专利名称：一种重组人干扰素α2b DNA片段及编码的蛋白质的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药生物工程技术领域，涉及一种重组人干扰素DNA片段及编码的蛋 白质。
背景技术：
干扰素α (interferon, IFNα)是一种细胞因子，具有抗肿瘤增生、抗病毒等生物 活性，在炎症、病毒和恶性肿瘤等方面具有显著疗效。采用分子生物学及DNA重组技术，已 经研发上市了重组人干扰素。但是人干扰素α 2b作为药物，并没有达到最大优化，有的人 干扰素α 2b其比活不够高，也有的可溶性程度不高。人们不断应用新方法和技术，对人干 扰素α 2b进行改造，试图寻找和发现比活更高、可溶性程度较高的新型人干扰素。基因工 程和PCR方法为改造干扰素基因序列提供了有力的技术支持，用于获得更高活性的干扰素 α 2b，提高疗效和延长半衰期。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种重组人干扰素α 2b DNA片段。本发明的第二个目的是提供第二种重组人干扰素α 2b DNA片段。本发明的第三个目的是提供第二种重组人干扰素α 2b DNA片段编码的蛋白质。本发明的第四个目的是提供第三种重组人干扰素α 2b DNA片段。本发明的第五个目的是提供第三种重组人干扰素α 2b DNA片段编码的蛋白质。本发明的第六个目的是提供第四种重组人干扰素α 2b DNA片段。本发明的第七个目的是提供第四种重组人干扰素α 2b DNA片段编码的蛋白质。本发明的技术方案概述如下一种重组人干扰素α 2b DNA片段，它是序列表SEQ ID NO. 1所述的核苷酸序列。第二种重组人干扰素α 2b DNA片段，它是序列表SEQ ID NO. 2所述的核苷酸序 列。序列表SEQ ID NO. 2的重组人干扰素α 2b DNA片段编码的蛋白质，它是序列表 SEQIDNO. 3所述的氨基酸序列。第三种重组人干扰素α 2b DNA片段，它是序列表SEQ ID N0. 4所述的核苷酸序 列。序列表SEQ ID N0. 4的重组人干扰素α 2b DNA片段编码的蛋白质，它是序列表 SEQIDN0. 5所述的氨基酸序列。第四种重组人干扰素α 2b DNA片段，它是序列表SEQ ID N0. 6所述的核苷酸序 列。
序列表SEQ ID NO. 6的重组人干扰素α 2b DNA片段编码的蛋白质，它是序列表 SEQID NO. 7所述的氨基酸序列。分别含有序列表SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 6的重组人干扰素α 2b DNA片段的质粒，用下述两种方法之一构建的第一种方法是根据大肠杆菌EcolC1958基因序列，设计引物扩增得到产物 EcolC1958，用XbaI和EcoRI双酶切质粒pET28a和扩增产物EcolC1958，连接，构建出载体 PBPE172，将含有序列表SEQ ID N0. 2所述的核苷酸序列与载体pBPE172酶切后连接或将含 有序列表SEQ ID N0. 4所述的核苷酸序列与载体pBPE172酶切后连接或含有序列表SEQ ID N0. 6所述的核苷酸序列与载体pBPE172酶切后连接，得到含有序列表SEQ ID N0. 2的重组 人干扰素α 2b DNA片段的质粒或含有序列表SEQ ID N0. 4的重组人干扰素α 2bDNA片段 的质粒或含有序列表SEQ ID N0. 6的重组人干扰素α 2b DNA片段的质粒。第二种方法是将含有序列表SEQ ID N0. 2所述的核苷酸序列与载体pET 43. Ia 酶切后连接或将含有序列表SEQ ID N0. 4所述的核苷酸序列与载体pET 43. Ia酶切后连接 或含有序列表SEQ ID N0. 6所述的核苷酸序列与载体pET 43. Ia酶切后连接，得到含有序 列表SEQ IDN0. 2的重组人干扰素α 2b DNA片段的质粒或含有序列表SEQ ID N0. 4的重组 人干扰素α 2bDNA片段的质粒或含有序列表SEQ ID N0. 6的重组人干扰素α 2b DNA片段 的质粒。本发明的重组人干扰素α 2b DNA片段编码的蛋白质主要以可溶性方式存在，其抗 病毒活性是人天然干扰素的几十倍。其抗肿瘤活性，与人天然干扰素相比，具有较高的抗增 殖活性。
