并且本发明的
【发明者】在这里提出PemK及其同源物组成了一个新的核糖核酸内切酶家族，该家族通过以序列特异的方式切割细胞mRNA干扰了 mRNA的功能。
[0115]为了更清楚地给出本发明的参数，使用以下的定义:
[0116]短语“侧翼核酸序列”指的是那些位于内切核酸酶切割位点5’和3’的连续核酸序列。正如在本说明书和所附的权利要求中所使用的，除非在上下文中明确指明，单数形式〃a〃，"an"和〃the〃包括了复数指代。因此例如，“the method”包括一种或者更多的方法，和/或这里描述的步骤类型和/或在阅读本公开材料之后本领域内的技术人员可以明确的
也聰坐坐
[0117]术语“内切核酸酶”指的是可以在内部切割DNA的酶。
[0118]术语“核糖核酸内切酶”指的是可以在内部切割RNA的酶。
[0119]术语“互补的”指的是表现出大体正常的碱基配对性质的两条DNA链。但是互补的DNA可以含有一个或者更多的错配。
[0120]术语“杂交”指的是在两条互补的DNA链之间出现的氢键连接。
[0121]“核酸”或者“核酸分子”在这里使用，指的是任何单链或者双链的DNA或RNA分子，如果是单链的，核酸分子的互补序列的分子可以是线形或者环状形式。在讨论核酸分子时，某个核酸分子的序列或者结构在这里进行描述时可以根据常规按照从5’到3’的方向给出其序列。在提到本发明的核酸时有时会用到术语“分离的核酸”。该术语在用于DNA时，所指的DNA分子已经与其来源的生物体天然存在的基因组上紧邻的序列分离开来。例如，“分离的核酸”可能包含插入到载体例如质粒或者病毒载体中的DNA分子，或者整合到原核或者真核细胞或者生物体基因组DNA中的DNA分子。
[0122]在用于RNA时，术语“分离的核酸”主要是指根据以上确定的分离DNA分子编码的RNA分子。或者该术语所指的RNA分子已经同在天然状态(即在细胞或者组织中)下与该RNA分子联系在一起的其它核酸充分地分尚开来了。分尚的核酸(DNA或者RNA)还可以代表通过生物学或者合成方式直接产生的、并且同其产生过程中存在的其他组分分离开来的分子。
[0123]某些核酸序列的“天然等位变异体”、“突变体”和“衍生物”指的是与该序列有密切联系、但是可能具有天然或者人工设计的序列或者结构改变的序列。有紧密联系的意思是序列中在确定长度上至少65%但是通常是85%以上的核苷酸与用一个特定SEQ ID NO:表示的核酸序列相匹配。紧密联系的核酸序列之间核苷酸序列的改变或者差异可能代表了在某个核酸序列正常 的复制过程中或者天然的重复中产生的序列核苷酸的改变。其他的改变可以根据特别的目的，例如改变核酸中的氨基酸密码子或者调控区域的序列，进行特异设计并且引入到序列中。这种特异的改变可以在体外使用多种不同的诱变技术进行，或者在被置于特定选择条件(该条件诱导或者选择这些改变)下的宿主生物体中进行。这种特异产生的序列变异体可以被称作初始序列的“突变体”或者“衍生物”。
[0124]在提及某个特定序列时使用术语“百分比相似性”、“百分比一致性”以及“百分比同源性”，如同University of Wisconsin GCG软件程序中提及的那样,这在本领域内是已知的。
[0125]本发明还包括本发明MazF多肽或者蛋白质的活性部分、片段、衍生物以及功能性或者非功能性模拟物。MazF多肽的“活性部分”的意思是小于MazF多肽全长，但是仍然保留了可测量生物活性的肽。
[0126]mRNA干扰酶的“片段”或者“部分”的意思是一段氨基酸残基的片段，至少有大约5-7个连续的氨基酸，一般至少有大约7-9个连续的氨基酸，通常至少有大约9-13个连续的氨基酸，最优选至少大约20-30个或者更多连续的氨基酸。mRNA干扰酶的“衍生物”或者其片段的意思是通过改变蛋白质的氨基酸序列，例如对编码蛋白质的核酸进行操作或者改变蛋白质自身而形成的经修饰的多肽。这种天然氨基酸序列的衍生物可能涉及了一个或者更多氨基酸插入、添加、删除或者替换，可能或者可能没有改变原来mRNA干扰酶的基本活性。
[0127]在自然界中存在不同的mRNA干扰酶“变异体”。这些变异体可能是等位基因，其特征是编码蛋白质的基因的核苷酸序列的差异，或者可能涉及不同的RNA加工或者翻译后的修饰。技术人员可以制备出具有单一或者多个氨基酸替代、删除、添加或者替换的变异体。此外，这些变异体可能包含:(a)其中一个或者更多氨基酸残基被保守或者非保守的氨基酸替代的变异体，(b)其中一个或者更多氨基酸残基被加入到mRNA干扰酶中的变异体，(c)其中一个或者更多氨基酸包含了取代基团的变异体，以及(d)其中mRNA干扰酶与另外一个肽或者多肽(例如融合伴侣、蛋白标签或者其他化学部分，它们可能使mRNA干扰酶具有有用的性质，例如抗体的表位、多聚组氨酸序列、生物素部分等等)融合的变异体。本发明的其他mRNA干扰酶包括变异体，其中在保守或者非保守的位置来自一个物种的氨基酸残基被另外一个物种的相应残基替代。在另一个实施方案中，非保守位置的氨基酸残基被保守或者非保守的残基替代。获得这些变异体的技术，包括遗传学的(抑制、删除、突变等)、化学的以及酶学的技术，对于本领域内具有普通技术的人员是已知的。
[0128]这种等位变异、类似物、片段、衍生物、突变体以及修饰，包括可变核酸加工形式和可变翻译后修饰形式产生保留了 mRNA干扰酶任何生物学性质的mRNA干扰酶衍生物，它们包括在本发明的范畴中。
[0129]这里使用的术语〃直向同源物〃或者〃同源物〃指由核酸序列编码的核酸酶，这些序列的多肽产物与MazF编码序列有大于60%的序列一致性，和/或这些序列的基因产物与MazF有相似的三维结构和/或生化活性。示例性的直向同源物/同源物包括，但不限于，耐盐芽孢杆菌的MazF (GenBank登录编号ΝΡ_244588.I),表皮葡萄球菌的MazF (GenBank登录编号AAG23809.1)，金黄色葡萄球菌的MazF (GenBank登录编号ΝΡ_372592.1)，枯草芽孢杆菌的MazF (GenBank登录编号1ΝΕ8_Α)，脑膜炎奈瑟氏球菌的MazF (GenBank登录编号ΝΡ_266040.1),摩氏摩根氏菌(GenBank登录编号AAC82516.1)和结核分枝杆菌(GenBank登录编号ΝΡ_217317.1)。参见图22和23。术语〃直向同源物〃和〃同源物〃可以用来指任何物种的MazF核酸或者氨基酸序列的直向同源物/同源物。这些物种包括，但是不止限于，大肠杆菌，耐盐芽孢杆菌，表皮葡萄球菌，金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌，脑膜炎奈瑟氏球菌，摩氏摩根氏菌，结核分枝杆菌，小鼠(Mus musculus),以及智人(Homosapiens)。这里涉及了在本发明的方法中使用这些直向同源物/同源物编码的核酸酶。[0130]正如这里所使用的，术语〃直向同源物〃或者〃同源物〃还指由一些核酸序列编码的核酸酶，这些序列的多肽产物与PemK编码序列有大于60%的序列一致性，和/或这些序列的基因产物与PemK有相似的三维结构和/或生化活性。术语〃直向同源物〃和〃同源物"可以用来指任何物种的PemK核酸或者氨基酸序列的直向同源物/同源物。
[0131]这里涉及了在本发明的方法中使用这些PemK的直向同源物/同源物编码的核酸酶。示例性的同源物和直向同源物包括，但不限于，PemK蛋白质家族中的73个已知成员，包括MazF (ChpAK)，ChpBK以及其他类PemK蛋白。以下是在网站中(http: / /pfam.wustl.edu/cg1-bin/getdesc?acc=PF02452)找到的这些蛋白质的命名清单:Q9RX98;Q8F5A3;Q9K6K8;CHPA_EC0LI;Q7NPF9;Q88TP7;Q7WWW1;Q8YS80;Q8DW95;Q82YR2;Q7X3Y1;Q93S64;Q8PRN1;Q8GFY1;052205;PEMK_EC0LI Q7N4H2;Q88PS7;Q8XCF2CHPB_EC0LI;Q82VUO;Q8UGU5;Q9RWK4;Q9PHH8;Q7TXU4;P71650;Q7U1Y5;P96295;Q9JWF2;Q9JXII;Q8E882;Q82VB5;Q8KJS3;Q7NMY4;Q9KFF7;P96622;Q81IT4;Q81VF4;Q8ESK5;Q92DC7;Q8Y8L0;Q97LR0;Q8XNN7;Q8R861;Q88Z43;007123;Q837I9;Q9F7V5;Q8CRQ1;005341;P95840;Q9FCV0;Q837L1;Q93M89;Q99IU9;Q82UB5;Q93MT8;YJ91_MYCTU;Q97MV8;Q7NHW0;Q7NI95;Q8YML2;Q7NHR3;YE95_MYCTU; Q9PCB9; Q8YZW8; Q7TZ90; P95272; Q8VJR1; Q7U0N2; 053450; 006780;和 Q7U118。参见图33 和 34。
[0132]Swiss-Protein 编号之后是 NCBI 编号。
[0133]Q9RX98NP_294140Q8F5A3NP_711962Q9K6K8NP_244588CHPA_EOTLI NP_417262Q7NPF9NP_923042Q88TP7NP_786238Q7fffffflNP_943016Q8YS80NP_487251Q8DW95NP_720642Q82YR2NP_816992Q7X3Y1NP_857606Q93564NP_862570Q8PRN1NP_644713Q8GFY1AAN87626.052205AAC82516PEMK_EOTLINP_957647Q7N4H2NP_929611Q88PS7NP_742932Q8XCF2NP_29085
7CHPB_BC0LI D49339Q82VU0NP_841047Q8UGU5NP_531638Q9RWK4AAF10240Q9PHH8NP_061683
Q7TXU4NP_856470P71650NP_217317Q7U1Y5NP_85412BP96295CAB03645Q9JWF2NP_283229Q9J
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470228Q8Y8L0NP_464414Q97LR0NP_347I34Q8XNN7NP_56I2I1Q8R861NP_62372IQ8BZ43NP_78
4302007123CAA70141Q837I9NP_814592Q9F7V5NP_765227Q8CRQ1AA005271005341NP_646809
P95840BAB95857Q9FCV0CAC03499Q837L1NP_814568Q93M89NP_150051Q82UB5NP_841618Q93M
T8NP_713024YJ91_MYCTUBP_216507Q99IU9P_856470Q97MV8NP_346728Q7NHW0NP_925371Q7N
I95NP_925234Q8TML2NP_488961Q7NHR3NP_925418YB95_MYCTTJCAA17218Q9PCB9NP_299148Q
8YZW8NP_484381Q7TZg0NP_855627P95272NP_216458Q8VJRlNP_336589Q7U0N2NP_854788053
450NP_216458006780NP_2I5173Q7UnMNP_854336.[0134]这里使用的术语〃直向同源物〃或“同源物”还指的是由核酸序列编码的核酸酶(抗毒素或者核酸酶的调节剂)的结合伴侣，其多肽产物与MazE的编码序列有大于60%的一致性，和/或其基因产物具有与MazE相似的三维结构和/或生化活性。示例性的直向同源物/同源物包括，但是不限于，MazE,耐放射异常球菌(Deinococcus radiodurans)(GenBank 登录号 NP_294139) ;MazE,耐盐芽孢杆菌(GenBank 登录号 NP_244587) ;PemI,质粒 RlOO (GenBank 登录号 NP_052993) ; PemI,质粒 R466b (GenBank 登录号 AAC82515) ; ChpS,大肠杆菌(GenBank登录号NP_290856) ; MazE,恶臭假单胞菌KT2440 (GenBank登录号NP_742931) ;MazE, Photobacterium profundum(AAG34554)。参见图 24 和 25。术语〃直向同源物"或“同源物”还可以指任何物种的MazE的核酸或者氨基酸序列的直向同源物/同源物。这些物种包括，但是不止限于，大肠杆菌，耐放射异常球菌，耐盐芽孢杆菌，恶臭假单胞菌,Photobacterium profundum,表皮葡萄球菌，金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌，脑膜炎奈瑟氏球菌，摩氏摩根氏菌，结核分枝杆菌，小鼠(Mus musculus),以及智人。这里还涉及由这些直向同源物/同源物编码的核酸酶调节性分子(抗毒素)在本发明方法中的使用。
[0135]正如这里所使用的，术语〃直向同源物〃或“同源物”还指的是由核酸序列编码的核酸酶结合伴侣(抗毒素或核酸酶的调节剂)，其多肽产物与PemI编码序列有大于60%的序列一致性，和/或其基因产物与PemI有相似的三维结构和/或生化活性。示例性的PemI的直向同源物/同源物包括，但不止限于，MazE (抗毒素)蛋白质家族中的已知成员，包括MazE (ChpAI) ,ChpBI以及其他MazE的同源物。术语〃直向同源物〃和“同源物”可以用来指任何物种的PemI核酸或者氨基酸序列的直向同源物/同源物。这里涉及了在本发明的方法中使用这些同源物编码的核酸酶调节性分子。这里涉及了在本发明的方法中使用这些同源物/直向同源物编码的核酸酶调节性分子(抗毒素)。
[0136]正如在这里所使用的，术语“功能性的”意味着核酸或者氨基酸序列对于所述的试验或者目的是有功能的。
[0137] 正如在这里所使用的，术语“功能性片段”意味着核酸或者氨基酸序列是全长多肽的一部分或者亚结构域，并且对于所述的试验或者目的是有功能的。[0138]在指一个特定的核苷酸或者氨基酸时，短语“基本由……组成”的意思是具有给定SEQ ID NO:序列性质的序列。例如在用来指一个氨基酸序列时，该短语包括了该序列本身以及不会影响该序列基本性质和新性质的分子修饰。
[0139]“复制子”是能够主要在自身的控制下复制的任何遗传元件，例如质粒、粘粒、杆粒、噬菌体或者病毒。复制子可以是RNA或者DNA,可以是单链或者双链。
[0140]“载体”是一个复制子，例如质粒、粘粒、杆粒、噬菌体或者病毒，另外的遗传序列或者元件(DNA或者RNA)可以与其相连,使得连接的序列或者元件也能复制。
[0141]“表达载体”或者“表达操纵子”指的是可能具有转录和翻译控制序列(例如启动子、增强子、翻译起始信号(例如ATG或者AUG密码子)、多聚腺苷酸化信号、终止子等等)的核酸片段，其有助于多肽编码序列在宿主细胞或者生物体中的表达。
[0142]正如这里所使用的，术语“有效连接”指的是能够介导编码序列表达的调控序列，它被放在DNA分子(例如表达载体)中相对于编码序列的适当的位置上，使得编码序列被表达。同样的定义有时应用在表达载体中的编码序列和转录控制元件(例如启动子、增强子和终止元件)的排列上。当产生了杂合核酸分子时，该定义有时还应用在杂合分子中第一个第二个核酸序列的核酸序列的排列上。
