专利名称：日本血吸虫β-catenin基因、蛋白及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种日本血吸虫i3-Catenin(i3-连环 蛋白)基因、蛋白及用途。
背景技术：
血吸虫病是一种严重危害人类健康的慢性消耗性寄生虫病，目前该病在全球74 个国家和地区流行，主要集中在热带、亚热带欠发达国家和地区，感染人数超过2亿。2007 年我国仍有约60万人口感染该病，其中80%以上集中在安徽、江西、湖北和湖南等省的沼 泽和湖泊地区。目前中国血吸虫病的防治仍以吡喹酮等化学药物为主，该药物虽然能够有 效杀伤体内血吸虫成虫，但不能控制重复感染，且长期使用可能诱发虫体的耐药性，因此新 的治疗药物亟待开发。然而，要使新药研究取得突破性进展，充分了解血吸虫的生长发育过 程及其相关的调控机制是重要基础。日本血吸虫生活史复杂，在整个生活循环过程中表现出明显的形态学及生理生化 方面的改变，但是，以往研究者对血吸虫的研究主要集中于表观生物学及组织化学层面，对 于虫体复杂的生长发育调控机理缺乏认识，因而在新药开发方面没有新的突破。生物体的 生长发育由细胞间的信号网路系统调控，日本血吸虫也不例外。真核生物的生长发育、生殖生理等生命进程由进化保守的Hedgehog、BMP、Wnt等 信号网络系统进行调节。其中Wnt信号通路是调控细胞增殖和分化的重要途径，在胚胎发 育、细胞命运及组织器官形态发生等生物学过程均发挥重要调控作用。模式生物上的研究 发现，Wnt信号通路存在经典和非经典的细胞信号传递途径。经典通路指Wnt/ β -catenin 信号通路；非经典通路包括平面细胞极性通路(planar cell polarity pathway,PCP)及 Wnt/Ca2+信号通路。i3-catenin(i3-连环蛋白)是经典Wnt信号途径的关键信号分子，在 Wnt信号未被激活时，胞浆内的β -catenin大部分与细胞膜上的钙黏蛋白结合，少部分与 轴蛋白、腺瘤性结肠息肉病基因蛋白、酪蛋白激酶、糖原合酶激酶形成巨大复合体，最终导 致β-catenin通过蛋白酶体被降解，因而胞浆内游离β-catenin水平极低。当Wnt信号 激活后，β-catenin复合体不被降解，大量游离的β-catenin在胞质中聚集，这种累积打 破了细胞内原有的β-catenin出核和入核平衡，使得细胞核内的β-catenin大大增加，促 进Wnt/ β -catenin信号通路靶基因的转录激活。利用生物信息学方法，预测到血吸虫体内也存在Wnt信号通路。并参考其它模 式生物数据，利用血吸虫转录本组及蛋白质组数据重构了血吸虫Wnt信号通路(http:// lifecenter. sgst. cn/schistosoma/en/pathwayImage, do ？ map = map04310&name = Wnt% 20signaling% 20pathway)。目前该通路对血吸虫生长发育的调控机制在国内外尚 未有详细报道。本实验室率先开展了血吸虫Wnt信号通路的相关研究，已鉴定了两个Wnt 配体SjWnt4 (GenBank 登陆号 DQ643829)和 s jWntlO (GenBank 登陆号 DQ643830)；三个 Frizzled 家族七次跨膜受体sjFz5 (GenBank 登陆号 EU370926)，sjFz7 (GenBank 登陆号 EU370927)和sjFz9 (GenBank登陆号GQ500895)。通路中更多成员的鉴定及生物学特性的分析，有助于全面认识Wnt信号通路对血吸虫生长发育调控的分子机制，从而发现重要的 功能分子用于发展候选疫苗或药靶。目前国内外尚没有日本血吸虫β-catenin基因的研究报道。
发明内容
