专利名称：一种发酵型健肠乳酪/粉的制造方法及其所应用的干酪乳杆菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种发酵型健肠乳酪/粉的制造方法及其所应用的干酪乳杆菌。
背景技术：
目前在乳酪/粉中，主要是以单一菌株或以数株乳杆菌发酵为主，还未见同时使用乳杆菌和双歧杆菌进行发酵的产品，这些乳酪/粉中活菌含量太低，再加上含乳饮料国家标准设定的下限值较低，一般均在105个/毫升以下，它所使用菌株的功能性，均以一般益生菌所固有的改善肠内菌群和提高免疫力为主要健康声称，还未见降低牛奶蛋白抗原性的菌株。
发明内容
本发明提供了一种发酵型健肠乳酪/粉的制造方法及其所应用的干酪乳杆菌，它不但可以存活状态到达小肠，这样可以改善肠内菌群和提高免疫力的功效，能够降解牛奶中抗原性以及蛋白质的抗原性，减少牛奶中容易引起过敏性抗原蛋白质含量。本发明采用了以下技术方案一种干酪乳杆菌Lactobacillus CaSeiJY68，其保藏号为 CGMCC No :3567ο本发明公开了一种发酵型健肠乳酪/粉的制造方法，它包括以下步骤步骤一，准备干酪乳杆菌 Lactobacillus casei JY68 和短双歧杆菌 Bifidobacterium breve QQ12 菌株；步骤二，将干酪乳杆菌Lactobacilluscasei JY68的菌株培养液单独或与干酪乳杆菌干酪亚种一起接种到MRS培养基中在恒温下进行发酵，将短双歧杆菌Bifidobacterium breve QQ12菌株接种到TOS培养基中发酵；步骤三，然后将步骤二中发酵后的两种菌株冷却，冷却后进行离心分离，收集菌体；步骤四，在菌体内添加冻干保护剂，然后在低温下预冻，然后冷冻干燥制得发酵型健肠乳酪/粉，最后进行包装。本发明步骤二中的干酪乳杆菌Lactobacillus casei JY68的菌株培养液单独或与干酪乳杆菌干酪亚种一起在MRS培养基中进行发酵的恒定温度为37°C，发酵的时间为M 小时。本发明步骤二中的短双歧杆菌BifidcAacteriumbreve QQ12菌株在TOS培养基中发酵的恒定温度为37°C，发酵的时间为M小时。本发明步骤三中两种菌株的冷却温度小于或等于4°C，离心分离时的离心速度为 6000rpm，离心时间为20min。本发明步骤四中冻干保护剂的成分为脱脂乳40% -50%、乳清粉10% -20%, Vc2% -5%、乳糖2% -5%。。本发明步骤四中预冻的温度为_80°C，预冻的时间为2-4小时。本发明具有以下有益效果本发明的发酵型健肠乳酪/粉中含有干酪乳杆菌 Lactobacillus casei JY68和干酪乳杆菌干酪亚种，干酪乳杆菌Lactobacillus casei JY68不但可以存活状态到达小肠，这样可以改善肠内菌群和提高免疫力的功效，而且具有很高的耐酸性，强繁殖性，并且能够降解牛奶中抗原性以及蛋白质的抗原性，减少牛奶中容易引起过敏性抗原蛋白质含量，另外热量降低一半，保持爽口不腻的口感，满足了糖尿病患者或渴望低热量食品的消费者的需求，在保质期内的活菌数能维持在108CFU/毫升以上， 大大高于现在市场上的商品含量，益生菌在保质期内能保持活菌数在108CFU/毫升以上的高数量级并且能以存活状态到达肠内。
图1为本发明的利用MEGA3. 1生物学软件构建的系统发育树
具体实施例方式本发明为一种干酪乳杆菌，分类名称为干酪乳杆菌Lactobacilluscasei，参据的生物材料(株)JY68，该菌种保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码100101， 其保藏编号为CGMCC No. 3567，保藏日期为2010年1月12日，结果是存活。干酪乳杆菌 Lactobacillus caseiJY68的菌株发酵后的产品其抗原价能减低到发酵前的1/1000，它是通过以下实验制得的一、乳酸菌株蛋白酶活性和肽酶活性试验首先从日本购买4个菌株 lactobacillus casei subsp. casei L—14, Streptococcus lactissubsp. cremoris H—61, Streptococcus lactis subsp. Iactis 527 ；Streptococcus thermophilus 510 ；又从 Hansen 公司购买的 4 个菌株 Lactobacillus bulgaricus C2, lactobacillus helveticus Cl, lactobacilluslactis Cl, Streptococcus thermophilus Cl ；以及分离自新疆传统发酵乳的 2 个菌株Lactobacillus casei JY68, Streptococcus diacetylactis Fl 菌株的蛋白酶活性和肽酶活性使用Forin法进行了测定。