[0143]正如这里使用的，术语“寡核苷酸”指的是本发明的引物和探针，其定义为由两个或者更多核糖或者脱氧核糖核苷酸、优选是三个以上核苷酸组成的核酸分子。寡核苷酸的准确大小取决于各种不同的因素、特定的应用以及寡核苷酸的使用。
[0144]正如这里所使用的，术语“探针”指的是寡核苷酸，多核苷酸或者核酸，可以是RNA或者是DNA，可以是天然 存在的(如从限制性酶消化产物纯化得到的)或者合成产生的，能够与序列同探针互补的核酸退火或者特异杂交。探针可以是单链或者双链的。探针的准确长度取决于许多因素，包括温度、探针的来源以及使用方法。例如对于诊断应用，根据靶向序列的复杂程度，寡核苷酸探针通常含有15-25或者更多的核苷酸，尽管它可能含有更少的核苷酸。在这里，选择探针，使其与特定的靶核酸序列的不同链“基本”互补。这意味着探针必须充分互补，才能够在一系列预先设置的条件下与它们各自的靶链“特异杂交”或者退火。因此，探针的序列不需要是靶标的精确互补序列。例如，一个非互补的核苷酸片段可以连接在探针的5’或者3’端，探针序列的剩余部分与靶链互补。另外，在探针序列同与探针特异退火的靶核酸序列有充分互补性的条件下，可以将非互补碱基或者更长的序列分散到探针中。
[0145]术语“特异杂交”指的是充分互补序列的两个单链核酸分子之间的结合使得在本领域内一般使用的预先设定的条件下这种杂交可以进行(有时称为“基本互补”)。特别地，该术语指的是寡核苷酸与本发明的单链DNA或者RNA内部含有的基本互补序列之间的杂交，基本排除了寡核苷酸与非互补序列单链核酸之间的杂交。
[0146]正如这里所使用的，术语“引物”指的是寡核苷酸，可以是RNA或者DNA，单链或者双链，可以来源于生物系统，由限制性酶切产生或者合成产生，当所述的寡核苷酸置于适当的环境中时，就能够作为依赖于模板进行核酸合成的起始物而起作用。在提供了正确的核酸模板、核酸的适宜的核苷三磷酸前体、聚合酶、适宜的辅助因子和条件(如适宜的温度和pH)时，引物就可以在其3’端通过聚合酶的作用或者类似的活性，通过加入核苷酸而得到延伸，产生引物延伸的产物。引物的长度根据特定的条件和应用的需要可以有所不同。例如，在诊断应用中，寡核苷酸引物的长度通常是15-25或者更多的核苷酸。引物必须与所要求的模板充分互补，才能引发所需延伸产物的合成，即引物应能够与所要求的模板链退火，退火的方式足以将引物的3’羟基部分置于正确的邻近位置，用于在聚合酶或者类似的酶作用下引发合成。并不需要引物的序列是所要求模板的完全互补序列。例如，非互补的核苷酸序列可以连接在互补引物的5’端。另外，在引物序列与所要求的模板链有充分互补性，能够有功能地提供一个模板-引物复合物用于延伸产物合成的前提下，可以将非互补碱基分散到寡核苷酸引物序列中。
[0147]引物可以用6-羧基荧光素出-FAM)进行荧光标记。或者引物可以用4，7，2’，7’-四氯-6-羧基荧光素(TET)进行标记。其他的DNA标记方法在本领域内是已知的并且被认为是在本发明范畴 内的。
[0148]这里有时使用术语“分离的蛋白质”或者“分离和纯化的蛋白质”。该术语主要是指通过表达本发明的分离核酸分子产生的蛋白质。或者该术语所指的蛋白质已经同在天然状态下与该蛋白质联系在一起的蛋白质充分地分离开来，以“基本纯”的形式存在了。“分离的”并不意味着排除与其他化合物或者材料形成人工或者合成混合物，以及不干扰基本活性的不纯物质的存在，这些物质可能由于例如不完全的纯化、稳定剂的加入或者配置成为如免疫原性制剂或药物上可以接受的制剂而存在。
[0149]术语“基本纯”指的是一种制剂包含至少50-60%重量的给定材料(例如核酸、寡核苷酸、蛋白质等等)。更为优选地，制剂包含至少75%重量，最优选90-95%重量的给定化合物。纯度是由适合于给定化合物的方法来量度的(例如色谱法、琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳、HPLC分析等等)。“成熟的蛋白质”或者“成熟的多肽”所指的多肽是具有任何加工事件之后的多肽序列，这些加工事件在多肽产生的过程中通常就出现，例如多肽前体的蛋白酶水解加工过程。在确定成熟蛋白质的序列或者界限时，成熟蛋白质序列的第一个氨基酸被称为氣基酸残基I。
[0150]术语“标签”、“标签序列”或者“蛋白质标签”指的是化学部分，可以是核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸或者氨基酸、肽或者蛋白质或者其他化学物质，当这些物质加入到另一个序列中，则提供了额外的用处或者使序列具有了有用的性质，特别是关于检测或者分离该序列的方法的有用性质。因此，例如可以将与捕获寡核苷酸互补的同聚核酸序列或者核酸序列加到引物或者探针序列上，促进接下来对延伸产物或者杂交产物的分离。如果是蛋白质标签，可以将组氨酸残基(例如4-8个连续的组氨酸残基)加在蛋白质的氨基或者羧基端，通过金属螯合层析促进蛋白质的分离。或者将代表与特异抗体分子或其他分子有反应性的表位或结合决定簇的氨基酸序列、肽、蛋白质或融合伴侣(例如flag表位、c-myc表位、流感A病毒血凝素蛋白跨膜表位、蛋白A、纤维素结合结构域、钙调蛋白结合蛋白、麦芽糖结合蛋白、几丁质结合结构域、谷胱甘肽S-转移酶等等)加到蛋白质之上，促进蛋白质通过亲和或者免疫亲和层析的步骤被分离。化学标签分子包括如生物素的分子，它们可以加在核酸或者蛋白质上，有助于通过与抗生物素蛋白试剂等等的相互作用对核酸和蛋白质进行分离和检测。受过训练的技术人员知道并且可以设想出许多其他的标签分子，它们也被认为是这一定义范畴内的。
[0151]术语“转化”、“转染”、“转导”所指的是核酸引入到细胞或者宿主生物体中的方法或者手段，可以交换使用表达相同的含义。这些方法包括，但是不止限于，转染、电穿孔、微注射、PEG融合等等。
[0152]被引入的核酸可以整合(共价连接)或者不整合到受体细胞或者生物体的核酸中。例如在细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞中，引入的核酸可以作为附加体元件或者独立复制子如质粒的形式维持。或者被引入的核酸可以整合到受体细胞或者生物体的核酸中，稳定地维持在那个细胞或者生物体中，进一步传递或者遗传到受体细胞或生物体的子代细胞或生物体中。在其他应用中，引入的核酸在受体细胞或者宿主生物体中可能仅仅短暂存在。
[0153]“克隆”或者“克隆细胞群”是一群从单一细胞或者共同祖先通过有丝分裂形成的细胞。
[0154]“细胞系”是能够在体外稳定生长多代的原代细胞或细胞群的克隆。
[0155]含有本发明的分子或者化合物的组合物可以进行给药，用于预防和/或治疗性治疗。在一个治疗性应用中，例如，将组合物施用给已经患有过度增生性疾病(例如癌症)的患者，施用的量足以治愈或者至少部分停止疾病及其并发症的症状。足以完成这一目的的量被确定为“治疗上有效的量或者剂量”。对于这一用途有效的量取决于疾病的严重性以及患者的体重和一般状况。
[0156]正如这里所使用的，术语“癌症”指的是由于细胞不可控制的持续增殖导致的组织的异常生长。可以根据本发明的方法进行治疗的癌症的示例包括，但不止限于，肉瘤，母细胞瘤和癌例如:纤维肉瘤，粘液肉瘤，脂肪肉瘤，软骨肉瘤，骨肉瘤，脊索瘤，血管肉瘤，内皮肉瘤，淋巴管肉瘤，淋巴管内皮肉瘤，滑膜瘤，间皮瘤，尤因瘤，平滑肌肉瘤，横纹肌肉瘤，结肠癌，结肠直肠癌，胃癌，胰腺癌，乳腺癌，脑膜癌病(最常见与扩散的乳腺或者肺癌相伴)，卵巢癌，前列腺癌，鳞状细胞癌，基底细胞癌，腺癌，汗腺癌，皮脂腺癌，乳头状癌，乳头状腺癌，囊 腺癌，髓样癌，肺癌，肾细胞癌，肝癌，肝癌转移，胆管癌，绒毛膜癌，精原细胞瘤，胚胎性癌，甲状腺癌例如未分化甲状腺癌，肾母细胞瘤，宫颈癌，睾丸癌，肺癌例如小细胞肺癌和非小细胞肺癌，膀胱癌，上皮细胞癌，神经胶质瘤，星型细胞瘤，成神经管细胞瘤，颅咽管瘤，室管膜瘤，松果体瘤，成血管细胞瘤，听神经瘤，少突胶质细胞瘤，脑脊膜瘤，黑色素瘤，母细胞胞瘤和视网膜母细胞瘤。
[0157]可以根据本发明的方法进行治疗的血液恶性肿瘤的示例包括:急性髓性白血病(AML)、慢性髓性白血病(CML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、多发性骨髓瘤、非何杰金淋巴瘤(NHL)，何杰金疾病和淋巴瘤(HD)，幼淋巴细胞白血病(PLL)，和骨髓增生异常综合征(MDS)。
[0158]“免疫应答”表示的是任何抗原例如蛋白质抗原在具有正常功能免疫系统的宿主中产生的反应。免疫应答可以是体液的，涉及免疫球蛋白或者抗体的产生，或者是细胞的，涉及多种不同类型的B和T淋巴细胞、树突状细胞、巨噬细胞、抗原呈递细胞等等，或者既有体液免疫又有细胞免疫。免疫应答还可能涉及多种不同的效应分子的产生和修饰，例如细胞因子、淋巴因子等。免疫应答可以在体外以及在各种不同的细胞或者动物系统中进行测量。
[0159]“抗体”或者“抗体分子”是任何与特异抗原结合的免疫球蛋白，包括抗体和抗体片段。该术语包括了多克隆、单克隆、嵌合以及双特异性抗体。正如这里所使用的，抗体或抗体分子涉及完整无缺的免疫球蛋白分子以及免疫球蛋白分子的免疫学活性部分例如那些在本领域内已知的部分，如Fab, Fab’，F (ab，) 2和F (V)。[0160]术语“细胞底物”指的是细胞内的分子，它是酶或者相关酶家族的酶促靶标。就mRNA干扰酶而言，“细胞底物”包括了细胞内由内源或者外源核酸序列表达的多聚核糖核苷酸。
[0161]正如这里所使用的，短语“在促进核糖核酸内切酶活性的条件下”包括了细胞内(在细胞培养中或者在体内)或者体外(在试管中或者其他类似的容器中)的任何条件，其中本发明的mRNA干扰酶表现出核糖核酸内切酶活性。这些条件在这里提出的实施例中有所描述。类似地，“与mRNA干扰酶相容的缓冲剂”是一种缓冲剂，本发明的mRNA干扰酶在其中表现出核糖核酸内切酶活性。
[0162]正如这里所使用的，术语“mRNA干扰酶调节剂”指的是一种能够调节mRNA干扰酶的核糖核酸内切酶活性(例如提高或者降低)的因子。筛选或者鉴别这种因子的方法在以下提出。示例性的内源mRNA干扰酶调节剂包括MazE (抑制MazF的活性)以及PemI (抑制PemK的活性)。这里也描述了 MazE和PemI的功能性片段，它们能够分别抑制MazF和PemK的活性。
[0163]除非另有定义，这里使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属的领域内一个具有普通技术的人员通常理解的含义相同。虽然在本发明的实践或者试验中可以使用任何与这里描述的相似 或者相同的方法和材料，但是现在描述优选的方法和材料。这里提到的所有出版物在这里被引用，以公开和描述被引用的出版物与其有关的方法和材料。
[0164]1.编码mRNA干扰酶的核酸分子以及mRNA干扰酶的制备
[0165]核酸分子
[0166]可以通过两种一般的方法制备编码本发明核糖核酸内切酶(例如MazF或PemK)的核酸分子:(I)从适当的核苷酸三磷酸合成；或者(2)从生物来源中分离，两种方法使用的试验方案是本领域内众所周知的。
[0167]核苷酸序列信息，例如SEQ ID NO:1或者3的全长cDNA (见图20A和31A)，使得通过寡核苷酸合成制备本发明的分离核酸分子成为可能。合成的寡核苷酸可以通过亚磷酰胺方法制备，使用AppliedBiosystems380A DNA合成仪或者类似的装置。产生的构建体可以根据本领域内已知的方法例如高效液相色谱(HPLC)进行纯化。由于目前的寡核苷酸合成方法中固有的大小限制，长的双链多核苷酸，例如本发明的DNA分子，必须分步合成。然后，通过这种方法构建的合成DNA分子可以被克隆并扩增到适当的载体中。使用本领域内已知的方法，可以从适当的生物来源中分离编码mRNA干扰酶的核酸序列。在一个优选的实施方案中，从一个细菌来源的cDNA表达文库中分离出cDNA克隆。在另一个实施方案中，使用该cDNA序列提供的序列信息，可以分离出编码mRNA干扰酶的基因组克隆。或者，可以使用mRNA干扰酶基因内部预先确定的序列对应的寡核苷酸探针，从其他物种中分离出与mRNA干扰酶具有同源性的cDNA或者基因组克隆。
[0168]根据本发明，可以使用适当严谨性的杂交以及漂洗条件，鉴定出与SEQ ID NO:1或3的蛋白编码区域具有适当同源性水平的核酸。例如，可以使用包含下列的杂交溶液进行杂交:5X SSC, 5X Denhardt's试剂，0.5-1.0%SDS, 100微克/毫升变性的片段化的鲑精DNA, 0.05%焦磷酸钠以及至多50%的甲酰胺。一般在37-42摄氏度进行杂交，至少6小时。杂交之后，按照下面的步骤漂洗滤膜:(1)2X SSC,0.5-P/oSDS中室温下漂洗5分钟；(2)在2X SSC,0.1%SDS中室温下漂洗15分钟;(3)在IX SSC, 1%SDS中37摄氏度下漂洗30分钟到I小时；(4)在IX SSC, 1%SDS中42-65摄氏度下漂洗2小时，每30分钟更换一次溶液。
[0169]一个计算在两个具有特定序列同源性的核酸分子之间杂交所需的严谨性条件的通用公式(Sambrook et al.，1989)是:Tm=81.5°C 16.6Log[Na+] +0.41 (%G+C) -0.63 (% 甲酰胺)-600/双链中的碱基对数目。
[0170]为了说明以上公式，使用[Na+] = [0.368]和50%的甲酰胺，GC含量是42%，平均的探针大小是200bp，则1'111是57摄氏度。同源性每降低1%，DNA双链的Tm降低1_1.5摄氏度。这样，使用42摄氏度的杂交温度可以观察到具有大于约75%序列一致性的靶标。这样的一个序列被认为与本发明的核酸序列具有显著的同源性。
[0171]从上可以看出，杂交和漂洗的严谨性主要取决于溶液的盐浓度和温度。一般地，为了使两个核酸分子的退火比率最大化，通常在计算出来的杂合分子的Tm值以下20-25摄氏度下进行杂交。对于探针同靶标一致性的程度而言，漂洗条件应该尽可能的严谨。一般地，漂洗条件应该选择低于杂合分子Tm大约12-20摄氏度。就本发明的核酸而言，中度的严谨性杂交条件确定为:6X SSC, 5X Denhardt's溶液，0.5%SDS, 100微克/毫升变性的鲑精DNA，42摄氏度下杂交。漂洗条件是2X SSC，0.5%SDS，55摄氏度15分钟。高度的严谨性杂交条件确定为:6X SSC, 5X Denhardt's溶液，0.5%SDS, 100微克/毫升变性的鲑精DNA, 42摄氏度。漂洗条件是IX SSC，0.5%SDS，65摄氏度15分钟。非常高严谨性杂交条件确定为:6X SSC, 5X Denhardt's溶液，0.5%SDS, 100微克/毫升变性的鲑精DNA, 42摄氏度。漂洗条件是0.1X SSC, 0.5%SDS，65摄氏度15分钟。
[0172]本发明的核酸可以作为DNA，在任何方便的克隆载体中保存。在一个优选的实施方案中，克隆在质粒克隆/表达载体中保存，例如在pBluescript (Stratagene, LaJolla, Calif.)中，其可以在适宜的大肠杆菌宿主细胞中增殖。本发明中编码mRNA干扰酶基因的基因组克隆可以在lambda噬菌体FIX II(Stratagene)中保存。
[0173]本发明中编码mRNA干扰酶的核酸分子包括cDNA、基因组DNA、RNA及其片段，它们可以是单链或者双链的。这样，本发明提供了寡核苷酸(DNA的有义或者无义链或者RNA)，它们具有的序列能够与至少一个本发明的核酸分子序列(例如SEQ ID NO:1或者3的cDNA中选出的片段)进行杂交。这种寡核苷酸在检测或分离mRNA干扰酶基因的探针时是有用的。