本发明要解决由于对日本血吸虫的生长发育调控机制缺乏认识而导致在新药 研发方面难以取得突破的技术问题，提供一种日本血吸虫β _ c a t e η i η基因和蛋白，该 β-catenin基因参与调控血吸虫的器官分化、虫卵的形成及卵胚发育等过程，对开发控制 血吸虫生长发育的新药具有较高的应用价值。此外，还需要提供一种日本血吸虫β-catenin基因和蛋白质的用途。为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现在本发明的一个方面，提供了一种日本血吸虫基因，所述基因具有编码 β -catenin蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列包含下述DNA序列之一(1)编码SEQ ID NO. 1氨基酸序列的DNA序列；(2)编码SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列中缺失、添加、插入或取代一个或多个氨基 酸所得到的具有SEQ ID NO. 1相同活性的氨基酸序列的DNA序列。优选的，所述基因具有SEQ ID NO. 2所示的DNA序列。在本发明的另一方面，提供了一种日本血吸虫蛋白质，所述蛋白质选自(1)具有SEQ ID NO. 1氨基酸序列的蛋白质；(2)具有SEQ ID NO. 1中部分氨基酸序列的活性片段或保守性变异蛋白质；(3) SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列中缺失、添加、插入或取代一个或多个氨基酸所 得到的具有SEQ ID NO. 1相同活性的氨基酸序列的蛋白质。优选的，所述蛋白质具有SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列。在本发明中，由于体内或纯化期间蛋白质本身的修饰等或由于编码蛋白基因的多 态性及变异，天然存在的蛋白质会出现氨基酸的缺失、添加、插入、取代或其他变异。事实 上，存在着一些生理和生物活性上基本等同于无变异蛋白质的蛋白。这些结构不同于相应 的蛋白质但与该蛋白质没有明显的功能差异的多肽或蛋白称为功能等同变异体。功能等同变异体同样适用于通过人工手段向一种蛋白质的氨基酸序列中导入这 类变异而制成的多肽。例如，人白介素2(IL_2)的氨基酸序列中用丝氨酸替换特定的半胱氨酸残基所得 到的多肽仍保留着IL-2的活性[Science，224，1431 (1984)]。此外，在用基因工程方法生产蛋白质时，常把所需蛋白质表达为融合蛋白质，例 如，把源于其他蛋白质的N-末端肽链加到所需蛋白质的N-末端以提高所需蛋白质的表达， 或者把一个合适的肽链加到所需蛋白的N-或C-末端，表达该蛋白并使用一种对所加肽链 具有亲和力的载体使所需蛋白的纯化变得更加容易。就决定基因上特定氨基酸的密码子(三联体碱基组合)而言，每种氨基酸存在1 到6个密码子。因此尽管依赖于氨基酸序列，但仍有许多编码一种氨基酸的基因。在自然 界中，基因并不稳定，常发生核酸变异。基因的变异可能不影响所编码的氨基酸序列(沉默 变异)，这种情况下，会产生编码相同氨基酸序列的不同基因。因此，即使分离出了编码特定氨基酸序列的基因，随着含有该基因生物体的传代，仍不可避免地会产生编码相同氨基酸 序列的不同基因。用各种基因工程技术人工产生编码相同氨基酸序列的各种基因并不困难。例如， 当编码所需蛋白质的天然基因的密码子在用于以基因工程技术产生蛋白质的宿主中可利 用性较低、表达的蛋白量不够时，可以人工将密码子转变成在该宿主中可利用性高的另一 密码子而不改变所编码的氨基酸序列，即可增强所需蛋白质的表达。因此，这类人工生产的 不同多核苷酸也包括在本发明的范围内，只要它能编码出本发明公开的氨基酸序列即可。另外，由至少一种改变(如蛋白质的氨基酸序列中有一个或多个氨基酸残基的缺 失、添加、插入或取代)所得的多肽或蛋白一股具有功能上等同于所述蛋白质的活性，编码 这类多肽或蛋白的基因也包括在本发明的范围内，不管它是从天然来源分离还是人工生产 的。一股的，编码功能等同变异体的基因是同源的。因此，能与本发明的基因杂交且编 码具有β-catenin活性的蛋白质的核酸分子也包括在本发明的范围内。在本发明的另一方面，还提供了一种包含上述日本血吸虫基因DNA序列的全部或 部分序列的重组载体。