图1是PCR后的rh-mIFN-1片段的电泳图。图2是大引物法获得的rh-mIFN-2片段的电泳图。图3是大引物法获得的rh-mIFN-3片段的电泳图。图4是重叠延伸获得的rh-mIFN-7片段的电泳图。图5是pBPE172-rh-mIFN-7人干扰素产物的质粒双酶切的电泳图。图6是pPET43. la-rh-mlFN系列质粒双酶切电泳图。
具体实施例方式本发明在干扰素研究方面，进行了大量的前期工作。对目前发现的干扰素进行生 物信息学同源性分析和功能预测，根据相关文献中报道的干扰素基因序列的活性位点，比 较了几种干扰素药物的差异，设计出了 1种可具有高比活性的人干扰素α 2b氨基酸序列， 并反向推出一种重组人干扰素α 2b DNA片段(序列表SEQ ID NO. 1所述的核苷酸序列)。 并依据大肠杆菌的密码子偏嗜性和表达特性，进行定向突变改造，得到三种重组人干扰素 α 2bDNA片段(序列表SEQ ID N0. 2、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 6所述的核苷酸序列)，分别 将三种重组干扰素α 2b DNA片段序列与载体连接后，导入宿主细胞进行表达，得到重组人 干扰素α 2b DNA片段编码的蛋白质(序列表SEQ ID N0. 3、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 7所 述的氨基酸序列)。本发明的重组人干扰素α 2b DNA片段编码的蛋白质其抗病毒活性是人天然干扰素的几十倍。其抗肿瘤活性，与人天然干扰素相比，具有较高的抗增殖活性。首先通过对人干扰素IFNa 2b基因进行结构和功能关系的分析，选择性将人干扰 素受体结合区域和活性位点的氨基酸残基置换成其它氨基酸残基后的结果的分析，选择 了对52、53、55、103、107、113、121、125、132、161位氨基酸10个残基进行定向改造，应用 PCR技术，不断地优化PCR反应体系和反应条件，首先设计并合成了 rh-mIFN-1 (序列表SEQ IDN0. 1所述的核苷酸序列)，再根据基因片段52、53、55和103、107位氨基酸相隔较近的特 点，采用大引物PCR的方法对其进行多位点诱变，依顺序获得了 rh-mIFN-2和rh-mIFN_3编 码基因，在获得rh-mIFN-2时，利用下游引物对161位进行突变，最后采用重叠延伸定点突 变方法以rh-mIFN-6为模板，分别对113、121、125、132位氨基酸残基进行定点诱变，获得了 rh-mIFN-4、rh-mIFN-5、rh-mIFN-6、rh-mIFN-7。通过对 rh-mIFN-7 测序确定最终获得了一 种重组人干扰素α 2b DNA片段(序列表SEQ ID NO. 6所述的核苷酸序列)。然后分别将序列表SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 6所述的核苷酸 序列连接到高效表达载体PBPE172或pET43. Ia上，将重组载体pBPE172-rh_mIFN或 PET43. la-rh-mIFN在表达菌E. coli. BL21进行诱导表达，在选择表达菌株时，我们需选择 可以表达相应的识别其稀有密码子tRNA较多的菌株E. coli BL21，最后比较了重组载体 pBPE172-rh-mIFN或pET43. la-rh-mIFN的表达形式，由于前者具有EcolC1958_Tag融合蛋 白，后者具有Nus-tag融合蛋白，使得本发明的重组人干扰素a2b DNA片段编码的蛋白质 (序列表SEQ ID N0. 3所述的氨基酸序列、序列表SEQ ID N0. 5所述的氨基酸序列和序列表 SEQ ID N0. 7所述的氨基酸序列)以可溶性蛋白形式存在。并且通过对诱导时间、诱导温度和诱导剂浓度的选择，初步优化了工程菌的表达 条件，在30°C，IPTG浓度为ImM，诱导5h后获得的蛋白表达量高，工程菌稳定性好。下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。实施例1一种重组人干扰素α 2b DNA片段，它是序列表SEQ ID NO. 1所述的核苷酸序列。 基因片段的设计与合成为(1)通过 National Center for Biotechnology Information (NCBI)数据库检索 的人源干扰素α 2b原始序列，并根据已知上市的干扰素α 2b氨基酸序列，在总结和分析大 量关于干扰素活性位点的文献后，定向设计一种重组人干扰素α 2b DNA片段(序列表SEQ ID NO. 1所述的核苷酸序列)；(2)重组人干扰素α 2b DNA片段(序列表SEQ ID NO. 1所述的核苷酸序列)的合 成。