[0174]本领域内的技术人员应当理解在细菌的群体和/或物种中存在这些序列的变异体(例如等位变异体)，而且在设计和/或使用本发明的寡核苷酸时必须考虑到变异体。因此，本发明的范畴也包括了这样的变异体，涉及这里公开的mRNA干扰酶序列或者靶向于各自基因或RNA转录本上特定位置的寡核苷酸。就这种变异体的包括而言，这里使用术语“天然的等位变异体”，指在一个给定的DNA群体中可能出现的多种不同的特异核苷酸序列及其变异体。在被编码的蛋白中引起保守或者中性氨基酸替代的遗传多态性是这种变异体的实例。
[0175] 此外，术语“基本互补的”指的是与靶序列不完全匹配的寡核苷酸，但是这些错配没有在实质上影响该寡核苷酸在描述的条件下与其靶序列杂交的能力。
[0176]这样，编码序列可能是在例如SEQ ID NO:1或3中显示的或者可能是这两个序列中一个的突变体、变异体、衍生物或者等位基因。该序列可能与所示的序列有所不同，区别在于所示序列的一个或者更多的核苷酸出现一个或者更多的添加、插入、删除以及替代。核苷酸序列的改变可能导致蛋白质水平上由遗传密码确定的氨基酸的改变或者不变。
[0177]因此，根据本发明的核酸可能包括与SEQ ID NO:1或3所示的序列不同的序列，但是它编码的多肽与SEQ ID NO:1或3编码的多肽具有相同的氨基酸序列。
[0178]另一方面，编码的多肽包含的氨基酸序列可能与SEQ ID NO:2或者4所示的氨基酸序列有一个或者更多氨基酸残基的差异。参见图20B和31B。本发明还提供了编码多肽的核酸序列，所述多肽是SEQ ID NO:2或者4所示氨基酸序列的突变体、变异体、衍生物或者等位基因。编码这种多肽的核酸与SEQ ID NO:1或3所示的编码序列可能有大于60%的一致性，大于约70%的一致性，大于约80%的一致性，大于约90%的一致性或者大于约95%的一致性。
[0179]本发明提供了获得目标核酸的方法，该方法包括将具有部分或者全部SEQ ID NO:I或3所示序列或者其互补序列的探针与靶核酸杂交。成功的杂交可以使与探针杂交上的核酸被分离出来，这可能涉及一个或者更多的聚合酶链式反应(PCR)扩增步骤。
[0180]这种寡核苷酸探针或者引物，以及全长的序列(以及突变体、等位基因、变异体和衍生物)在筛选含有核酸的检测样品中是否存在mRNA干扰酶的等位基因、突变体或者变异体时是有用的，探针与从待测的细胞、组织或者生物体获得的样品中的靶序列杂交。可以控制杂交的条件，使非特异结合最小化。优选地使用严谨到中度严谨的杂交条件。在教科书例如Sambrook et al (1989)和Ausubel et al (1992)的帮助下,技术人员能够容易地设计这种探针、标记它们并且设计适宜的杂交反应条件。
[0181]在一些优选的实施方案中，根据本发明的寡核苷酸(是SEQ ID NO:1或3所示序列的片段或者任何与核糖核 酸内切酶活性相关的等位基因)，其长度至少大约10个核苷酸，更为优选至少15个核苷酸长，更为优选至少大约20个核苷酸长。这些片段各自代表了本发明的方面。片段和其他寡核苷酸可以用作所讨论的引物或者探针，但是也可以通过与确定检测样品中是否存在编码mRNA干扰酶的同源物或者直向同源物序列有关的方法产生(例如通过PCR)。
[0182]B.蛋白质
[0183]MazF是第一个被发现以高度特异性在特异的核酸序列(即ACA)处切割RNA的核酸酶。PemK是第一个被发现以高度特异性在特异的核酸序列(即UAX，其中X是C、A或U)处切割RNA的核酸酶。本发明的全长mRNA干扰酶蛋白(例如MazF或者PemK)可以根据已知的方法，以多种不同方式制备。蛋白质可以从适当的来源中纯化。但这不是一个优选的方法，原因是在任何时刻一个给定的细胞中存在的蛋白量可能很少。编码MazF和PemK的核酸分子的可获得性使得用本领域内已知的体外表达方法生产这两个蛋白成为可能。例如可以将cDNA或者基因克隆到适当的体外转录载体例如pSP64或者pSP65中，用于体外转录，之后在适宜的无细胞翻译系统(例如小麦胚芽或者兔网织红细胞裂解物)中进行无细胞翻译。体外转录和翻译系统是商品化的，可以从例如Promega Biotech, Madison, Wis.或者BRL, Rockville, Md 获得。
[0184]或者，根据一个优选的实施方案，可以通过在适宜的原核或者真核系统中表达生产大量的mRNA干扰酶。例如，DNA分子的部分或者全部，例如SEQ ID NO:1或3的cDNA，可以插入到适合于在细菌细胞如大肠杆菌细胞中表达的质粒载体中。这种载体包含DNA在宿主细胞(如大肠杆菌)中表达所需的调控元件，调控元件的位置允许DNA在宿主细胞中表达。这种表达所需的调控元件包括启动子序列、转录起始序列以及可选择地，增强子序列。
[0185]在重组原核或者真核系统中基因表达产生的mRNA干扰酶可以根据本领域内已知的方法进行纯化。在一个优选的实施方案中，可以使用商品化的表达/分泌系统，通过它重组蛋白表达之后从宿主细胞中分泌出来，容易地从周围的培养基中纯化出来。如果不使用表达/分泌载体，另外一种方式涉及用亲和分离纯化重组蛋白，例如与特异结合重组蛋白的抗体发生免疫相互作用或者用镍层析柱，用于分离在N端或者C端添加6-8个组氨酸的标签的重组蛋白。其他的标签可能包括FLAG表位或者血凝素表位。这些方法是技术人员通常使用的。
[0186]通过以上提到的方法制备的本发明的mRNA干扰酶，可以根据标准的步骤进行分析。例如，可以根据已知的方法，对这些蛋白进行氨基酸序列分析。
[0187]本发明还提供了是氨基酸序列变异体、等位基因、衍生物或者突变体的多肽。属于变异体、等位基因、衍生物或者突变体的多肽可能具有与SEQ ID NO:2给出的序列不同的序列，有一个或者更多氨基酸的一个或多个添加、替换、删除以及插入。优选的这些多肽具有MazF的功能，即具有一个或者更多以下性质:在RNA中切割ACA序列的能力；与抗体的交叉反应性，该抗体与具有SEQ ID NO:2序列的多肽具有反应性；与SEQ ID NO:2给出的序列所示的多肽具有共同表位(根据例如两个多肽之间的免疫交叉反应确定)。
[0188]或者属于变异体、等位基因、衍生物或者突变体的多肽可能具有与SEQ ID NO:4给出的序列不同的氨基酸序列，有一个或者更多氨基酸的一个或多个添加、替换、删除以及插入。优选的这些多肽具有PemK的功能，即具有一个或者更多以下性质:在RNA中切割UAX序列(其中X是C、A或者U)的能力；与抗体的交叉反应性，该抗体与具有SEQ ID NO:4序列的多肽具有反应性；与SEQ ID NO:4给出的序列所示的多肽具有共同表位(根据例如两个多肽之间的免疫交叉 反应确定)。
[0189]属于SEQ ID NO:2或者4所示氨基酸序列的氨基酸序列变异体、等位基因、衍生物或者突变体的多肽可能包含的氨基酸序列与所示的序列有大约35%以上的序列一致性、大约40%以上的一致性、大约50%以上的一致性、大约60%以上的一致性、大约70%以上的一致性、大约80%以上的一致性、大约90%以上的一致性或者大约95%以上的一致性。特定的氨基酸序列变异体与SEQ ID NO:2或者4所示的序列之间,通过插入、添加、替换或者删除I个氨基酸、2，3，4，5-10，10-20，20-30，30-40，40-50，50-100，100-150，或者 150 个以上的氨基酸而可能有差异。氨基酸的“同源性”可以被理解为一致性或者相似性(根据确定的氨基酸相似性原则，例如，使用算法GAP (Genetics Computer Group, Madison, Wis.)确定的相似性原则)。GAP使用Needleman和Wunsch算法比对两个完整序列，使匹配的数目最大化,使缺口数目最小化。一般地，使用缺省参数:缺口产生罚分=12以及缺口延伸罚分=4。使用GAP可能是优选的但是也可以使用其他算法，包括，但不止限于，BLAST(Altschul et al.(1990J.Mol.Biol.215:405-410) ; FASTA (Pearson and Lipman (1998) PNAS USA85:2444-2448)或者Smith Waterman算法(Smith and Waterman (1981) J.Mol.Biol.147:195-197), 一般使用缺省参数。在这里使用术语“同源性”或者“同源的”并不意味着所比较的两个序列之间有任何必然的进化关系。这两个术语的使用与短语“同源重组”的使用类似，即术语仅仅要求两个核苷酸序列充分相似，以在适当的条件下重组。
[0190]根据本发明的多肽可以用于筛选影响或者调节其活性或功能的分子。这些分子可以用于研究目的。
[0191]本发明还提供了能够免疫特异性结合本发明蛋白质的抗体。针对mRNA干扰酶(例如MazF或者PemK)的多克隆抗体可以根据标准方法制备。在一个优选的实施方案中，制备了单克隆抗体，它们与mRNA干扰酶的各种不同的表位发生免疫特异反应。可以根据Kohler和Milstein的一般方法，使用标准试验方案制备单克隆抗体。与mRNA干扰酶发生免疫特异反应的多克隆或者单克隆抗体可以用于鉴定和纯化这些蛋白质。例如，抗体可以用于亲和分离与其发生免疫特异相互作用的蛋白质。还可以使用抗体从含有蛋白质和其他生物分子混合物的样品中将蛋白质免疫沉淀出来。以下描述了抗mRNA干扰酶的抗体的其他用途。
[0192]根据本发明的抗体可以通过多种方式进行修饰。的确术语“抗体”应当被理解为任何具有所需特异性的结合结构域的结合性物质。因此，本发明包括了抗体片段、抗体的衍生物、功能性等价物以及同源物，包括合成的分子和形状模拟了抗体使其能够结合抗原或者表位的分子。
[0193]示例性的能够结合抗原或者其他结合伴侣的抗体片段有:由VL，VH, Cl和CHl结构域组成的Fab片段；由VH和CHl结构域组成的Fd片段；由抗体一个单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；由VH结构域组成的dAb片段；分离的⑶R区域以及F (ab’) 2片段，它是包括了两个Fab片段的双价片段，这两个Fab片段在铰链区由一个二硫桥连接。还包括了单链的Fv片段。[0194]II编码mRNA干扰酶的核酸、mRNA干扰酶及其抗体的使用
[0195]例如MazF和PemK是RNA核酸内切酶，可以用于降低或者抑制细胞、组织或者生物体内的蛋白质合成。而且，本发明的mRNA干扰酶可以特异地靶向于受试对象的特定组织，以特异降低或者抑制在靶向组织中的蛋白质合成。对于一些应用，有利的是靶向特异的RNA转录产物，用于MazF的核酸内切酶切割。这种序列可能包含升高频率的ACA序列，因此是MazF活性的天然优选靶标。或者可以通过改变MazF多肽使其特异地或者优先结合和/或切割用于切割的转录产物，从而靶向RNA转录产物用于MazF的切割。或者，可能有利的是靶向特异的RNA转录产物用于PemK的核酸内切酶切割。这种序列可能包含升高频率的UAX序列(其中X是C、A或者U),因此是PemK活性的天然优选祀标。或者可以通过改变PemK多肽使其特异地或者优先结合和/或切割用于切割的转录产物，从而靶向RNA转录产物用于PemK的切割。
[0196]特别地，mRNA干扰酶分子(例如MazF和PemK)以及本发明的组合物可以有利地用于治疗具有过度增生性疾病的患者。这些疾病包括，但不止限于，不同组织的发育异常和组织变形、炎性病症、自体免疫疾病、过度增生性皮肤疾病、牛皮癣、过敏/哮喘、动脉粥样硬化、血管成形手术后的再狭窄以及癌症。mRNA干扰酶分子(例如MazF和PemK)以及本发明的组合物可以有利地用于治疗具有细菌感染的患者。
[0197]此外，根据本发明的mRNA干扰酶核酸、蛋白质及其抗体，可以用作研究工具，鉴定其他密切参与RNA识别和切割反应的蛋白质。
[0198]A.编码mRNA干扰酶的核酸
[0199]编码MazF和PemK的核酸可以用于根据本发明的各种不同的目的。编码MazF和PemK的DNA、RNA或者其片段可以用作探针，以检测编码类MazF以及类PemK蛋白质的基因的存在和/或表达。编码MazF和PemK的核酸可以用于这种检测的探针的方法包括，但是不止限于，(I)原位杂交；(2) Southern杂交；(3) northern杂交；以及(4)各种扩增反应例如 PCR。
[0200]本发明的编码mRNA干扰酶的核酸还可以用作探针，鉴定来自其他细菌、植物或者动物物种的相关基因。本领域内众所周知的是，可以调整杂交严谨性，使核酸探针与具有不同程度同源性的互补序列之间发生杂交。因此，编码MazF和PemK的核酸可以用于鉴定和表征其他与MazF和/或PemK有不同程度相关性的基因，这样使得进一步表征RNA降解系统的性质成为可能。此外，它们可以用于鉴定编码与MazF和/或PemK相互作用的蛋白质的基因(例如通过“相互作用陷阱”技术)，这应该会进一步加快对参与RNA切割的组分的鉴定。
[0201]编码MazF或者PemK的核酸分子或者其片段还可以用于控制MazF或者PemK的生产，这样调控参与RNA切割反应的蛋白质的量。生理量的MazF或者PemK蛋白的改变可能显著影响参与RNA切割的其他蛋白质因子的活性。
[0202]B.mRNA干扰酶及其抗体
[0203]通过编码本发明MazF或者PemK的核酸的表达制备的纯化mRNA干扰酶，例如分离的MazF或者PemK蛋白，或者其片段，可以用于制备多克隆或者单克隆抗体，所述抗体可以在检查细菌细胞中MazF (或者含有MazF的复合物)或者PemK (或者含有PemK的复合物)的存在和累积时作为敏感的检测试剂。重组技术使得表达含有部分或者全部MazF或者PemK蛋白质的融合蛋白成为可能。全长的蛋白质或者蛋白质片段可以用于产生一系列对于蛋白质表位特异的单克隆抗体，这样就在检测细胞中的蛋白质时提供了更高的敏感性。 [0204]对于mRNA干扰酶(例如MazF或者PemK)免疫特异的多克隆或者单克隆抗体可以用于多种不同的检测中，对蛋白质进行检测和定量。这些检测包括，但是不止限于:(I)流式细胞仪分析；⑵在例如细菌细胞中mRNA干扰酶的免疫化学定位；以及(3)各种细胞的提取物的免疫印迹分析(例如，点印迹、Western印迹)。此外,如上面所描述,例如抗MazF和抗PemK抗体可以用于纯化MazF及其直向同源物或者PemK及其直向同源物(例如亲和柱纯化、免疫沉淀)。
[0205]mRNA干扰酶，例如MazF或者PemK蛋白，还可以用于降低或者抑制细胞、组织或者生物体中蛋白质的合成，如上面所讨论的。
[0206]从前面的讨论中，可以看出本发明中编码mRNA干扰酶的核酸、表达mRNA干扰酶的表达载体以及抗mRNA干扰酶的抗体，可以用于制备大量的mRNA干扰酶、检测mRNA干扰酶的基因表达以及改变mRNA干扰酶的积累，目的是确定参与RNA切割的遗传和蛋白质相互作用。
[0207]本发明的
【发明者】令人惊奇的发现来自细菌的稳定毒素MazF是一种核糖核酸内切酶。正如这里所描述的，MazF被作为称作“RNA干扰酶”的新型酶家族的第一个成员。而且，MazF是这个新型“RNA干扰酶”家族的示例。重要的是，在本发明的发现之前，没有发现MazF的细胞靶标。如这里所显示的，MazF的作用是高度序列特异的核糖核酸内切酶，它们在ACA位点处切割细胞的mRNA。这种活性可能对细胞内的蛋白质合成产生部分或者全部的抑制。依据四种核苷酸中的任何一种掺入到三个核苷酸位置的每一个位置的可能性是相同的原理，根据标准的计算，ACA序列出现在RNA转录产物中的预测频率是1/64。应当理解，与预测频率比较，一些RNA转录产物中包含较低或者较高频率的ACA序列。因此，特异RNA转录产物或者相关RNA转录产物家族被MazF核糖核酸内切酶切割的敏感性取决于ACA序列或者MazF靶序列在转录产物中的频率。而且，本领域内具有普通技术的人员能够根据RNA转录产物的序列预测转录产物对于MazF介导的切割的敏感性。