所述重组载体包括重组克隆载体或重组表达载体，重组表达载体包括重组原核表 达载体、重组真核表达载体。优选的，所述重组载体包含编码SEQ ID NO. 1中8_310位氨基酸序列的DNA序列。在本发明的另一方面，还提供了一种宿主细胞，包含上述重组载体，或已用上述基 因序列转化或转染。在本发明的另一方面，还提供了一种上述日本血吸虫基因的用途，用于制备预防 或治疗血吸虫病的药物；或用于筛选预防或治疗血吸虫病的药物。在本发明的另一方面，还提供了一种上述日本血吸虫蛋白质的用途，用于制备预 防或治疗血吸虫病的药物；或用于筛选预防或治疗血吸虫病的药物。所述药物通过阻断血吸虫生长发育来发挥作用。本发明日本血吸虫β -catenin基因、蛋白可用于发展为高效候选疫苗或药靶。本发明日本血吸虫β-catenin基因，由实时荧光定量PCR分析结果表明，其在日 本血吸虫各个发育阶段均有表达，在虫卵中表达量最高，23d雌虫次之，13d虫体和23d雄虫 的表达量约是23d雌虫的一半，其它阶段的表达量相对较低；Western blotting分析结果 显示β-catenin在日本血吸虫不同发育阶段蛋白水平的变化和mRNA变化基本一致。结合 日本血吸虫发育特征，推测Wnt/β-catenin信号通路可能对虫体的器官分化，虫卵的形成 及卵胚发育等过程起重要的调控作用，本发明的日本血吸虫β -catenin基因，为开发阻断 虫体发育的新药提供了新思路。
下面结合附图和
具体实施方式
对本发明作进一步详细的说明。图1是本发明实施例1日本血吸虫β -catenin基因保守的ARM结构特征图；图2是本发明实施例2实时定量PCR分析β-catenin在日本血吸虫不同发育阶 段表达量的变化图3是本发明实施例3重组质粒pET28a_ β -catenin-310的BamH I/Xho I双酶 切产物鉴定图；图4是本发明实施例3的SDS-PAGE分析pET28a_ β -catenin-310重组质粒的包 涵体表达及纯化图；图5是本发明实施例4天然虫体蛋白和抗β -catenin抗血清的Western Blotting分析图；图6是本发明实施例5的SDS-PAGE分析pET28a载体及pET28a_ α -tubulin重组 质粒的诱导表达图；图7是本发明实施例5天然虫体蛋白和抗α -tubulin抗血清的Western Blotting分析图；图8是本发明实施例6的Western Blotting分析日本血吸虫不同发育阶段 β -catenin蛋白水平表达量的变化图。
具体实施例方式下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《分子克隆实验 指南》(J.萨姆布鲁克，D. W.拉塞尔著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础，等译.第3版，北京科学 出版社，2002)中所述的方法进行。本发明以7d童虫cDNA为模板，通过RACE技术获得日本血吸虫β -catenin全 长cDNA序列，再利用生物信息学软件分析该基因及其编码蛋白的结构。结果表明，该 β -catenin的cDNA序列全长2354bp，含完整的开放阅读框2016bp，编码671个氨基酸。利 用荧光实时定量PCR方法分析了 β -catenin基因在日本血吸虫不同发育阶段mRNA水平的 变化。以含有多个抗原表位的β-catenin部分cDNA序列为模板，构建原核表达载体，表达 β -catenin重组蛋白。以纯化的原核表达产物为抗原，免疫BALB/c小鼠制备抗血清，以此 抗血清为一抗，通过Western blotting分析β-catenin在日本血吸虫不同发育阶段蛋白 水平的变化。实验结果显示β-catenin基因的mRNA水平在虫卵中最高，23d雌虫次之，在 13d童虫和23d雄虫中也较高，约是23d雌虫的一半，在其它发育阶段虫体水平相对较低，结 合日本血吸虫发育特征，推测Wnt/ β -catenin信号通路可能对虫体的器官分化，虫卵的形 成及卵胚发育等过程起重要的调控作用，表明该β-catenin基因编码蛋白对开发控制血 吸虫生长发育的新药具有较高的应用价值。