重组人干扰素α 2b中含有166个氨基酸，其基因序列的长度在498bp。引物的设计与合成根据设计序列表SEQ ID NO. 1所述的核苷酸序列设计合成8对引物(Al A8)，长 度为60 80bp，相邻引物的重叠区域为12bp，Tm值在50 60°C范围。设计上游引物ES 和下游引物HX，上游引物ES引入酶切位点EcoRI，下游引物HX引入酶切位点HindIII ；各引物序列如下ES (直线为酶切位点)CGCGAATTCATGTGCGATCTGCCG (SEQ ID N0. 8)HX (直线为酶切位点)GTCAAGCTTTTCTTTGCTACGCAGTCTTTC (SEQ ID N0. 9)Al
ATGTGCGATCTGCCGCAGACCCATAGCCTGGGCAGCCGTCGTACCCTGATGCTGCTGGCCCAG(SEQ ID NO. 10)A2 CTTCCTGCGGAAAGCCAAAATCATGACGATCTTTCAGGCAGCTAAACAGGCTAATACGACGCATCTGGG CCAGCAG(seq ID NO. 11)A3 TTCCGCAGGAAGAATTTGGCAACCAGTTTCAGAAAGCGGAAACCATTCCGGTGCTGCATGAAATGATTC AGCAGAT(SEQ ID NO. 12)A4 GAATTTATCCAGCAGGGTTTCATCCCACGCCGCGCTGCTATCTTTGGTGCTAAACAGGTTGAAGATCTG CTGAATC(SEQ ID NO. 13)A5 CTGGATAAATTCTATACCGAACTGTATCAGCAGCTGAACGATCTGGAAGCGTGCGTGATTCAGGGCGTG GGCGTGA(SEQ ID NO. 14)A6 GTGATGCGCTGAAAATATTTACGCACGGCCAGAATGCTATCTTCTTTCATCAGCGGGGTTTCGGTCACG CCCACGC(SEQ ID NO. 15)A7 TCAGCGCATCACCCTGTATCTGAAAGAAAAAAAATATAGCCCGTGCGCGTGGGAAGTGGTGCGTGCGGA AATTATG(SEQ ID NO. 16)A8 TTCTTTGCTACGCAGGCTTTCCTGCAGGTTGGTGCTCAGGCTAAAGCTACGCATAATTTCCGC(SEQ ID NO. 17)人干扰素α 2b基因片段的PCR扩增PCR反应体系IOXpfu Buffer(含 Mg2+15mM)5μ LdNTP (各 2. 5mM)5 μ L上游引物ES (20ng/ μ L)2 μ L下游引物HX (20ng/ μ L)2 μ L引物 Al A8(20ng/y L)各 0· 2 μ L超纯水33. 9 μ Lpfu 酶(5U/ μ L)0· 5 μ L反应条件:95°C,5min；95°C，lmin，55°C，lmin，72°C，lmin，35 个循环；72°C，延伸 IOmin, 4°C保存。电泳验证PCR结果(见图1，泳道1为500bp左右)，采用PCR产物纯化试 剂盒纯化产物，编号rh-mIFN-1 (序列表SEQ ID NO. 1所述的核苷酸序列)，4°C保存。实施例2一种重组人干扰素α 2b DNA片段，它是序列表SEQ ID N0. 2所述的核苷酸序列。 步骤为利用大引物扩增方法对第52、53、55位氨基酸进行定点突变，同时设计下游引物HX2突变161位氨基酸，从而获得重组干扰素序列rh-mIFN-2 (序列表SEQ ID NO. 2所述的 核苷酸序列)；突变引物设计(波浪线为突变位点)Mut2(5，一3，)TTC ATG CAG CAC GCTAAT GGC CTG CGC TTT CTG(SEQ ID NO. 18)设计下游引物HX2(直线为酶切位点)GTC AAG CTT TTC TTT GCT ACG CAG TCG TTC (SEQ ID NO. 19)具体过程为第一轮反应体系(总体积为100 μ L)以上游引物ES (SEQ IDN0. 8)和突变引物 Mut2 (SEQ ID NO. 18)为引物，以 rh-mIFN-1 (SEQ ID NO. 1)序列为模板。PCR 反应条件94°C，4min，l 个循环；94°C，40s，60°C，30s，72°C，30s，共 24 个循 环；72°C，5min，l 个循环；第一轮PCR反应结束后，向100 μ L的上述反应物中补加dNTP (各 2. 