[0208]本发明的
【发明者】还发现PemK是这里被称为“RNA干扰酶”的新型酶家族的一个成员。如这里所显示的，PemK的作用是高度序列特异的核糖核酸内切酶，它们在UAX位点处切割细胞的mRNA，其中X是C、A或U。这种活性可能对细胞内的蛋白质合成产生部分或者全部的抑制。依据四种核苷酸中的任何一种掺入到三个核苷酸位置的每一个位置的可能性是相同的原理，根据标准的计算，UAX序列(其中X是C、A或U)出现在RNA转录产物中的预测频率是3/64。应当理解，与预测频率比较，一些RNA转录产物中包含较低或者较高频率的UAX序列。因此，特异RNA转录产物或者相关RNA转录产物家族被PemK核糖核酸内切酶切割的敏感性取决于UAX序列(其中X是C、A或者U)或者PemK靶序列在转录产物中的频率。而且，本领域内具有普通技术的人员能够根据RNA转录产物的序列预测转录产物对于PemK介导的切割的敏感性。
[0209]因此本发明
【发明者】的新发现提出了 mRNA干扰酶(例如MazF和PemK)的核酸和氨基酸序列及其组合物新的应用。这些应用包括，但是不止限于，如这里描述的各种不同的研究和治疗性应用。还提供了包含MazF和PemK核酸和/或氨基酸序列、MazF和/或PemK活性相容缓冲剂以及用法说明材料的试剂盒。
[0210]II1.编码mRNA干扰酶抑制剂的核酸分子以及mRNA干扰酶抑制剂蛋白质的制备
[0211]编码MazE和PemI的核酸分子以及MazE和PemI多肽、及其功能性片段基本上按照上面描述的制备编码MazF和PemK的核酸分子以及MazF和PemK多肽的方法产生。根据本发明，提供了编码MazE蛋白质、包含SEQ ID NO:5的核酸序列。参见图21A。还提供了包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列及其功能性片段。参见图21B。相应地提供了编码PemI蛋白、包含SEQ ID NO:7的核酸序列。参见图32A。还提供了包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列及其功能性片段。参见图32B。
[0212]IV.编码mRNA干扰酶抑制剂的核酸以及mRNA干扰酶抑制剂蛋白质的使用
[0213]本发明包括了 SEQ ID NO:5编码的MazE多肽、编码包含SEQ ID NO:6的MazE多肽的核酸序列及其功能性片段，以及包含SEQ ID NO:6的MazE多肽及其功能性片段。正如这里描述的，MazE多肽及其功能性片段表现出调节MazF活性的能力。参见实施例1II和下面的总结。
[0214] 简而言之，正如这里所表明的，纯化的(His)6MazE与mazEF启动子DNA的结合被MazF增强。在MazE N端区域的保守氨基酸残基定点突变(K7A，R8A，S12A和R16A)破坏了(His) 6MazE和MazE-MazF (His) 6复合物的DNA结合能力，提示MazE通过N端结构域与mazEF启动子DNA结合。在溶液中，MazE-MazF(His)6复合物中，MazE和MazF (His) 6的比例是大约1:2。由于MazE和MazF(His)6均以同二聚体形式存在,所以预测MazE-MazF(His)6复合物(76.9kDa)是由一个MazE 二聚体和两个MazF(His)6 二聚体组成的。还使用酵母双杂交系统研究了 MazE和MazF之间的相互作用。发现MazE的残基38到75区域对于与MazF的结合是必需的。该区域的定点诱变显示Leu55和Leu58在MazE-MazF复合物的形成中，而不是在MazE与mazEF启动子DNA的结合中起重要作用。现在的结果证明MazE由两个结构域即一个N端DNA结合结构域和一个C端MazF相互作用结构域组成。[0215]因此在一个实施方案中，本发明的MazE多肽和MazE功能性片段抑制了 MazF的活性。在一个特殊方面中，本发明的MazE多肽或MazE功能性片段抑制了 MazF核糖核酸内切酶的活性或者使核糖核酸内切酶的活性降低。的确，MazE及其功能性片段是本发明首先研究的分子，这里证明其能够实现核糖核酸内切酶活性的降低，因而实现核糖核酸内切酶底物切割的下降。示例性的能够实现核糖核酸内切酶底物切割下降的MazE功能性片段包括，但是不止限于，C端MazF相互作用结构域。在一个特定的实施方案中，C端MazF相互作用结构域包含MazE的38-75号残基区域。正如这里描述的，在这一区域发现的关键残基包括Leu55和Leu58。在另一个实施方案中，C端MazF相互作用结构域包含MazE分子的Hp-Box以及其中发现的关键残基。
[0216]在本发明的一个特定方面，MazE的两个C端肽可以通过化学合成，一个肽是 T54-K77 (24 个氨基酸残基；TLAELVNDITPENLHENIDWGEPK; SEQ ID NO:9)，另一个是N60-K77(18 个氨基酸残基；NDITPENLHENIDWGEPK;SEQ ID NO:10)。根据 MazE-MazF 复合物的X射线结构，这些多肽预计与MazF 二聚体形成稳定的抑制复合物。前一个肽含有螺旋2以及C端的酸性尾巴，后一个肽没有螺旋2。使用合成的30碱基RNA(5’ -UAAGAAGGAGAUAUACAUAUGAAUCAAAUC-3’ ; SEQID NO:11)作为底物，检查这些肽抑制MazF mRNA干扰酶活性的能力。使用完好的MazE作为对照，比较它们的抑制活性。
[0217]在另一个实施方案中，本发明的MazE多肽和MazE功能性片段增加或者提高MazF的活性。在一个特殊的方面，本发明的MazE多肽或MazE功能性片段提高MazF核糖核酸内切酶的活性或者实现核糖核酸内切酶活性的升高。的确，MazE多肽突变体及其功能性片段是第一个本发明表征 出能够实现核糖核酸内切酶活性增加并且实现核糖核酸内切酶底物切割增加的分子。示例性的能够实现核糖核酸内切酶底物切割增加的MazE多肽包括，但是不止限于，在C端MazF相互作用结构域、MazE38到75号残基、Hp-Box或者Leu55或Leu68(或者其同源位置)包含突变的MazE多肽，其中这样的突变降低或者抑制了 MazE结合MazF的能力。示例性的能够实现核糖核酸内切酶底物切割提高的MazE片段包括，但是不止限于，包含突变的MazE片段，所述突变降低或者抑制了 MazE片段结合MazF的能力。这些包含这种突变的MazE片段包括，但是不止限于，C端MazF相互作用结构域或MazE的38_75号残基区域。已知降低或者抑制MazE片段结合MazF能力的示例性的残基突变包括在Leu55和Leu58的突变。这种MazE突变体多肽和片段在这里可以被称为具有显性失活活性。一般地，显性失活多肽用于降低或者抑制相应的野生型多肽的活性，因为它们仍然能够结合并因此竞争底物和/或相互作用蛋白或者分子，但是其野生型的功能至少受到了部分削弱。
[0218]本发明还包含了 SEQ ID NO:7编码的PemI多肽、编码包含SEQ ID NO:8的PemI多肽的核酸序列以及它们的功能性片段，以及包含SEQ ID NO:8的PemI多肽及其功能性片段。正如这里所描述的，PemI多肽及其功能性片段显示了调节PemK活性的能力。能够调节PemI活性以及PemK活性的示例性的PemI功能性片段包括N端DNA结合结构域以及C端PemK相互作用结构域。参见这里下面的实施例1V。
[0219]因此，在一个实施方案中，本发明的PemI多肽和PemI功能性片段抑制了 PemK的活性。在一个特别的方面，本发明的PemI多肽或者PemI功能性片段抑制了 PemK核糖核酸内切酶活性或者实现了核糖核酸内切酶活性的降低。的确，PemI及其功能性片段是本发明首先研究的分子，这里表明其能够实现核糖核酸内切酶活性的降低，因而实现了核糖核酸内切酶底物切割的降低。
[0220]在另一个实施方案中，涉及了能够抑制PemI活性的突变形式的PemI多肽或者其衍生物或者其片段。这种PemI突变体多肽以及片段可以在这里被称为具有显性失活活性。一般地，显性失活多肽用于降低或者抑制相应的野生型多肽的活性，因为它们仍然能够结合并因此竞争底物和/或相互作用蛋白或者分子，但是其野生型的功能至少受到部分削弱。由于PemI通常与PemK结合，因此抑制了其毒性作用，阻止PemI介导的对PemK的抑制可以将PemK从这个负调控中释放出来。因此，抑制PemI活性导致PemK活性的增加。
[0221]C.鉴定能够调节MazF活性的化合物的一般方法
[0222]大肠杆菌染色体MazE/MazF上瘾组件的结构被确定到1.7埃的分辨率(Kamadaet al.,Mol Cellll, 875-884(2003))。正如这里所描述的，上瘾组件由控制细菌细胞死亡的稳定的毒素和不稳定的解毒剂蛋白组成。MazE(解毒剂)和MazF(毒素)形成一个线形的异六聚体，由毒素和解毒剂同二聚体交替组成(MazF2_MazE2_MazF2)。Kamada et al.表明MazE同二聚体含有一个β桶，从β桶延伸出两个C端，与两侧的MazF同二聚体相互作用。这种相互作用与质粒编码的毒素CcdB和Kid之间的相互作用相似。MazE/MazF异六聚体结构证明了染色体和质粒携带的上瘾组件具有共同的解毒剂-毒素识别机制，对毒素作用、在没有毒素时解毒剂的降解以及解毒剂/毒素复合物与启动子DNA的结合提供了一般的分子认识。
[0223]根据这里提出的信息，MazE中适宜的肽靶标包括，但是不止限于，那些下面列出的残基和区域。MazE中适宜的肽靶标包括N-box，MazE中高度保守的N端区域(它从残基7到残基18，介导与DNA结合)，以及其中的关键残基。MazE的N_box中的关键残基包括K7A, R8A, S12A和R16A，这些残基的突变破坏了 MazE和MazE-MazF复合物的DNA结合能力。MazE中从残基53到64的保 守C端区域Hp-Box，富含疏水残基，也是适宜的用于基于肽的治疗法的祀标。Hp-box区域参与了 MazE和MazF之间看起来最稳定的界面。Ηρ-box中疏水氨基酸残基的侧链(Leu55，Leu58, Val59和Ile62)与MazF同二聚体中的一簇疏水残基相互作用。
[0224]根据这里提出的信息，MazF中适宜的肽靶标包括，但是不止限于，那些下面列出的残基和区域。MazF中适宜的肽靶标包括R29S, N40D, T52K, Q77H, R86G, I110N, E24A和K79A残基以及包含这些关键残基的小肽(例如包含这些残基以及其侧翼残基的5-10个残基的肽)。
[0225]在本发明的一个实施方案中，2:4MazE/MazF复合物及其结构组分的晶体结构(Kamada et al.,同上)，以及在MazE和MazF之间发现的界面,被作为祀标,在一个虚拟的配基筛选步骤中，通过计算机对驳方法，从一个庞大的化合物文库中鉴定出能够以高度亲和性结合靶位点的候选化合物。
[0226]在另一个实施方案中,MazE/MazF复合物(Kamada et al.,同上)及其组分的结构信息以及在MazE和MazF之间发现的界面,被用于设计化合物,这些化合物预计与MazF和/或MazE/MazF的界面结合，并检测这些化合物是否具有高的亲和结合性。
[0227]在特定的实施方案中，选择对MazF与RNA的结合有调节作用的候选化合物和“设计的化合物”。这些化合物可以提高或者抑制MazF与RNA的结合。这种化合物可以实现底物(即RNA)切割的增加或者减少。然后对来源于任意一种方法并在对驳步骤中评分最高的化合物进行基于细胞的和无细胞的试验(在下面描述)，以确定其调节MazF活性的效力。
[0228]然后将任何在生物试验中显示效力的化合物与MazF共结晶，以发现结合位点。在本发明的另一个实施方案中，能够结合MazF的候选化合物被本领域内已知的方法修饰，进一步提高特异性质，例如提高效力和/或特异性和/或可溶性。选出的显示最合需要性质的化合物被指定为先导化合物，在例如具有过度增生性疾病的动物模型中进一步检测其效力。
[0229]D.鉴定能够调节PemK活性的化合物的一般方法
[0230]根据这里提出的信息，PemI中适宜的肽靶标包括，但是不止限于，那些下面列出的残基和区域。PemI中适宜的肽靶标包括在PemI多肽家族的成员中保守的区域。
[0231 ] 根据这里提出的信息，PemK中适宜的肽靶标包括，但是不止限于，那些下面列出的残基和区域。在β链SI和S2之间的保守环(命名为S1-S2环)以及其中的残基是适宜的肽靶标。参见图33和34获得保守区域的氨基酸序列比对以及其中的氨基酸序列。
[0232]在本发明的一个实施方案中，2:4MazE/MazF复合物及其结构组分的晶体结构(Kamada et al.,同上)，以及在MazE和MazF之间发现的界面,可以用于检查Peml/PemK复合物。因此，这些推断可以在一个虚拟的配基筛选步骤中，通过计算机对驳方法，从一个庞大的化合物文库中鉴定出能够以高度亲和性结合靶位点的候选化合物。
[0233]在另一个实施方案中，MazE/MazF复合物(Kamada et al.,同上)及其组分的结构信息以及在MazE和MazF之间发现的界面,可以用于检查Peml/PemK复合物。因此,这些推断可以用于设计化合物，这些化合物预计与PemK和/或Peml/PemK界面结合,并检测这些化合物是否具有高的 亲和结合性。
[0234]在特定的实施方案中，选择对PemK与RNA的结合有调节作用的候选化合物和“设计的化合物”。这些化合物可以提高或者抑制PemK与RNA的结合。这种化合物可以实现底物(即RNA)切割的增加或者减少。然后对来源于任意一种方法并且在对驳步骤中评分最高的化合物进行基于细胞的和无细胞的试验(在下面描述)，以确定其调节PemK活性的效力。
[0235]然后可将任何在生物试验中显示效力的化合物与PemK共结晶，以鉴定结合位点。在本发明的另一个实施方案中，能够结合PemK的候选化合物被本领域内已知的方法修饰，进一步提高特异性质，例如提高效力和/或特异性和/或可溶性。选出的显示最合需要性质的化合物被指定为先导化合物，在例如具有过度增生性疾病的动物模型中进一步检测其效力。
[0236]通过弹性对驳技术(Flexible Docking Technology)进行的虚拟配基筛选
[0237]目前的对驳和筛选方法可以使用一个特异的蛋白质结构从大的化合物文库中选择少量可能的先导候选配基。这种方法在例如Abagyan和Totrov (2001) Current OpinionChemical Biology5:375-382中有所描述，这里将其全部引用作为参考。