实施例1日本血吸虫β -catenin全长cDNA序列的获得及生物信息学分析1.不同发育阶段的日本血吸虫收集日本血吸虫中国大陆株尾蚴由中国农业科学院上海兽医研究所钉螺室提供，新西 兰大白兔腹部贴片，按照所需不同阶段虫体分别感染2000 15000条尾蚴，分别在感染后 7(1、13(1、18(1、23(1、32(1、42(1用肝门静脉灌注法收集虫体，并将23(1、32(1及42(1虫体雌雄分开， 取感染42d兔的肝脏，剪碎勻浆后分别过80目、120目、160目、200目及300目筛网纯化虫 卵，将收集的不同发育阶段虫体做好标记后液氮保存备用。2.日本血吸虫β -catenin全长cDNA序列的扩增及生物信息学分析取液氮中冻存的7d童虫，按Trizol试剂盒说明书进行总RNA抽提。分别用琼 脂糖凝胶和分光光度计检测RNA的完整性和浓度。以NCBI获得的与其它物种β-catenin
6有部分同源性的日本血吸虫EST序列(GenBank登陆号AA618990)为模板设计RACE引物， 由上海英俊生物工程有限公司合成。3’ -RACE正义引物/正义巢式引物(5’ -3’ )分别为 CAACTTCACGTTCTGGATCTCAAGC (SEQ ID NO. 3)，TGCTGCGTATACTGCTGCTATCCTG(SEQ ID NO. 4)； 5，-RACE 反义引物 / 反义巢式引物(5，-3，)分别为TCAGGACGTGTTATTTCATCAGTGG(SEQ ID NO. 5)，GACCAACAACAGATTTCAGTAATGG(SEQ ID NO. 6)。参照RACE试剂盒说明书，将7d童虫RNA分别转录为3，-RACE cDNA和5，-RACE cDNAo 首轮 touch-down PCR 扩增条件如下-MV 5min 预变性；94°C 30s, 70°C 3min 设定 5 个循环；94°C 30s, 70°C 30s, 72°C 3min 设定 5 个循环；94°C 30s, 68°C 30s, 72°C 3min 设定 25 个循环；最后72°C延伸lOmin。第二轮是特异巢式PCR，将首轮touch-down PCR产物经灭菌 去离子水稀释50倍后取5 μ L作模板，扩增条件为94°C 5min，94°C 30s, 68°C 30s, 72°C 3min， 共25个循环。经两轮PCR，3，-RACE,5' -RACE分别得到长346bp、1568bp的产物。将扩增后的 PCR产物与T载体连接，转化DH5 α感受态细胞，挑选阳性克隆到上海英骏生物技术公司 进行测序鉴定。用Gene tool软件将3’ -RACE序列、5’ -RACE和已知的作为RACE模板的 β -catenin EST序列拼接，得到完整的β-catenin全长cDNA序列。将获得的cDNA序列通过NCBI进行同源性比对和ORF分析，推测其编码框和蛋白 结构域(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)；通过 ExPASy 分析 β-catenin 等电点、稳定性 等生化特性(http://cn.expasy.org/tools/protparam.html)；通过 Signal P 分析信号肽 的存在与否(http://www. cbs. dtu. dk/services/SignalP/)。上述序列分析表明该β -catenin基因全长2354bp (见SEQ ID N0. 2)，完整编码框 为2016bp，共编码671个氨基酸(SEQ ID NO. 1)，理论相对分子量为75. 69kD，理论等电点为 6. 15，无信号肽序列。同源性分析表明，该β -catenin基因编码的氨基酸序列与曼氏血吸虫 β -catenin的相似性为85%，与日本三角涡虫、非洲爪蟾、黑腹果蝇、人等其它物种 β -catenin的相似性均在30 % 35 %之间。