以对Glu-pNA等8种合成基质及酪蛋白的分解程度作为活性判断指标，发现Lactobacillus casei JY68和Sti^ptococcus diacetylactis Fl菌株有较大的蛋白酶活性和肽酶活性。二、降低β乳球蛋白抗原性试验接着将蛋白酶活性和肽酶活性较高的两个菌株接种至10%的灭菌脱脂乳中，对培养液中β乳球蛋白的抗原性利用ELISA法进行测试。酵液脱苦效果的感官评价试验。三、然后将具有β乳球蛋白抗原性低减效果的2个菌株lactobacilluscasei JY68, Streptococcus diacetylactis Fl添加到10%脱脂乳蛋白酶水解液中，以0. 04%咖啡因的苦度为对照，对其脱苦效果进行了感官评价试验。通过以上试验，优选出不但具有较强的蛋白酶和肽酶活性，而且可以降低β乳球蛋白抗原性以及其发酵液不呈现苦味的干酪乳杆菌 Lactobacillus caseiJY68 菌株。干酪乳杆菌Lactobacillus casei JY68的分离方法以新疆采取的传统发酵乳分离样品，取ImL上述样品放入灭菌小试管中，接种于IOmL石蕊牛乳培养基中，置于37°C 恒温培养箱中增菌培养至酸化凝固并呈现粉红色时取出，用灭菌接种环挑取划线接种于含有IOppm放线菌酮和IOppm硫酸粘菌素的BL琼脂培养基中，将其放入厌氧培养罐中，置于 37°C条件下培养48小时，形成菌落后，用接种环挑取菌落，接种于MRS培养液中，置于37°C 条件下培养M小时，待菌株生长好后，再次划线接种于BL琼脂培养集中，37°C下厌氧培养 48小时，记录观察菌落形态和革兰氏染色细胞形态特征，并进行过氧化氢酶试验，分离出在所述试验中呈阴性的杆菌，所述杆菌为乳杆菌。将所述乳杆菌进一步纯化培养，并进行低温保存。干酪乳杆菌Lactobacillus casei JY68的鉴定方法一、生理生化鉴定参照伯爵氏细菌鉴定系统，对被试菌体的形态以及生理生化特性进行鉴定，采用梅里埃API 50CHL鉴定试剂盒对其生理生化特性进行鉴定。二、16S rRNA 序列鉴定1、采用的试剂Taq酶、dNTP、DNAmarker、溶菌酶、蛋白酶K、CTAB, SDS(购自北京宝杰罗生物科技有限公司)GoldVieW(购自北京塞百盛基因技术有限公司)。2、PCR引物16S rRNA序列扩增引物由上海生物工程有限公司合成，引物序列如下Ll :5，-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，L2 :5， -CGGCTACCTTGTTACGACTT-3，3、菌体培养将送检样品在平板上划线分离，培养M_30h后挑取单菌落接种到 20ml液体培养基中，30°C 200rpm培养20_24h。4、基因组DNA提取基因组DNA提取参照文献。用SDS-蛋白酶K裂解，十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)沉淀细胞碎片和多糖，再用异丙醇沉淀来提取总DNA (Wilson，1987)。(1)取单菌落接种于5ml相应的培养基中，在30°C 下培养Mh ； (2)取1.0ml菌液于1.5ml离心管中，13，OOOrpm离心anin，弃上清；(3)沉淀重悬于l.Oml 0.85% NaCl中。(4)室温13，OOOrpm离心2min，弃上清；(5)沉淀重悬于550 μ 1 IXTE 中；(6)力口 17 μ 1 溶菌酶(35mg/ml)，37°C 温育 30min ； (7)加 3 μ 1 蛋白酶 K (20mg/ ml)，37°C温育 30min ； (8)加 30 μ 1 10% SDS，37°C温育 30min ； (9)加 100 μ 1 5Μ NaCl 充分混勻；(10)加 80 μ 1 CTAB/NaCl 溶液，混勻，65°C水浴 IOmin ； (11)加等体积(0. 7-0. 8ml) 氯仿/异戊醇04 1)，轻轻振荡混勻；(12)室温，13，OOOrpm离心IOmin ； (13)将上清液转移到一新1.5ml离心管中，加入等体积酚/氯仿/异戊醇05 24 1)轻轻振荡混勻； (14)重复第1 步；(1 将上清液转移到一新1. 5ml离心管中，加入等体积氯仿/异戊醇 (24 1)轻轻振荡混勻；(16)重复第12)步；(17)将上清液转移到一新1. 5ml离心管中， 加入0.6体积异丙醇，混勻后4°C静置30min ;(18)20°C 13，OOOrpm离心7min ； (19)弃上清， 加500 μ 1 70%乙醇，轻轻颠倒数次(洗盐)；(20) 40C 15，OOOrpm离心7min ； (21)重复洗盐两次；02)倒置离心管，干燥DNA沉淀7min。DNA沉淀溶于100 μ 1 1 X TE缓冲液，_20°C保存备用。