[0238]基于高通量弹性对驳的虚拟配基筛选(VLS)在设计和鉴定能够与某个特定蛋白结构结合的化合物时是有用的。VLS可以用于虚拟地从大量化学分子中取样而不需要合成和在实验中检测每一个化学分子。一般地，该方法从多肽建模开始，它使用通过常规方式例如X射线晶体衍射、NMR、同源建模选择的蛋白质结构。然后使用任何一种现有的对驳程序，例如 MCDOCK (Liu et al.(1999) J.Comput.Aided Mol.Des.13:435-451), SEED(Majeux et al.(1999) Proteins37:88-105;DARWIN (Tayloret al.(2000)Proteins41:173-191;MM(David et al.(2001)J.Comput.Aided Mo 1.Des.15:157-171，将一组化合物和/或分子片段对驳到选择的结合位点中。将化合物按照配基评分，产生一系列预计具有最高结合亲和性的候选化合物，用于在体外和体内进一步检测和/或化学修饰。
[0239]在VLS的一种方法中，在化学制备之前，将分子“建造”到选择的结合口袋中。设计了大量的程序用于一个原子接着一个原子“生长”配基[参见例如GENSTAR (Pearlman et al.L(1993)J.Comput.Chem.14:1184)，LEGEND (Nishibataet al.(1993)J.Med.Chem.36:2921-2928),MCDNLG(Rotstein et al.(1993)J.Comput-Aided Mol.Des.7:23-43),CONCEPTS(Gehlhaar et al.(1995)J.Med.Chem38:466-472]或者一个片段接着一个片段“生长”配基[参见例如GROUPBUILD(Rotsein et al.(1993)J.Med.Chem.36:1700-1710)，SPROUT(GiIlet etal.(1993) J.Comput.Aided Mol.Des.7:127-153)，LUDI (Bohm (1992) J.Comput.AidedMol.Des.6:61-78)，BUILDER (Roe (1995) J.Comput.Aided Mol.Des.9:269-282)，和SMOG(Deffitte et al.(1996)J.Am.Chem.Soc.118:11733-11744]?
[0240]对于一个特定蛋白的配基的评分方法是已知的，其可以将少量的能够结合蛋白质结构的分子与大量的非结合物区别开来。参见，例如，Agagyan et al.(2001)同上，关于通过虚拟配基对驳和筛选方法鉴定出的大量成功配基的报告。
[0241]例如，Nishibataet al.(1993) J.Med.Chem36:2921-2928 描述了一个结构构建程序根据一个分子(二氢叶酸还原酶)活性位点的三维结构产生抑制性分子的能力。该程序能够预测具有与四个已知的酶抑制 剂相似结构的分子，提供有力的支持，即为使用靶三维结构的知识获得新型先导化合物提供了有力支持。类似地，Gillet et al.(1993) J.ComputerAided Mol.Design7:127-153描述了通过基于空间限制的人工智能技术(SPROUT)产生的结构。
[0242]通过本发明的筛选方法鉴定的因子
[0243]本发明提供了鉴定以高度亲和性与mRNA干扰酶(例如MazF或PemK)或mRNA干扰酶抑制剂(例如MazE或PemI)结合的因子(例如候选化合物或者测试化合物)的方法。通过本发明的方法鉴定出的因子可以作为抗过度增生性疾病和抗细菌治疗方法的候选因子。
[0244]因子、候选化合物或者测试化合物的示例包括,但是不止限于，核酸(例如DNA和RNA)、糖、脂、蛋白质、肽、肽模拟物、小分子以及其他药物。可以使用本领域内已知的组合库中多种方法中的任何一种方法得到因子，包括:生物文库，空间可定位平行固相或者液相文库；需要进行反卷积的合成文库方法；“一珠一化合物(one-head one-compound)”文库方法；以及使用亲和层析选择的合成文库方法。生物文库方法限于肽文库，而其他四种方法可以用于肽、非肽寡聚物或者小分子化合物文库(Lam(1997)Anticancer Drug Des.12:145;美国专利编号5，738，996;和美国专利编号5，807，683，在这里分别以其整体引用作为参考)
[0245]合成分子文库的方法的示例可以在本领域内找到，例如在DeWitt etal.(1993) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:6909 ; Erb et al.(1994) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA91:11422;Zuckermann et al.(1994) J.Med.Chem.37:2678;Cho et al.(1993)Science261:1303;CarrelI et al.(1994)Angew.Chem.1nt.Ed.Engl.33:2059;Carellet al.(1994) Angew.Chem.1nt.Ed.Engl.33:2061;以及 Gallop et al.(1994) J.Med.Chem.37:1233中，每一个文献在这里以其整体引用作为参考。
[0246]化合物文库可以存在于例如溶液中(例如Houghten (1992) Bio/Techniquesl3:412-421 )，或存在于珠上(Lam(1991) Nature354:82-84)、存在于芯片上(Fodor (1993) Nature364:555-556)、存在于细菌中(美国专利编号 5，223，409)、存在于孢子中(美国专利编号5，571，698;5，403，484;和5，223，409)、存在于质粒中(Cullet al.(1992) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:1865-1869)或者存在于噬菌体中(Scottand Smith(19900Science 249:386-390;Devlin (1990)Science249:404-406;Cwirlaet al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA87: 6378-6382 ; and Felici (1991) J.Mol.Biol.222:301-310)，每一个文献在这里以其整体引用作为参考。
[0247]筛选试验
[0248]通过上面描述的虚拟配基对驳和筛选方法鉴定的小分子，进一步进行体外和体内试验。在一个实施方案中，通过基于细胞的检测系统鉴定出与mRNA干扰酶(例如MazF或PemK)或者mRNA干扰酶抑制剂如MazE或PemI相互作用(即结合)的因子。为了清楚和简洁的目的，使用MazF和MazF片段描述这些检测的剩余部分，但是应当理解这些检测/方法还可以应用于其他的mRNA干扰酶及其片段，例如MazE和MazE片段，PemK和PemK片段，以及PemI和PemI片段。
[0249]根据该实施方案，表达MazF或者其功能性片段的细胞与候选化合物或者对照化合物接触，测定候选化合物与MazF相互作用的能力。如果需要，可以用这种检测来筛选多个(例如一个文库)的候选化合物。细胞可以是原核来源的(例如大肠杆菌)或者真核来源的(例如酵母或者哺乳动物)。而且，细胞可以内源表达MazF或者其片段，或者经过基因工程改造表达MazF或者其片段。在某些情况中，MazF或者MazF片段被标记，例如使用放射性标记(例如32P，35S或者1251)，或者使用荧光标记(例如异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红素、藻蓝素、别藻蓝素、邻苯二醛或者荧光胺)，使得MazF和候选化合物之间的相互作用能够被检测到。候选化合物与MazF的相互作用使用本领域内技术人员已知的方法进行测定。例如候选化合物与MazF的相互作用可以使用细胞流式仪、闪烁检测法、免疫沉淀或者Western印迹分析。
[0250]在另一个实施方案中，使用无细胞的检测系统，鉴定与MazF或者其相关片段相互作用(即结合)的因子。根据该实施方案，天然或者重组的MazF或者其片段与候选化合物或者对照化合物接触，测定候选化合物与MazF相互作用的能力。如果需要，可以用这种检测来筛选多个(例如一个文库)候选化合物。在一个实施方案中，首先将MazF或者其片段固定化(通过例如与特异识别并且结合MazF或者其片段的固定化抗体接触，或者通过使纯化的MazF或者其片段的制备物与一个设计用于结合蛋白的表面接触)。MazF或者其片段可以部分或者完全纯化(即部分或者完全没有其他多肽)或者是细胞裂解物。此外，MazF或者其片段可以是融合蛋白，该融合蛋白包含MazF或者其生物活性部分以及结构域例如谷胱甘肽-S-转移酶。或者MazF或其生物活性部分可以使用本领域内技术人员众所周知的方法进行生物素化(例如生物素化试剂盒，Pierce Chemicals;Rockford, IL)。候选化合物结合MazF的能力使用本领域内技术人员已知的方法进行测定。
[0251] 在另一个实施方案中，在动物模型中鉴定调节MazF活性的因子。适宜动物的示例包括，但是不止限于，小鼠、大鼠、兔、猴子、豚鼠、狗以及猫。优选地，使用的动物代表过度增生性疾病的模型。根据该实施方案，向适宜的动物给服待测化合物或者对照化合物(例如口月艮、直肠给药、非肠道给药例如腹膜内或者静脉内)，测定对活性水平的效果。
[0252]E.能够结合mRNA干扰酶的因子或者mRNA干扰酶抑制剂的治疗性用途
[0253]本发明提供了通过给予使用以上描述的方法鉴定的治疗性化合物，治疗过度增生性疾病。这种化合物包括，但是不止限于，蛋白质、肽、蛋白质或肽的衍生物或者类似物、抗体、核酸和小分子。
[0254]本发明提供了治疗受到过渡增殖疾病困扰的患者的方法，该方法包括向受试对象施用有效量的通过本发明的方法鉴定的化合物。在一个优选的方面，化合物是基本纯化的(例如基本没有限制该化合物的作用或者产生不希望的副作用的物质)。受试对象优选是动物，包括但是不止限于，奶牛、猪、马、鸡、猫、狗等等，优选是哺乳动物，最优选是人。在一个特定的实施方案中，非人的哺乳动物是受试对象。
[0255]当化合物包含核酸时可以使用的制剂和给药方法如上面所描述；其他适当的制剂和给药途径在下面描述。
[0256]已知各种不同的递送系统可以用于施用本发明的化合物，例如包裹在脂质体、微粒、微胶囊中，能够表达化合物的重组细胞，受体介导的细胞内吞作用(参见例如Wu andWu (1987) J.Biol.Chem.262:4429-4432)，以及将核酸构建为逆转录病毒或者其他载体的一部分。导入方法可以是肠内或者肠胃外的途径，包括但是不止限于，皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。化合物可以通过任何方便的途径进行施用，例如灌注或者弹丸式注射，通过经上皮或者粘膜层(例如口腔粘膜、直肠粘膜和小肠粘膜等)的吸收，也可以与其他的生物 活性因子一同施用的。给药可以是全身或者局部的。此外，可能需要将本发明的药物组合物通过任何适宜的途径引入中枢神经系统中，包括心室内和鞘内注射；可以通过例如与一个贮器Gn0_aya贮器)相连的心室内导管帮助心室内注射。也可以使用肺部给药，例如通过使用吸入器或者雾化器，和具有气溶胶化试剂的制剂。
[0257]在一个特定的实施方案中，可能需要将本发明的药物组合物局部给药，例如通过在手术中的局部灌注，局部应用，例如通过注射，借助于导管，借助于移植物，所述的移植物是多孔的、非多孔的或者明胶状的材料，包括膜如sialastic膜，或者纤维)。在一个实施方案中，给药可以通过直接注射到CSF中或者在肿瘤部位(例如，在CNS组织中)。
[0258]在另一个实施方案中，可以用载体，特别是脂质体递送化合物(参见Langer(1990)Science249:1527-1533;Treat 等人,Liposomes in the Therapy ofInfectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein和Fidler (eds.)，Liss, New York, pp.353-365(1989) ; Lopez-Berestein,同上，pp.317-327;参见一般的，同上)
[0259]在另一个实施方案中，化合物可以在受控释放系统中递送。在一个实施方案中，可以使用泵(参见 Langer,见前;Sefton (1987) CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201; Buchwald等人(1980)Surgery88:507;Saudek 等人，1989，N.Engl.J.Med.321:574)。在另一个实施方案中，可以使用聚合物材料(参见Medical Applications of ControlledRelease, Langer 和 Wise(eds.)，CRC Pres., Boca Raton, Florida(1974);ControlledDrug Bioavailability, Drug Product Design and Performance,Smolen 和Ball (eds.), Wiley, New York (1984) ; Ranger 和 Peppas, J.，1983，Macromol.Sc1.Rev.Macromol.Chem.23:61;还参见 Levy 等人(1985) Science228:190; During 等人(1989)Ann.Neurol.25:351; Howard 等人(1989) J.Neurosurg.71:105)。在另一个实施方案中，可以将受控释放系统置于治疗靶(即靶组织或者肿瘤)附近，这样需要的剂量只是全身剂量的一部分(参见例如 Goodson, Medical Applications of ControlledRelease,见前，vol.2，pp.115-138 (1984))。其他的受控释放系统在Langer的综述(1990，Science249:1527-1533)中有讨论。
[0260]F.药物组合物
[0261]本发明还提供了药物组合物。这种组合物包含治疗有效量的因子以及药物上可以接受的载体。在一个特殊的实施方案中，术语“药物上可以接受的”意思是由联邦或者州政府的管理机构批准或者在美国药典或者其他一般承认的药典中列出用于动物，更为特别地用于人类。术语“载体”指的是与治疗药物一同施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或者载体(Vehide)0这些药物载体可以是无菌的液体,例如水或者油,包括石油、动物油、植物油或者合成来源的油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等等。当药物组合物通过静脉内施用时，水是优选的载体。盐溶液和含水的葡萄糖和甘油溶液也可以用作液体载体，特别是对于注射用的溶液。[0262]适宜的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠，干的脱脂奶、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等等。如果需要的话，组合物还可以含有少量的润湿剂或者乳化剂或者PH缓冲剂。这些组合物的形式可以是溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉剂、缓释制剂等等。组合物还可以配制为栓剂，带有传统的粘合剂和载体如三甘油酯。口服制剂可以包括标准的载体，例如药物级别的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等等。适宜的药物载体的示例在 E.ff.Martin 的"Remington’s PharmaceuticalSciences^ 中有所描述，在这里以其整体引用作为参考。这些组合物含有药物有效量的组合物，优选以纯化的形式，以及适宜量的载体，以提供用于向受试对象正确给药的形式。制剂应当适合于给药的方式。