对该蛋白序列进行高级结构预测，其氨基 端含有系列的丝氨酸/苏氨酸残基，能够被磷酸化，调节蛋白的稳定性。中间区域有6个 β-catenin家族典型的ARM重复(ARM为armadillo的简称，为β-catenin在果蝇属的同源 性基因)，构成2个ARM超家族，其中每个ARM重复能形成三个α -螺旋，该蛋白通过α -螺 旋间相互作用形成精密的右手超螺旋高级结构(图1)，能够有效防止蛋白水解作用。至此 确定该基因为日本血吸虫β-catenin。实施例2 β -catenin在日本血吸虫不同发育阶段mRNA表达量分析1.实验方法按照实时定量PCR的引物设计原则，设计β-catenin引物，上游引物(5，_3，) AAGGCATCCATCAGAAGT(SEQ ID N0. 7)；下游引物(5，-3，) :ACTGCTTTCATAGACTGCCATAC(SEQ ID NO. 8)，扩增片段长度为207bp。选择18S rRNA (GenBank登陆号AY157226. 1)作内参， 上游引物(5，-3，):TTAGTTGGTGGAGCGATTTGTCTGG (SEQ ID NO. 9)；下游引物(5，_3，) CTGTTATTGCTCAATTTCGTGCGAC(SEQ ID N0. 10)，扩增片段 214bp。引物序列由公司合成。用Trizol 法分别抽提虫卵、7(1、13(1、18(1、23(1、32(1及42(1 虫体 RNA，DNase I 消化 RNA中残留DNA，1 %的琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，紫外分光光度法测定RNA浓度。参照 PrimeScript RT reagent Kit 说明，将 RNA 反转录成 cDNA，以 SYBR Green I 为荧光染 料，反应体系为2 X SYBR Green PCR Premix Ex Taq 12.5yL，上游引物(ΙΟμΜ)Ο. 5μ L, 下游引物(10 μ Μ) 0. 5 μ L，无菌去离子水9 μ L，cDNA模板2. 5yL;反应条件为95°C 10s， 然后95°C 15s, 60°C 15s，72°C 15s，共40个循环，其中每个循环的72°C 15s结束时间为荧 光信号检测点，每个样品均做三个重复。以7d童虫cDNA作10倍系列稀释后为模板，构建 β -catenin和18S rRNA内参的标准曲线。保证每个标准曲线的相关系数R2 > 0. 99。实 验结果以2_ΔΔα法进行分析，得到不同期别每百万18S rRNA看家基因中β-catenin的含 量。2.结果以10倍系列稀释的7d童虫cDNA为模板，首先构建了 β -catenin和18S rRNA扩 增标准曲线，分别为 β -cetenin =Conc = 10" (-0. 350*CT+7. 990)，阈值(Threshold)O. 069 ； 18S rRNA =Conc = 10" (-0. 336*CT+7. 875)，阈值(Threshold)O. 0908。这两条标准曲线都 有良好的扩增效率和相关系数。实时定量PCR分析结果表明(图2)，β-catenin在虫卵中表达量最高，23d雌虫 次之，13d虫体和23d雄虫的表达量也较高，约是23d雌虫的一半，其它阶段的表达量相对较 低。在虫体发育过程中，β-catenin mRNA水平从7d到13d逐渐上升，13d后又迅速下降， 到18d降到最低水平(图2A)。合抱后的雌雄虫β -catenin mRNA水平逐渐升高，到23d达 到高峰，随后又下降，到32d达到最低水平，而42d雌雄虫表达量又略有升高(图2B)。实施例3重组质粒pET28a_ β -catenin-310的构建及重组蛋白的表达和纯化1.重组质粒的构建用^piPred 1. Ob Server软件在线预测了 β-catenin抗原表位，氨基酸8 310 区段具有8个抗原指数较高表位，有较好的抗原性。