5mM)6 μ L下游引物HX2(20ng/y L)2μ Lpfu 酶(5U/ μ L)1 μ LPCR 反应条件94 °C，40s, 68 "C，25s, 72 "C，Imin,共 10 个循环；94 °C，40s, 55 "C， 25s，72°C，lmin，共12个循环；72°C，延伸lmin，PCR反应结束，电泳验证(见图2，图中泳道 1为.第一轮PCR产物；泳道2为.第二轮PCR产物)，采用PCR产物纯化试剂盒纯化产物， 编号rh-mIFN-2 (序列表SEQ ID N0. 2所述的核苷酸序列)，4°C保存。实施例3一种重组人干扰素α 2b DNA片段，它是序列表SEQ ID N0. 4所述的核苷酸序列。 步骤为在获得rh-mIFN-2目标片段后，再以此序列为模板，采用大引物方法，对103、107 位氨基酸进行定点突变，从而获得目标序列rh-mIFN-3(序列表SEQ ID N0. 4所述的核苷酸 序列)；突变引物如下Mut3(5，一3，)CAG CGG GGT TTC TTC CAC GCC CAC TTC CTGAAT CAC GCA(SEQ ID NO. 20)；进行PCR，得到产物，电泳验证(见图3，图中泳道1为第一轮PCR产物；泳道2为 第二轮PCR产物)采用PCR产物纯化试剂盒纯化产物，获得编号rh-mIFN-3 (序列表SEQ ID N0. 4所述的核苷酸序列)，4°C保存。实施例4一种重组人干扰素α 2b DNA片段，它是序列表SEQ ID N0. 6所述的核苷酸序列。 步骤为(1)采用重叠延伸PCR定点突变方法对第132位氨基酸进行定点突变，从而获得重 组干扰素序列rh-mIFN-4，两条突变引物如下Mutl32F:GCT ATA TTT TTT TTC GGT CAG ATA CAG (SEQ ID NO. 21)
Mutl32R :ACC CTG TAT CTG ACCGAA AAA AAA TAT (SEQ ID NO. 22)
重叠延伸需要进行两轮三次PCR反应，具体步骤如下
大片段PCR反应体系
IOXpfu Buffer (含 Mg2+15mM)10 μ L
dNTP (各 2. 5mM)8μ L
上游引物ESOOng/yL)2μ L
突变引物 Mutl32F(20ng/y L)2μ L
模板 DNA rh-mIFN-3 (15ng/ μ L)2μ L
超纯水75 μ L
pfu 酶(5U/ μ L)1 μ L
大片段 PCR 反应条件:95°C,5min ；95°C, lmin,60°C, lmin, 72°C, lmin, 20 个循环；
72 °C，延伸5min，4°C保存。电泳验证PCR结果，采用采用PCR产物纯化试剂盒纯化产物，编 号 CYL_B1，4°C保存；小片段的PCR反应体系IOXpfu Buffer (含 Mg2+15mM)10 μ LdNTP(各 2.5mM)8μ L下游引物ΗΧ2 (20ng/ μ L)2 μ L突变引物Mutl32R(20ng/y L)2μ L模板DNA rh-mIFN-3 (15ng/ μ L) 2 μ L超纯水75 μ Lput S| (5U/ μ L)1 μ LPCR反应条件:95°C,5min ；95°C，lmin，55°C，25s，72°C，30s，20 个循环；72°C，延伸 5min，4°C保存。电泳验证PCR结果，采用PCR产物纯化试剂盒纯化产物，编号CYL-Sl，4°C保 存；配制反应体系(总体积为100 μ L):以扩增序列正确的基因为模板，取1支洁净的 微量离心管，依次加入IOXpfu Buffer (含 Mg2+15mM)10 μ LdNTP(各 2.5mM)8μ L上游引物ES(20ng/y L)2μ L下游引物HX2(20ng/y L)2μ LCYL-Bl1 μ LCYL-Sl1 μ L超纯水75 μ Lpfu Sl (5U/ μ L)1 μ LPCR 反应条件:95°C,5min ；95 °C，lmin，55°C，lmin，72°C，lmin，35 个循环；72°C, IOmin, 4°C保存。电泳验证，采用PCR产物纯化试剂盒纯化产物，编号rh-mIFN_4，4°C保存；(2)rh-mIFN-5 113位进行定点突变以rh-mIFN-4为模板，两条突变引物设计如下Mutll3F -.AAT GCT ATC TTC GTT CAT CAG CGG (SEQ ID NO. 23)