[0263]在一个优选的实施方案中，组合物根据常规的步骤配制为适于向人进行静脉注射的药物组合物。通常用于静脉给药的组合物是在无菌等渗含水缓冲剂中的溶液。在必要的时候，组合物还可以包括增溶剂和局部麻醉剂如利多卡因以缓解注射部位的疼痛。一般的，这些成分分开供应或者混合在一起以单位剂量形式供应，例如以密封在标明活性因子量的气密型容器(如安瓿或者小药囊(sachette))的干燥冻干粉末或者无水浓缩物的形式。如果组合物通过灌注给药时，可以使用含有无菌的药物级别的水或者盐水的输液瓶进行配药。如果组合物通过注射给药时，可以提供一安瓿的注射用无菌水或者盐水，以使成分可在给药前混合。
[0264]本发明的化合物可以配制成中性或者盐的形式。药物上可以接受的盐包括那些由游离氨基基团形成的盐，例如盐酸盐、磷酸盐、乙酸盐、草酸盐、酒石酸盐等等，以及那些由游离羧基基团形成的盐，其例如为源自钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺，2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等等的盐。
[0265]可以通过基于本描述的标准临床技术确定对于治疗过度增生性疾病(例如癌症)有效的本发明化合物的量。此外，还可以可选地进行体外测定，帮助确定最佳的剂量范围。在制剂中使用的精确剂量还取决于给药途径以及疾病或者病症的严重程度，应该根据医师的判断以及每一个受试对象的情况确定。但是，用于静脉内给药的适宜剂量范围一般是每千克体重大约20 - 500微克的活性化合物。用于鼻内给药的适宜剂量范围一般是每千克体重大约0.01皮克一 I毫克。栓剂含有的活性成分的范围一般是0.5重量％-10重量％ ；口服制剂优选地含有10%-95%的活性成分。可以根据来自体外或者动物模型测试系统的剂量一响应曲线外推出有效的剂量。
[0266]核酸
[0267]本发明提供了鉴定能够结合mRNA干扰酶(例如MazF或者PemK)的因子以实现mRNA干扰酶的核糖核酸内切酶活性增加的方法。因此,本发明包括施用核酸,该核酸编码mRNA干扰酶或者其直向同源物的肽或蛋白质激活剂，以及能够干扰mRNA干扰酶(例如MazE或PemI)或者其直向同源物的内源抑制剂表达的反义序列或者催化性RNA。
[0268]在一个实施方案中，所施用的核酸包含的序列编码能够竞争结合mRNA干扰酶的肽或者蛋白质。本领域内可利用的任何用于施用核酸序列的适宜方法都可以根据本发明进行使用。
[0269]施用和表达核酸序列的方法在基因治疗领域中一般是已知的。对于基因治疗方法的一般性综述，参见 Goldspiel et al.(1993)Clinical Pharmacy 12:488-505;Wuand Wu(1991)Biotherapy3:87-95;Tolstoshev(1993)Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32:573-596;Mulligan(1993)Science260:926-932;以及 Morgan and Anderson(1993)Ann.Rev.Biochem.62:191-217; May (1993) TIBTECH11 (5):155-215.重组 DNA 【技术领域】中通 常已知的、可以用于本发明的方法在Ausubel et al.(eds.), 1993, Current Protocolsin Molecular Biology, John ffiley&Sons, NY ；和 Kriegler(1990)Gene Transfer andExpression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY,中予以描述。
[0270]在一个特殊方面，化合物包含的核酸编码能够结合mRNA干扰酶以实现mRNA干扰酶核糖核酸内切酶活性增加的肽或者蛋白质，这种核酸是在适宜的宿主中表达肽或者蛋白质的表达载体的一部分。特别地，这种核酸具有与编码区域有效连接的启动子，所述的启动子是可诱导的或者是组成型的(以及选择性地，组织特异的)。在另一个特别的实施方案中，使用了核酸分子，其中的编码序列和任何其他所需的序列被促进在染色体中的所需位点处发生同源重组的区域包围，这样提供了核酸的染色体内表达(Koller和Smithies (1989)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA86:8932-8935;Zijlstra et al.(1989)Nature342:435-438)。
[0271]可以直接将核酸递送到受试对象的体内，这时受试对象与核酸或者携带核酸的载体直接接触，这种方式被称为体内基因治疗。可选择地，核酸递送到受试对象的体内是间接的，这时首先在体外用核酸转化细胞，然后将细胞移植到受试对象体内，这被称为“离体基因治疗”。
[0272]在另一个实施方案中，核酸在体内直接施用，在体内其表达产生编码的产物。这可以通过本领域内已知的多种方法中的任何一种来实现，例如通过将核酸构建为适当的核酸表达载体的一部分并施用之，这样核酸就成为细胞内的，例如通过使用缺陷的或者减毒的逆转录病毒或者其他病毒载体感染(参见美国专利号4，980，286);通过使用裸露的DNA直接感染；通过使用微粒轰击(例如基因枪；Biolistic, Dupont);通过使用脂类、细胞表面受体或者转染剂包被；通过使用脂质体、微粒或者微胶囊包裹；通过将核酸连接在已知进入到细胞核内的肽上；或者将核酸与配基连接，该配基会经历受体介导的内吞作用(参见例如Wu和Wu, 1987，J.Biol.Chem.262:4429-4432)，这可以用于靶向特异表达该受体的细胞类型。
[0273]在另一个实施方案中，可以形成核酸一配基复合物，其中的配基包含融合病毒肽，以破坏内体，使核酸避免被溶酶体降解。在另一个实施方案中，可以通过靶向一个特异的受体，在体内使得核酸能够达到细胞特异的摄取和表达(参见例如PCT出版物W092/06180，1992-4-16 (ffu et al.) ;W092/22635,1992-12-23(Wilson et al.) ;W092/20316,
1992-11-26(Findeiset al.) ;W093/14188,1993-7-22(Clarke et al.), W093/20221,
1993-10-14(Young))。可选择地，将核酸引入细胞内，通过同源重组整合在宿主细胞DNA中以用于表达(Koller 和 Smithies, 1989, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA86:8932-8935; Zi jlstraet al.(1989)Nature342:435-438)。
[0274]在另一个实施方案中，可以使用逆转录病毒载体(参见Miller etal.(1993)Meth.Enzymol.217:581-599)。已经对这些逆转录病毒载体进行了修饰，删除了病毒基因组包装和整合进入宿主细胞DNA中不必需的逆转录病毒序列。编码将要在基因治疗中使用的mRNA干扰酶的核酸被克隆到载体中，这有利于将基因递送到受试对象中。关于逆转录病毒载体的更多细节可以在Boesen et al.(1994)Biotherapy6:291_302中找到，它描述了使用逆转录病毒载体将mdrl基因递送到造血干细胞中，目的是使干细胞对化疗更有抵抗力。阐释逆转录病毒载体在基因治疗中的用途的其他参考文献有Clowes et al.(1994) J.Clin.1nvest.93:644-651;Kiem et al.(1994)Blood83:1467-1473;Salmons 和 Gunzberg(1993)Human Gene Therapy4: 129-141;以及 Grossman 和 Wilson (1993) Curr.0pin.1n Geneticsand Devel.3:110-114。
[0275]还可以在基因治疗中有效地使用腺病毒。腺病毒在将基因递送到呼吸道上皮方面是有特别有吸引力的载体。腺病毒天然感染呼吸道上皮并导致轻度疾病。基于腺病毒的递送系统的其他靶标有肝脏、中枢神经系统，上皮细胞和肌肉。腺病毒的优点是能够感染非分裂细胞。Kozarsky 和 Wilson(1993)Current Opinion in Genetics andDevelopment3:499_503 综述了基于腺病毒的基因治疗。Bout et al.(1994)Human GeneTherapy5:3-10证明了腺病毒载体对于将基因转移到恒河猴的呼吸道上皮中的用途。在基因治疗中使用腺病毒的其他实例可以在以下文献中找到:Rosenfeld et al.(1991)Science252:431-434;Rosenfeld et al.(1992)Ce1168:143-155;MastrangeIi etal.(1993) J.Clin.1nvest.91:225-234;PCT 出版物 W094/12649;和 Wang, et al.(1995)Gene Therapy2:775-783。已经有人建议将腺伴随病毒(AAV)用于基因治疗(Walsh etal.(1993)Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204:289-300;美国专利号 5，436，146)。
[0276]另一个基因治疗的适宜方式包含通过诸如电穿孔、脂转染、磷酸钙介导的转染或者病毒感染的方法将转移到组织培养的细胞中。通常，转移的方法包括将选择标记转移到细胞中。然后将细胞置于选择压力下，以分离那些摄取并表达了转移的基因的细胞。然后将那些细胞递送到受试对象中。
[0277]在该实施方案中，将核酸引入到细胞中，然后将得到的重组细胞进行体内施用。这种核酸的引入可以通过本领域内任何已知的方法进行，包括但是不止限于，转染、电穿孔、微注射、使用含有核酸序列的病毒或者噬菌体载体感染、细胞融合、染色体介导的基因转移、微细胞介导的基因转移、原生质球融合等等。对于将外源基因引入细胞中，在本领域内已知有许多技术(参见例如 Loeffler 和 Behr (1993) Meth.Enzymol.217:599-618; Cohen etal.(1993)Meth.Enzymol.217:618-644;Cline(1985)Pharmac.Ther.29:69-92)，它们可以根据本发明使用，条件是受体细胞必需的发育和生理功能不受到破坏。该技术应该将核酸稳定转移至细胞中，这样核酸可以被细胞表达，优选地，可被该细胞的后代继承和表达。
[0278]可以通过本领域内已知的各种不同方法将产生的重组细胞递送到受试对象中。在一个优选的实施方案中，例如通过皮下注射上皮细胞。在另一个实施方案中，将重组皮肤细胞作为皮肤移植物施加到受试对象上；重组血细胞(例如造血干细胞或者始祖细胞)优选地通过静脉内施用。预计使用的细胞量取决于所需的作用、受试对象的状况等等，并且可以由本领域的技术人员确定。
[0279]可以将核酸引入以用于基因治疗的细胞包括任何所需的，可获得的细胞类型，包括但是不止限于神经元细胞、神经胶质细胞(例如少突胶质细胞、星形胶质细胞)、上皮细胞、内皮细胞、角质形成细胞、成纤维细胞、肌肉细胞、肝细胞；血细胞例如T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜曙红粒细胞、巨核细胞、粒细胞；各种不同的干细胞或者始祖细胞，特 别是造血干细胞或者始祖细胞，例如从骨髓、脐带血、外周血或者胎儿肝脏中获得的那些。在一个优选的实施方案中，用于基因治疗的细胞是接受治疗的受试对象的自体细胞。
[0280]在另一个实施方案中，将要引入以用于基因治疗的核酸可以包含与编码区域有效连接的可诱导启动子，使得核酸的表达可以通过调整适当的转录诱导物的浓度来控制。
[0281 ] 直接注射编码能够结合mRNA干扰酶的肽或蛋白质的DNA或者能够干扰mRNA干扰酶(例如，MazE或PemI，或其直向同源物)的内源抑制剂表达的因子，可以根据例如美国专利号5，589, 466中描述的技术进行。这些技术包括注射“裸露的DNA”,即除了适宜的载体以外没有脂质体、细胞或者任何其他材料的分离的DNA分子。注射编码蛋白质并与适宜的启动子有效连接的DNA，使该蛋白质在邻近注射部位的细胞中产生。
[0282]G.试剂盒
[0283]本发明还提供了药物包或者试剂盒,该药物包或者试剂盒包含一个或者多个容器，容器中装有本发明药物组合物的一种或者多种成分。这种容器可选地附带的可以是管理药物或者生物制品的生产、使用或者销售的政府机构规定的通告，通告上表明(a)经过生产、使用和销售的机构批准，用于人体施用，(b)使用说明，或两者。
[0284]提出以下的实施例，为本领域内具有普通技术的人员提供关于如何制备和使用本发明的检测、筛选以及治疗方法的完整的公开和描述，并不是要限制
【发明者】所认为的他们的发明的范围。已经投入力量确保所用数目(例如量，温度等等)的准确性，但是应当解释一些实验错误和偏差出现的原因。除非有其他说明，份是重量份，分子量是平均分子量，温度是摄氏度，压力为大气压或者接近大气压。
[0285]提供以下的实验方案，以有助于本发明的实施。
[0286]实施例1
[0287]正如这里描述的，使用甲苯处理使大肠杆菌细胞通透化，并将这些细胞用于证明MazF抑制翻译，但是对RNA合成或者DNA复制没有抑制。而且显示出，MazF在ACA序列的A和C残基之间以不依赖于核糖体的方式特异切割mRNA。因此，本发明证明了 MazF通过在特异位点切割mRNA而干扰mRNA的功能。因此，本发明的
【发明者】发现MazF是新型的核糖核酸内切酶，在这里将其命名为“mRNA干扰酶”。
[0288]材料和方法
[0289]菌株和质粒。使用了大肠杆菌BL21(DE3)、BW25113 (Datsenko 和 Wanner, ProcNatl Acad Sci U S A97, 6640-5(2000))和 MRE600(Swaney et al., Antimicrob AgentsChemother42, 3251-5 (1998))。从质粒 pET_21cc (Novagen)构建质粒 pET-21cc_MazEF,其被修饰成在T7启动子的控制下表达MazE和MazF(His)6。但是Shine-Dalgarno (SD)序列来自 mazEF 操纵子。使用 pET_28a (Novagen)构建质粒 pET-28a_MazE,以表达(His)6MazE。使用 pBAD (Guzman et al.，J Bacteriol 177，4121-30(1995))构建 pBAD-MazF，以在加入 0.2%阿拉伯糖后严谨地调控mazF的表达。