因此选取该段氨基酸作为免疫组化定 位的目标抗原，设计引物对如下上游引物(5 ’ -3 ’)GTGGATCCATGAAAAAATACTCACATGTAG (S EQ ID NO. 11)；下游引物(5，-3，) GTCTCGAGATCACTAAGATTACGTAATCCC (SEQ ID NO. 12)，上 下游引物中分别引入BamH I和Xho I限制性内切酶位点(引物序列中划线处标出)。以反转录的7d童虫cDNA为模板进行PCR扩增。将纯化的目的片段(957bp) 和pET28a质粒分别进行BamH I和Xho I双酶切并连接，将连接产物转化DH5 α感 受态细胞，挑选克隆抽提质粒，经双酶切、测序鉴定后获得重组阳性质粒，命名为 pET28a-β-catenin-310。重组质粒 pET28a_ β-catenin-310 经 BamH I/Xho I 双酶切鉴定 结果如图3所示。在图3中，M :DL2000DNA分子量标准；1 重组质粒pET28a_ β -catenin-310 的BamH I/Xho I双酶切产物。2.重组质粒在原核细胞中的表达及纯化将重组质粒转ABL21(DE3)表达型感受态细胞，挑取单克隆于LB培养基，37°C过夜 培养。次日以1 100接种新鲜LB培养基，待菌液OD6tltl为0.8时加入不同终浓度IPTG进 行诱导。在诱导的不同时间分别收集菌液，确定IPTG最佳诱导时间。SDS-PAGE电泳分析经 超声裂解后的菌体蛋白，判定其是以可溶性或包涵体形式表达。用His Bind Resin纯化重 组蛋白，若为包涵体表达再用尿素浓度梯度降低的PBS进行透析，复性。结果用不同浓度IPTG诱导不同时间均获得了分子量约为36kDa的重组蛋白，与 预测分子量一致，其中终浓度0. SmM的IPTG诱导4h获得最大表达量。蛋白表达分析表明重组蛋白以包涵体形式存在(图4A)。将包涵体溶于8M尿素，用His bind Resin纯化，将 纯化后的蛋白用尿素浓度梯度降低的PBS透析至PBS中复性，得到纯化目的蛋白(图4B)。实施例4ρΕΤ28ει-β -catenin-310蛋白抗血清的制备及特异性分析1.抗血清的制备取8 12周龄BALB/c雌性小鼠10只，其中2只用于佐剂对照。将纯化后的重组 蛋白调整为lmg/mL，首次免疫时将蛋白与等体积弗氏完全佐剂混勻，背部皮下分点注射实 验组8只小鼠，注射剂量为200uL/只(IOOug蛋白)，同时取等体积无菌PBS与弗氏完全佐 剂混勻后，同等剂量、同样途径注射入佐剂对照组小鼠。首次免疫后2周、4周分别进行第 二次免疫和第三次免疫，免疫剂量及途径同于首免，所用佐剂为弗氏不完全佐剂。3免后5d 小鼠尾静脉采血，用间接ELISA法检测血清中特异性IgG抗体水平，结果显示8只实验组小 鼠效价均在1 51 200以上，2只佐剂对照组小鼠血清系列稀释后OD45tl均小于0.2。对效 价高的实验组小鼠眼眶静脉丛采血，收集血清，置于_70°C冰箱冻存备用。2.抗血清的特异性分析本实验制备的抗血清为原核表达的重组蛋白免疫产生，因此用Western blotting 分析抗血清和虫体天然β-catenin能否特异性结合。收集13d虫体，用PARIS kit蛋白抽 提试剂盒抽提虫体蛋白，用BCA法测定蛋白浓度，20yg虫体蛋白/孔进行SDS-PAGE电泳。 电泳结束后按常规方法将蛋白转移到NC膜上，以1 500稀释的ρΕΤ28ει-β -catenin-310 蛋白免疫多抗作一抗，1 2000稀释IRDye 800标记的羊抗小鼠IgG作二抗进行Western blotting，同时设置正常小鼠血清作阴性对照，通过Odyssey红外荧光扫描成像系统分析 显色结果。结果Western blotting结果表明pET28a_ β -catenin-310多克隆抗体能与天 然虫体蛋白中的单一条带相结合，被结合蛋白呈现明显绿色荧光，分子量在70kDa左右，与 β -catenin预测的蛋白分子量一致(图5A)。