5、PCR 扩增反应体系为ΙΟΟμΙ:Taq (5U/ μ 1) 0. 8 μ 1 ； 10 X PCR Buffer (Mg2+Plus) 10 μ 1 ；dNTP Mixture (2. 5mM/ each) 8 μ 1 ；模板 DNA 2. 5ng ；引物 27F(10y 1 mol/L)2y 1，引物 1541R(10 μ mol/L) 2 μ 1 ； ddH20 补足到 100 μ 1。PCR反应条件94 0C for4min ；94 °C for lmin，58°C for lmin，72°C for lmin30sec, 30cycles ； 72°C for 5min ；4°C save, end。6、电泳检测用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA，用1 %琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。显色剂为GoldView。7、序列测定纯化后的PCR产物采用ABI3730基因测序仪测序。测序工作由上海生工技术有限公司完成。8、序列分析与系统树的构建采用序列图谱软件Chromas，参照正、反向序列图谱，对序列入工校对。从GenBank 核酸序列数据库中下载戈登氏菌属相关模式菌株的16S rRNA基因序列，与所测的RR和RY 菌株序列一起，用Clustal X软件进行序列比对(alignment)；然后利用MEGA3. 1生物学软件构建系统发育树，MEGA3. 1生物学软件构建系统发育树见图1，采用Neighbor-Joining法进行系统发育分析，并进行1000次重复的Bootstraps统计学检验。三结果与分析1生理生化鉴定结果经生理生化试验初步鉴定，JY68细胞呈杆状，革兰氏染色阳性，接触酶阴性能在 15°C和45°C条件下生长，能利用葡萄糖和果糖，初步鉴定为干酪乳杆菌(LactcAaciIlus casei)其生理生化特性见表1。表1生理生化特征
权利要求
1.一种干酪乳杆菌 Lactobacillus casei JY68，其保藏号为 CGMCCNo :3567。
2.一种发酵型健肠乳酪/粉的制造方法，它包括以下步骤步骤一，准备干酪乳杆菌Lactobacillus casei JY68和短双歧杆菌Bifidobacterium breve QQ12 菌株；步骤二，将干酪乳杆菌Lactobacillus casei JY68的菌株培养液单独或与干酪乳杆菌干酪亚种一起接种到MRS培养基中在恒温下进行发酵，将短双歧杆菌Bifidobacterium breve QQ12菌株接种到TOS培养基中发酵；步骤三，然后将步骤二中发酵后的两种菌株冷却，冷却后进行离心分离，收集菌体；步骤四，在菌体内添加冻干保护剂，然后在低温下预冻，然后冷冻干燥制得发酵型健肠乳酪/粉，最后进行包装。
3.根据权利要求2所述的发酵型健肠乳酪/粉的制造方法，其特征是步骤二中的干酪乳杆菌Lactobacillus casei JY68的菌株培养液单独或与干酪乳杆菌干酪亚种一起在MRS 培养基中进行发酵的恒定温度为37°C，发酵的时间为M小时。
4.根据权利要求2所述的发酵型健肠乳酪/粉的制造方法，其特征是步骤二中的短双歧杆菌BifidcAacterium breve QQ12菌株在TOS培养基中发酵的恒定温度为37°C，发酵的时间为M小时。
5.根据权利要求2所述的发酵型健肠乳酪/粉的制造方法，其特征是步骤三中两种菌株的冷却温度小于或等于4°C，离心分离时的离心速度为6000rpm，离心时间为20min。
6.根据权利要求2所述的发酵型健肠乳酪/粉的制造方法，其特征是步骤四中冻干保护剂的成分为脱脂乳40% -50%、乳清粉10% -20%,Vc2% _5%、乳糖2% _5%。
7.根据权利要求2所述的发酵型健肠乳酪/粉的制造方法，其特征是步骤四中预冻的温度为-80°C，预冻的时间为2-4小时。
全文摘要
本发明公开了一种干酪乳杆菌Lc JY68，其保藏号为CGMCC No.3567。本发明还公开了一种发酵型健肠乳酪/粉的制造方法，一，准备干酪乳杆菌Lc JY68和短双歧杆菌BbQQ12菌株；二，将干酪乳杆菌Lc JY68的菌株培养液单独或与干酪乳杆菌干酪亚种一起接种到MRS培养基中在恒温下进行发酵，将短双歧杆菌BbQQ12菌株接种到TOS培养基中发酵；三，然后将步骤二中发酵后的两种菌株冷却，冷却后进行离心分离，收集菌体；四，在菌体内添加冻干保护剂，然后在低温下预冻，然后冷冻干燥制得发酵型健肠乳酪/粉，最后进行包装。
文档编号A23C9/127GK102337231SQ201010238880
公开日2012年2月1日 申请日期2010年7月28日 优先权日2010年7月28日
发明者赵景阳 申请人:泰州市科星生物技术有限公司