[0290]甲苯处理的细胞中的蛋白质、DNA和RNA合成的检测。50毫升含有质粒pBAD_MazF的大肠杆菌BW25113培养物在甘油-M9培养基中于37摄氏度生长。当培养物的0D_达到0.6时，加入阿拉伯糖使终浓度为0.2%。于37摄氏度孵育10分钟后，用1%甲苯处理细胞(Halegoua et al., Eur J Biochem69, 163-7 (1976))。根据以前的描述使用 35S-甲硫氨酸进行蛋白质合成(Halegoua et al., J Bacterioll26, 183-91 (1976))。甲苯处理的细胞在室温下用0.05M磷酸钾缓冲液(pH7.4)洗一次，然后重悬于同一缓冲液中，以根据以前的描述用[a-32P] dTTP 检查 DNA 的合成(Moses 和 Richardson, Proc Natl Acad SciUSA67, 674-81 (1970))。对于RNA合成的检测，甲苯处理的细胞在室温下用0.05M Tris-HCl缓冲液(PH7.5)洗一次，然后重悬于同一缓冲液中，以根据以前的描述测量[a-32P]UTP向RNA 中的惨入(Peterson et al., J Bacterioll07, 585-8 (1971))。
[0291 ] 体内蛋白质合成的检测。含有pBAD-MazF的大肠杆菌BW25113细胞生长在甘油_M9培养基中。当培养物的 0D_达到0.6时，将其分成两等份。其中一份中加入阿拉伯糖至终浓度为0.2%，第二份中加入水。以在图2D中所示的不同时间间隔，取出I毫升的培养物至含有2 μ Ci35S-甲硫氨酸的试管中，混合物在37摄氏度孵育I分钟。然后将50微升反应混合物施加于一个滤纸盘(Whatman3mm, 2.3厘米直径)上。根据以前的描述(Hirashima和Inouye, Nature242, 405-7(1973))用5%TCA溶液处理滤纸，并用液闪计数器定量测定放射性。剩余的500微升反应混合物加入到含有25微升100%TCA溶液和100微克/毫升非放射性甲硫氨酸的冷却的试管中。混合物在冰浴上孵育60分钟。离心后收集沉淀，通过将混合物在沸水浴中孵育30分钟而溶解在50微升的SDS-PAGE上样缓冲液中。除去不溶的物质以后，将上清液(10微升)通过SDS-PAGE进行分析。
[0292]MazF (His)6 和(His) 6MazE 蛋白的纯化。从携带 pET-21cc_MazEF 的菌株BL21 (DE3)中纯化C末端标记的MazF(His)6。首先用N1-NTA树脂纯化MazF(His)6和MazE复合物。用6M盐酸胍将MazE从MazF (His) 6上解离下来以后，在N1-NTA树脂上重新纯化，并通过逐步透析而使蛋白质重折叠。从携带pET-28a-MazE的菌株BL21 (DE3)中纯化N端标记的(His) 6MazE。
[0293]MazF对于原核和真核无细胞系统中蛋白质合成的影响。
[0294]使用大肠杆菌T7S30提取物系统(Promega)进行原核无细胞蛋白质合成。反应混合物由10微升S30预混合物、7.5微升S30提取物和2.5微升的氨基酸混合物(除甲硫氨酸以外，每种氨基酸ImM)。I微升35S-甲硫氨酸、以及不同量的MazF(His)f^P (His)6MazE组成，终体积为24微升。反应混合物在37摄氏度孵育10分钟，通过加入I微升pET-1 Ia-MazG质粒-DNA (0.16 微克 /微升)开始检测(Zhang和 Inouye, J Bacteriol 184，5323-9 (2002))。反应在37摄氏度进行I小时，用丙酮沉淀蛋白，并通过SDS-PAGE进行分析。使用用于PCRDNA兔网织红细胞裂解物系统TNT?T7Quick(Promega)进行真核无细胞蛋白质合成。使用编码人蛋白并在T7启动子控制下的DNA片段作为mRNA转录的模板。反应在37摄氏度进行I小时，用丙酮沉淀蛋白，并通过SDS-PAGE进行分析。
[0295]多核糖体分布图。含有pBAD-MazF质粒的大肠杆菌BW25113的过夜培养物用新鲜的甘油-M9培养基稀释50倍。37摄氏度孵育5小时后，加入阿拉伯糖至终浓度为0.2%。诱导MazFlO分钟后加入氯霉素至终浓度为100微克/毫升。离心收集细胞沉淀，重悬于含有 10mMMgCl2、60mM NH4ClUmM DTT 和 I 毫克 / 毫升溶菌酶的 I 毫升 IOmMTris-HCl (pH7.8)中。液氮冻融两次后，在Beckman TLA100.3转子中以24000rpm将裂解物离心20分钟。上清液(300微升)加入到5-40%蔗糖梯度中以获得多核糖体分布图。不加阿拉伯糖进行相似的实验。通过OD28tl检查核糖体图谱(pattern),梯度从左(40%)到右(5%)。所指示处加入春日霉素至终浓度为500微克/毫 升。
[0296]大肠杆菌70S核糖体的制备。根据以前的描述(Aoki et al., Antimicrob AgentsChemother46, 1080-5(2002);Du 和 Babitzke, J Biol Chem273, 20494-503(1998);Hesterkamp et al., J Biol Chem272, 21865-71 (1997))从大肠杆菌 MRE600 中制备 70S 核糖体，有少量改动。细菌细胞(2克)悬浮于缓冲液A[10mM Tris-HCl (pH7.4)，含有IOmM MgCl2, 60mMNH4Cl和6mM2-巯基乙醇]中。用弗氏压碎器裂解细胞。与无RNA酶的DNA酶孵育(O摄氏度30分钟)之后，在Beckman50Ti转子中以30000rpm于4摄氏度离心30分钟两次以去除细胞碎片。上清液(上面的3/4)加入到等体积的缓冲液B (含有0.5M NH4Cl的缓冲液A)中的1.1M鹿糖中，在Beckman50Ti转子中以45000rpm于4摄氏度离心15小时。核糖体沉淀用缓冲液A漂洗之后，重悬于缓冲液A中，并施加至缓冲液A制备的10-30% (重量/体积)线性蔗糖梯度中，在Beckman SW40Ti转子中以20000rpm于4摄氏度离心15小时。将梯度按级分离，混合70S核糖体级分，并在Beckman50Ti转子中以45000rpm于4摄氏度离心20小时以使其沉淀。70S核糖体沉淀重悬于缓冲液A中，一 80摄氏度储存。
[0297]引物延伸抑制(趾纹法)检测。根据以前的描述(Moll和Blasi, Biochem BiophysRes Commun297, 1021-1026(2002))进行趾纹法，有小的调整。用于引物模板退火的混合物含有mazG mRNA和32P-末端标记的DNA引物，它与mazG mRNA的65-85碱基互补。将该混合物在65摄氏度孵育5分钟，然后缓慢冷却至室温。核糖体结合混合物含有2微升IOX缓冲液[IOOmM Tris-HCl (ρΗ7.8)，含有 IOOmM MgCl2, 600mM NH4Cl 和 IOmM DTT]，不同量的MazF (His) 6，0.375mM dNTP, 0.5 μ M70S 核糖体亚基，2.5μ M t RNAaet 和 2 微升的退火混合物，终体积为20微升。最终的mRNA浓度为0.05 μ M。核糖体结合混合物在37摄氏度孵育10分钟，然后加入2U逆转录酶。cDNA的合成于37摄氏度进行15分钟。加入12微升测序上样缓冲液来终止反应。样品在90摄氏度孵育5分钟，然后在6%聚丙烯酰胺测序凝胶上进行电泳。使用T7RNA聚合酶从含有Τ7启动子的173-bp DNA片段中体外合成mazGmRNA。由T7启动子和从+1至+153的mazG mRNA构成的DNA片段通过使用pET_lla_MazG质粒作为DNA模板的PCR扩增而得到。
[0298]酚抽提后的mazG mRNA的趾纹法。实验按照以上描述的方法进行，唯一区别是省掉了 70S核糖体和tRNAfMet。在引物延伸之前用酚抽提反应混合物以除去蛋白质。[0299]突变体质粒的构建。使用pET-1 Ia-MazG质粒作为DNA模板进行定点诱变。通过DNA序列分析对突变进行确证。
[0300]RNA分离和Northern印迹分析。含有pBAD-MazF的大肠杆菌BW25113在甘油-M9培养基中于37摄氏度生长。OD6tltl值达到0.8时，加入阿拉伯糖至终浓度为0.2%。以如图4D所示的不同间隔取样。根据以前的描述(Sarmientos et al.，Cell32，1337-46 (1983))，使用热酚法分离总RNA。根据以前的描述(Baker和Mackie, Mol Microbiol47, 75-88 (2003))进行Northern印迹分析。
[0301]有关附图的具体的方法学细节
[0302]如图1A所示，MazF的表达对细胞有毒性作用。使用质粒pBAD_MazF，pBAD-MazFR29S或pBAD-MazF R86G分别转化大肠杆菌BW25113 ( Λ araBAD)细胞。细胞涂布在含有和没有阿拉伯糖(0.2%)的甘油-M9平板上，接种了的平板在37摄氏度孵育24小时。图1B显示了大肠杆菌(Escherichi coli) (NP_289336.1)的MazF和耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans) (NP_244588.1),表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)(AAG23809.1)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) (NP_372592.1)、枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis) (1NE8_A)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitides)(NP_266040.1),摩氏摩根氏菌(Morganella morgani ) (AAC82516.1)以及结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis) (NP_217317.1)的 MazF 的序列比对。
[0303]图2A显示MazF的表达对35S-Met向甲苯处理的细胞中掺入的影响。具体地,含有pBAD-MazF的大肠杆菌BW25113于37摄氏度在甘油-M9培养基中生长。当培养物的OD600达到0.6时，加入阿拉伯糖至终浓度为0.2%。37摄氏度孵育10分钟后，细胞用甲苯处理(Halegoua et al., J Bacteriol 126，183-91 (1976))。根据以前的描述(Halegouaet al., Eur J Biochem6 9，163-7 (1976))，使用甲苯处理的细胞，用35S-甲硫氨酸进行蛋白质合成。图2B显示了 MazF对[a-32P]dTTP向甲苯处理的细胞中掺入的影响(Moses和Richardson, Proc Natl Acad Sci USA67, 674-81 (1970))。图 2C 显示了 MazF 对[a-32P]UTP 向甲苯处理的细胞中掺入的影响(Peterson et al., J Bacterioll07, 585-8 (1971))。图2D显示了 MazF对35S-Met体内掺入的影响。根据所标明的、在MazF诱导后的不同时刻，测量35S-Met向含有pBAD-MazF的大肠杆菌BW25113细胞中的掺入。图2E显示MazF诱导后体内蛋白质合成的SDS-PAGE分析。在图2E中使用的培养物与图2D中使用的相同。
[0304]图3A显示了 MazF对多核糖体分布图的影响。通过OD26tl检测核糖体图谱，梯度从左(40%)到右(5%)。70、50和30S核糖体的位置予以标明。图3B阐明了 MazF(His)6对原核无细胞蛋白质合成的影响，使用的是大肠杆菌T7S30提取物系统(Promega)。泳道C，没有MazF(His)6 ；泳道 1-5:分别加入 77、154、231、308 和 384nM 的MazF(His)6 ；泳道6-10:384nMMazF(His)6, (His)6MazE 和 MazF(His)6 的比例分别是 0.1,0.2,0.4,0.8 和 1.2。图 3C 显示MazF(His)6对真核无细胞蛋白质合成的影响，使用的是用于PCR DNA的兔网织红细胞裂解物系统TNTCk:.HQuick (Promega)。泳道 1，没有(His) 6MazE 和 MazF (His) 6 ;泳道2，0.66 μ MMazF (Hi s) 6 ；泳道 3，0.9 μ M (Hi s) 6MazE 和 0.66 μ M MazF (Hi s) 6，(Hi s) 6MazE 和 MazF (Hi s) 6的比例是1.2:1。
[0305]图4A显示MazF存在时的mazG mRNA的趾纹分析。mRNA从含有T7启动子的173-bpDNA片段，使用T7RNA聚合酶体外合成。使用pET-lla_MazG质粒DNA经PCR扩增获得所述DNA片段(T7启动子和从+1至+153的mazG mRNA)。泳道I，没有MazF (His) 6和70S核糖体；泳道2，有2.6 μ M MazF(His)6,没有70S核糖体；泳道3，有0.5 μ M70S核糖体，没有MazF(His)6 ;泳道 4-8，0.5 μ M70S 核糖体以及分别含有 0.35 μ Μ、0.7 μ Μ、1.4 μ Μ、2.ΙμΜ和2.6μ M的MazF(His)6。图4Β显示了酚抽提后的mazG mRNA的趾纹分析。实验方法与图4A的泳道I和泳道2中描述的方法相同，区别在于反应产物使用酚抽提，以便在引物延伸之前去除蛋白质。泳道1，没有MazF(His)6;泳道2，有2.6μ M MazF(His)6。图4C显示了 MazE 对对 mazG mRNA 的 MazF 切割的影响。泳道 I,没有 MazF(His)f^P (His)6MazE ;泳道 2，有 8.8 μ M(His)6MazE ;泳道3，有2.2μΜ MazF(His)6 ;泳道 4-7，有 2.2 μ MMazF (His) 6，(His)6MazE与MazF(His)6的比例分别为0.25,0.4,0.8和1.0。图4D显示MazF在体内对细胞mRNA的影响。在加入阿拉伯糖后的不同时刻(如所标明的)从含有pBAD-MazF的大肠杆菌BW25113细胞中提取总细胞RNA，并进行Northern印迹分析，使用放射性标记的ompA和Ipp ORF DNA作为探针。
[0306]图5表明了春日霉素对多核糖体分布图的影响。根据以上的描述进行实验。通过OD26tl检测核糖体图谱，梯度从左(40%)到右(5%)。70、50和30S核糖体的位置予以标明。