阴性血清对照组无特异条带出现(图5B)， 表明以原核表达的β-catenin为免疫原得到的抗血清能特异性识别虫体天然蛋白中的 β -catenin，可用于分析不同发育阶段虫体β -catenin蛋白水平的表达变化。实施例5日本血吸虫α -tubulin抗血清的制备及特异性分析1. pET28a- α -tubulin重组质粒的构建及在原核细胞的表达本研究以α-tubulin为内参，分析β-catenin在日本血吸虫不同发育阶段的蛋 白水平的表达，为此也构建了 α-tubulin的原核表达载体，并进行了表达、纯化和多克隆 抗体制备。以NCBI获得的日本血吸虫α-tubulin (GenBank登陆号AY815746)完整核苷酸 序列 ORF 为模板设计 PCR 引物对，上游引物(5，-3，) GTGGATCCATGCGTGAATGTATTAGTGTAC ( SEQ ID NO. 13)；下游引物(5，-3，) GTCTCGAGGTACTCTTCTCCTTCCCCTTCA(SEQ ID N0. 14)， 上下游引物中分别引入BamH I和Xho I限制性内切酶位点(引物序列中划线处标出)。引 物序列由公司合成。以反转录的7d童虫cDNA为模板进行PCR扩增。将纯化的目的片段(1365bp)和 pET28a质粒分别进行BamH I和Xho I双酶切并连接，构建pET28a_ α -tubulin重组质粒。 将重组质粒转入BL21(DE3)表达型感受态细胞，用ImM IPTG诱导表达，His Bind Resin纯
化重组蛋白。结果pET28a-a-tubulin重组质粒转入 BL21(DE3)，用 ImM IPTG 诱导 4h 获得了分子量约为55kDa的重组蛋白，与预测分子量一致(图6)。在图6中，1 未诱导表达的 pET28a ；2 用 ImM IPTG诱导表达 4h 的 pET28a ；3 未诱导表达的 pET28a_ α-tubulin ；4 用 ImM IPTG 诱导表达 4h 的 pET28a_ α -tubulin。2. pET28a- α -tubulin抗血清的制备及特异性分析纯化后的重组蛋白免疫小鼠，制备抗α -tubulin免疫血清，用Western blotting 分析该抗血清的特异性。日本血吸虫α-tubulin抗血清的制备及特异性分析过程同 β -catenin。结果pET28a-α-tubulin多克隆抗体能与天然虫体蛋白中的单一条带相结合， 被结合蛋白呈现明显绿色荧光，分子量在55kDa左右，与α -tubulin预测的蛋白分子量一 致(图7A)。阴性血清对照组无条带产生(图7B)，表明以原核表达的α -tubulin为免疫 原得到的抗血清能特异性识别虫体α "tubulin蛋白，可作为内参蛋白抗血清，用于分析不 同发育阶段虫体β-catenin蛋白水平的的表达变化。实施例6 β -catenin在日本血吸虫不同发育阶段蛋白表达分析用PARIS kit蛋白抽提试剂盒分别抽提虫卵、7(1、13(1、18(1、23(1、32(1、42(1虫体蛋 白，用BCA法测定蛋白浓度，50 μ g虫体蛋白/孔进行SDS-PAGE电泳。电泳结束后按常规方 法将蛋白转移到NC膜上，分别以1 500稀释的抗β-catenin免疫血清、抗α-tubulin 免疫血清作一抗，1 2000稀释IRDyeTM800标记的羊抗小鼠IgG作二抗进行Western blotting，通过Odyssey红外荧光扫描成像系统分析显色结果。结果日本血吸虫不同发育阶段β-catenin蛋白水平的表达变化见图8。在 α-tubulin内参蛋白基本一致条件下，虫卵中β-catenin蛋白水平最高，23d雌/雄虫表 达量次之，13d虫体表达量也较高。18d及32d雌雄虫表达量较低，但42d雌雄虫表达量均 略有升高。该变化趋势与日本血吸虫不同发育阶段β -catenin的mRNA水平表达量的变化
基本一致。以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能 因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说， 在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范 围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。序列表
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<400>1
Met Lys Lys Tyr Ser His Val Val Asp Ser Gln Asn Ser Lys Glu Phe
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权利要求
一种日本血吸虫基因，其特征在于，所述基因具有编码β catenin蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列包含下述DNA序列之一(1)编码SEQ ID NO.1氨基酸序列的DNA序列；(2)编码SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中缺失、添加、插入或取代一个或多个氨基酸所得到的具有SEQ ID NO.1相同活性的氨基酸序列的DNA序列。
2.根据权利要求1所述的日本血吸虫基因，其特征在于，所述基因具有SEQID NO. 2所 示的DNA序列。
3.—种日本血吸虫蛋白质，其特征在于，所述蛋白质选自(1)具有SEQID NO. 1氨基酸序列的蛋白质；(2)具有SEQID NO. 1中部分氨基酸序列的活性片段或保守性变异蛋白质；(3)SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列中缺失、添加、插入或取代一个或多个氨基酸所得到 的具有SEQ ID NO. 1相同活性的氨基酸序列的蛋白质。
4.根据权利要求3所述的日本血吸虫蛋白质，其特征在于，所述蛋白质具有SEQID NO. 1所示氨基酸序列。
5.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求1所述日本血吸虫基因DNA序列的全部或 部分序列。
6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于，包含编码SEQID NO. 1中8-310位氨 基酸序列的DNA序列。
7.一种宿主细胞，其特征在于，包含权利要求5或6所述的重组载体，或已用权利要求 1所述基因序列转化或转染。
8.一种能与权利要求3所述日本血吸虫蛋白质特异性结合的抗体。
9.权利要求1所述日本血吸虫基因的用途，其特征在于，用于制备预防或治疗血吸虫 病的药物；或用于筛选预防或治疗血吸虫病的药物。
10.权利要求3所述日本血吸虫蛋白质的用途，其特征在于，用于制备预防或治疗血吸 虫病的药物；或用于筛选预防或治疗血吸虫病的药物。
全文摘要
本发明公开了一种日本血吸虫基因，所述基因具有编码β-catenin蛋白的核苷酸序列，该核苷酸序列包含编码SEQ ID NO.1氨基酸序列的DNA序列，或编码SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中缺失、添加、插入或取代一个或多个氨基酸所得到的具有SEQ ID NO.1相同活性的氨基酸序列的DNA序列。本发明还公开了上述基因编码的蛋白质。本发明的日本血吸虫β-catenin基因和蛋白，参与调控血吸虫的器官分化、虫卵的形成及卵胚发育等过程，对开发控制血吸虫生长发育的新药具有很高的应用价值。
文档编号C12N1/15GK101892240SQ20101023905
公开日2010年11月24日 申请日期2010年7月28日 优先权日2010年7月28日
发明者冯新港, 李红飞, 杨健美, 林矫矫, 王孝波, 苑纯秀 申请人:中国农业科学院上海兽医研究所