[0307]图6显示核糖体对mazG mRNA的MazF切割的抑制。反应根据以上的描述进行。泳道1，没有MazF(His)6和70S核糖体；泳道2，有2.6 μ M MazF (His) 6，但是没有70S核糖体；泳道3，有0.5 μ M70S核糖体，但是没有MazF (His) 6 ;泳道4，mazG mRNA和70S核糖体在37摄氏度孵育10分钟，然后向该混合物中加入2.2μ M MazF(His)6，并在37摄氏度再孵育10分钟，之后进行引物延伸；泳道5，首先混合70S核糖体和MazF(His)6,并在37摄氏度孵育10分钟，之后加入mazG mRNA，继续在37摄氏度孵育10分钟，之后进行引物延伸；泳道6，mazG mRNA和MazF (His ) 6混合并在37摄氏度孵育10分钟后，向混合物中加入70S核糖体，继续在37摄氏度孵育10分钟，之后进行引物延伸。FL，全长的mazG mRNA;TP(s),由于二级结构暂停的位置；TP (F)，由于MazF切割的趾纹位置；TP (r)，由于核糖体与mazGmRNA的结合造成的趾纹位置。
[0308]图7阐明了 mazG mRNA的Shine-Dalgarno序列发生GGAG到UUUG的突变对MazF功能的影响。反应根据上面的描述进行。泳道1-4,野生型mazG mRNA ;泳道5-8,突变体mazGmRNA,在Shine-Dalgarno序列发生GGAG到UUUG的突变。泳道I和5，没有MazF (His) 6和70S核糖体；泳道2和6，2.6 μ M MazF (His)6,但是没有70S核糖体；泳道3和7，0.5 μ M70S核糖体，没有MazF (His)6 ;泳道4和8，0.5 μ M70S核糖体和2.2 μ M MazF (His) 6。标记的注释在左侧，同图6。
[0309]图8显示mazG mRNA起始密码子的突变对MazF功能的影响。反应根据以上的描述进行。泳道1-4，野生型mazG mRNA ;泳道5-8，突变体mazG mRNA，其起始密码子变为GUG ;泳道9-12，突变体mazG mRNA,其起始密码子变为AGG。泳道1、5和9，没有MazF (His) 6和70S核糖体；泳道2、6和10,2.6μΜ MazF (His)6，但是没有70S核糖体；泳道3、7和11,0.5yM70S核糖体，但是没有MazF (His)6 ;泳道4、8和12:0.5 μ M70S核糖体和2.2 μ M MazF (His) 6。标记的注释在左侧，同图6。
[0310]图9显示UACAU (U1A2C3A4U5)切割序列的突变对MazF功能的影响。反应混合物根据以上的描述进行。泳道I和2使用野生型mazG mRNA作为对照。所有的突变由箭头标明。泳道 I, 3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29 和 31，没有 MazF(His)6;泳道 2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30 和 32，有 2.6μ M 的MazF(His)6。标记的注释在左侧，同图6。
[0311]图10显示MazF和MazE对16S和23S rRNA的切割的影响。反应在以下的体系中进行:10mM Tris-HCl (pH 7.8)，含有 IOmM MgCl2, 60 mM NH4Cl, ImM DTT, 0.5 微升人胎盘 RNA 酶抑制剂(Roche), 5.6 μ M MazF(His)6 和 / 或 17.6 μ M(His)6MazE,总体积是 10 微升。37摄氏度孵育10分钟后，加入2微升上样缓冲液以终止反应。样品在3.5%的丙烯酰胺凝胶上进行分析。泳道1，没有MazF(His)6;泳道2，有5.2 μ M MazF(His)6;泳道3，有17.6 μ M(His)6MazE;泳道 4，有 5.2 μ M MazF(His)6和 17.6 μ M(His)6MazE.23S 和 16S rRNA和tRNA的位直用箭头表不。
[0312]结果
[0313]mazF基因被克隆到可以用阿拉伯糖诱导的pBAD质粒(Guzman et al., JBacteriol 177，4121-30(1995))中。携带 pBAD-MazF 的大肠杆菌 BW25113 在阿拉伯糖(0.2%)存在的条件下在甘油-M9平板上不生长(参见图1A)。当MazF同源物中高度保守的残基Arg29或Arg86被分别替换为Ser或Gly后(图1B)，对阿拉伯糖的敏感性被消除了(图W。结果表明观察到的细胞生长的抑制是由于野生型MazF的生存力成的。在液体培养基中，加入阿拉伯糖5分钟后，细胞的生存力降低了 104。
[0314]为了确定被MazF抑制的细胞功能，使用了由携带pBAD-MazF的大肠杆菌BW25113制备的无细胞系统，细菌经甲苯处理而被通透化(Halegoua et al., J Bacterioll26, I83-91(1976) ; Halegoua et al., Eur J Biochem69, 163-7 (1976)。当在甲苯处理以前，细胞在阿拉伯糖存在的条件下预孵育10分钟时，ATP依赖的35S_甲硫氨酸掺入被完全抑制(图 2A)。但是在类似的条件下，[a-32P] dTTP (Moses 和 Richardson, Proc NatlAcad Sci USA 67，674-81 (1970))(图 2B)和[a-32P]UTP (Peterson et al., J Bacteriol107,585-8(1971))(图2C)的掺入却没有受到影响。这些结果表明MazF抑制了蛋白质合成，但是不抑制DNA复制或者RNA合成。使用没有经过甲苯处理的细胞，加入阿拉伯糖后，35S-甲硫氨酸的体内惨入(Hirashima和Inouye, Nature242, 405-7 (1973)被显著地抑制(图2D)。加入阿拉伯糖后不同时刻对总细胞蛋白合成所进行的SDS-PAGE分析(图2E)显示，MazF是蛋白质合成的一个一般性的抑制剂，它基本上影响所有的细胞蛋白质。有趣的是，较大的蛋白比较小的蛋白更易受到MazF的毒害。
[0315]阿拉伯糖诱导10分钟后，使用蔗糖密度梯度对携带PBAD-MazF的大肠杆菌BW25113细胞进行多核糖体图谱的分析。如图3A所示，在这种细胞中，多核糖体完全消失了，同时70S核糖体级分升高，30S或50S核糖体级分没有显著改变。当使用春日霉素处理细胞时，多核糖体图谱出现了类似的改变(图5)，春日霉素是抑制翻译起始的抗生素。这些发现提示MazF通过抑制翻译起始或者通过降解mRNA而导致核糖体从mRNA上释放。
[0316]还在大肠杆菌无细胞RNA/蛋白质合成系统中检查了纯化的MazF(His)6对候选蛋白质MazG合成的影响。从共同表达MazE和MazF (His) 6的细胞中纯化出MazF (His)60使用大肠杆菌T7S30 提取物系统(Promega)从质粒pET-1 Ia-MazG合成MazG (30kD) (Hirashima andInouye, Nature242, 405-7 (1973))，合成在37摄氏度下进行I小时，并在没有MazF (His)6存在或者有浓度逐步升高的MazF(His)6存在的情况下(图3B)。MazF (His) 6浓度在231nM以上时，MazG的合成被完全抑制。同时研究了 MazE抗毒素对这个观察到的由MazF介导的对MazG合成的抑制的作用。有趣的是，同时加入抗毒素(His)6MazE,以剂量依赖的方式挽救了MazG的合成(图3B)。MazF(His)6还能够抑制真核无细胞蛋白质合成系统(图3C，泳道2)，蛋白质的合成在同时加入(His)6MazE时也得到恢复(泳道3)。
[0317] 由于MazF抑制了 MazG的合成(图3B)，对抑制发生的时间进行了分析。为了确定抑制是否影响了翻译起始步骤，采用了趾纹(TP)技术，其使用70S核糖体和MazG mRNA (Mo 11和 Blasi, Biochem Biophys Res Commun297, 1021-1026 (2002))。只对 mazG mRNA 进行趾纹分析产生了全长的条带(FL)和可能是由于mazG mRNA的5’末端的二级结构而形成的条带TP(S)(图4A，泳道I)。在70S核糖体存在下，检测到了起始密码子下游的趾纹条带[TP(r)](泳道3)。当MazF(His)6与70S核糖体一同加入时，出现了一个新的条带TP(F)，它对应的是Shine-Dalgarno (SD)序列和起始密码子之间的区域(泳道4_8)。随着MazF (His)6浓度的升高，TP (r)条带的强度逐渐降低，在MazF(His)6浓度为3.75 μ M时，TP (r)条带几乎完全消失了(泳道7)。
[0318]令人惊奇的是，甚至在没有70S核糖体时也检测到了 TP(F)条带(泳道2)，这表明MazF能够不依赖于70S核糖体与mRNA结合，或者MazF是在A和C残基之间切割的核糖核酸内切酶(图4A)。
[0319]为了区别这些可能性，mazG mRNA与经过酹抽提除去蛋白质的MazF(His)6共同孵育，用于图4B所示的引物延伸。即使在酚抽提以后还能够观察到TP(F)条带(泳道2)，表明MazF(His)6的确切割mazGmRNA。当MazE共同加入时,mazG mRNA的切割被再次阻断(图4C,泳道4-7)。注意(His)6MazE单独地对于mRNA没有可检测到的作用(泳道2)。该结果表明MazE的抗毒性作用是由于对MazF核糖核酸内切酶活性的抑制。在MazF (His) 6之前加入70S核糖体，抑制了 MazF (His) 6对mRNA的切割，很可能是由于mazG mRNA中SD序列和ACA序列位置接近(图6)。相反，RelE的毒性作用需要核糖体(Pedersen et al.，见前，(2003))。
[0320]表1显示了在检查的不同mRNA转录物中的MazF切割序列。保守的切割序列加上了下划线。
【权利要求】
1.在细胞中制备多肽的方法，所述方法包括:(a)用编码所述多肽的核酸序列转染所述的细胞，其中编码所述多肽的核酸序列被突变，以使用另外的三联体密码子替换mRNA干扰酶识别序列，其中由所述的突变核酸序列编码的所述多肽的氨基酸序列没有因为所述的突变而改变；(b)用编码mRNA干扰酶多肽的核酸序列转染所述的细胞，其中所述的mRNA干扰酶多肽识别所述的mRNA干扰酶多肽识别序列并且以不依赖于核糖体的方式特异切割mRNA ;以及(c)在所述的细胞中表达步骤(a)和(b)的核酸序列，其中在所述的细胞中表达步骤(a)和(b)的核酸序列提供了在所述细胞中制备所述多肽的手段。
2.权利要求1的方法，其中所述mRNA识别序列是腺嘌呤-胞嘧啶-腺嘌呤(ACA)序列，所述mRNA干扰酶多肽是SEQ ID NO:2所示的MazF ;或者其中的mRNA识别序列是尿嘧啶-腺嘌呤-X (UAX)序列，其中X是胞嘧啶(C)、A或者U，所述mRNA干扰酶多肽是SEQ IDNO:4所示的PemK。
3.权利要求1的方法，其中步骤(a)和(b)同时进行。
4.权利要求1的方法，还包括将所述的细胞在(c)步骤之前或者在(c)步骤中，在包含至少一种放射性标记同位素的培养基中孵育。
5.制备多肽的方法，所述的方法包括:(a)提供编码所述多肽的核酸序列，其中编码所述多肽的核酸序列被突变，以用另外的三联体密码子替代mRNA干扰酶识别序列，其中由所述突变核酸序列编码的所述多肽的氨基酸序列没有由于所述的突变而被改变；(b)提供编码mRNA干扰酶多肽的核酸序列，其中所述的mRNA干扰酶多肽识别所述的mRNA干扰酶识别序列并且以不依赖于核糖体的方式特异切割mRNA;以及(c)表达步骤(a)和(b)的核酸序列，其中步骤(a)和(b)的核酸序列的表达提供了生产所述多肽的手段。
6.权利要求5的方法，其中所述mRNA识别序列是ACA序列，所述mRNA干扰酶多肽是SEQ ID NO:2所示的MazF;或者其中所述mRNA识别序列是UAX序列，其中X是C、A或者U, mRNA干扰酶多肽是SEQID NO:4所示的PemK。
7.包含至少一个编码mRNA干扰酶多肽的核酸序列的组合物用于制造用于治疗具有疾病的患者以减轻所述疾病之症状的药物的用途，其中所述多肽具有以不依赖于核糖体的方式特异切割mRNA的序列特异性核糖核酸内切酶活性。
8.权利要求7的用途，其中所述mRNA干扰酶多肽是SEQID NO:2所示的MazF或者SEQID NO:4 所示的 PemK0
9.权利要求7的用途，其中所述的疾病是细菌感染，向所述的患者施用治疗有效量的所述组合物通过降低在所述患者体内细菌的数目而缓解细菌感染的症状。
10.权利要求9的用途，其中所述的细菌感染包含至少一种抗生素抗性细菌菌株。
11.权利要求7的用途，其中所述的疾病是过度增生性疾病，向所述的患者施用治疗有效量的所述组合物通过降低所述患者体内过度增生性疾病细胞的数目而缓解所述过度增生性疾病的症状。
12.包含mRNA干扰酶多肽的组合物用于制造用于治疗具有疾病的患者以缓解所述疾病之症状的药物的用途，其中所述多肽具有以不依赖于核糖体的方式特异切割mRNA的序列特异性核糖核酸内切酶活性。
13.权利要求12的用途，其中所述mRNA干扰酶多肽是SEQID NO:2所示的MazF或者SEQ ID NO:4 所示的 PemK0
14.权利要求12的用途，其中所述的疾病是细菌感染，向所述的患者施用所述的组合物通过降低所述患者体内细菌的数目而缓解细菌感染的症状。
15.权利要求14的用途，其中所述的细菌感染包含至少一种抗生素抗性细菌菌株。
16.权利要求12的用途，其中所述的疾病是过度增生性疾病，向所述的患者施用所述的组合物通过降低所述患者体内过度增生性疾病细胞的数目而缓解所述过度增生性疾病的症状。
17.权利要求11或者16的用途，其中所述的增生性疾病选自以下疾病组成的组:不同组织的发育异常和组织变形、炎性病症、自体免疫疾病、过度增生性皮肤疾病、牛皮癣、过敏/哮喘、动脉粥样硬化以及血管成形手术后的再狭窄。
18.制备多个多核糖核苷酸序列的方法，所述的方法包括:(a)提供第一和第二核酸序列，其中所述的第一核酸序列的一个区域与所述的第二核酸序列的一个区域互补，且所述的第一和第二核酸序列的两个互补区域都不包含与mRNA干扰酶识别位点互补的序列，且所述的第一和第二核酸序列在它们的5’末端都被磷酸化；(b)通过所述的第一和第二核酸序列的互补区域使所述的第一和第二核酸序列退火，形成双链的核酸序列，其包含侧翼为单链突出端的互补区域，其中每一个所述单链突出端包含至少一个与mRNA干扰酶识别位点互补的序列，且所述的单链突出端互相互补；(c)通过互补的单链突出端连接已经退火的第一和第二核酸序列，形成包含多个退火的第一和第二核酸序列串联重复序列的多联体；(d)使用包含T7启动子以及与所述的第一核酸序列互补的区域的第一引物和与所述的第二核酸序列互补的第二引物扩增所述的多联体，其中所述的扩增产生多个包含T7启动子的多联体；(e)使用T7RNA聚合酶从所述的多个多联体转录出RNA分子，其中每一个所述的RNA分子包含多个侧翼为mRNA干扰酶识别位点的多核糖核苷酸序列的串联重复序列；以及(f)使用能够在所述的干扰酶识别位点处以不依赖于核糖体的方式特异切割RNA的mRNA干扰酶多肽消化所述的RNA分子，其中所述的消化产生多个所述多核糖核苷酸序列。
19.权利要求18的方法，其中所述mRNA识别序列是ACA序列，所述mRNA干扰酶是SEQID NO:2所示的MazF ;或者其中的mRNA识别序列是UAX序列，其中X是C、A或者U, mRNA干扰酶多肽是SEQ IDNO:4所示的PemK。
【文档编号】A61P41/00GK103937827SQ201410045230
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2004年6月14日 优先权日:2003年6月13日
【发明者】M·伊诺耶, J·张, Y·L·张 申请人:新泽西内科与牙科大学