Mutll3R:ACC CCG CTG ATG AAC GAA GAT AGC(SEQ ID NO. 24)PCR 过程如步骤(1)，得到 rh-mIFN-5 ；(3)rh-mIFN-6 121位进行定点突变以rh-mIFN-5为模板，突变引物设计如下Mut 12 IF :CTG AAA ATA TTT ΓΓΤ CAC GGC CAG AAT (SEQ ID NO. 25)Mutl21R:ATT CTG GCC GTG AAAAAA TAT TTT CAG(SEQ ID NO. 26)PCR 过程如步骤(1)，得到 rh-mIFN-6 ；(4)rh-mIFN-7 125位进行定点突变以rh-mIFN-6为模板，突变引物设计如下Mutl25F:CAG GGT GAT GCG TCTAAA ATA TTT TTT CAC(SEQ ID NO. 27)Mutl25R:AAA AAA TAT TTT CGACGC ATC ACC CTG(SEQ ID NO. 28)PCR过程如步骤(1)获得了一种重组人干扰素α 2b DNA片段rh-mIFN_7，是序列 表SEQIDN0. 6所述的核苷酸序列。(见图4，图中泳道1为小片段；泳道2为大片段；泳道3 为重叠延伸产物rh-mIFN-7)。实施例5含有序列表SEQ ID N0. 2的重组人干扰素α 2b DNA片段的质粒 (pBPE172-rh-mIFN-2)的构建根据大肠杆菌EcolC1958基因序列，设计两条引物，分别引入酶切位点XbaI和 EcoRl,以大肠杆菌DNA为模板，进行PCR扩增，得到扩增产物EcolC1958，用XbaI和EcoRI 双酶切质粒pET28a和扩增产物EcolC1958，纯化酶切产物，连接，构建载体pBPE172 ；将PCR所获得的重组干扰素rh-mIFN-2基因片段用EcoRI和HindIII双酶切，反应 体系为 EcoRI 和 HindIII 各 1μ 1，DNA 产物 10 μ Ι,ΙΟΧΜ Buffer2 μ 1，无菌水补足 20 μ 1， 37°C反应 3h，反应产物用 EZ-IOSpin Column DNA Gel Extraction Kit Cat 纯化(纯化步 骤依照试剂盒说明依步操作)。同样，用EcoRI和HindIII双酶切pBPE172质粒，纯化酶切 产物。将pBPE172酶切片段与重组干扰素rh-mIFN_2基因片段进行琼脂糖电泳，估测浓 度后，按3 1摩尔浓度混合，加入等体积DNA Ligation Kit Ver 2. O连接酶，16°C连接 lh。将连接产物转化E. coli DH5 α感受态细胞，轻轻混勻，冰浴30min，42°C水浴热击 90s，迅速放置碎冰中静置2min，然后加入400 μ 1 LB液体培养基(不含Amp)，37°C摇床静 置50min，5000rpm/min离心1分钟，弃上清，加入新鲜的LB液体培养基200 μ 1，均勻涂布在 含有卡那霉素的LB固体培养基上，37°C培养过夜，第二天挑单菌落，用碱法提取质粒进行 双酶切验证，最后经测序正确即为表达质粒pBPE172-rh-mIFN-2。实施例6含有序列表SEQ ID N0. 4的重组人干扰素α 2b DNA片段的质粒 (pBPEI72-rh-mIFN-3)的构建。步骤同实施例5。实施例7含有序列表SEQ ID N0. 6的重组人干扰素α 2b DNA片段的质粒 (pBPEI72-rh-mIFN-7)的构建。步骤同实施例5。见图5。
实施例8表达载体也可以选pET43. Ia替代实施例5中的pBPEI72，构建出表达载体 pET43. la-rh-mIFN-2。实施例9表达载体也可以选pET43. Ia替代实施例6中的pBPEI72，构建出表达载体 pET43. la-rh-mIFN-3。实施例10表达载体也可以选pET43. Ia替代实施例7中的pBPE172，构建出表达载体 pET43. la-rh-mIFN-7。见图6，图中，泳道 6 为 pET43. la-rh-mIFN-2，泳道 8 为 pET43. la-rh-mIFN-3，泳道 22 为 pET43. la-rh-mIFN-7。实施例11重组人干扰素α 2b DNA片段编码的蛋白质(序列表SEQ ID NO. 3,SEQ ID NO. 5、 SEQ ID NO. 7所述的氨基酸序列)的制备。a、重组人干扰素α 2b的分离纯化(1)诱导表达将正确重组的pBPE172-rh-mIFN-2、pBPE172-rh-mIFN-3 和 pBPE172-rh-mIFN_7 质 粒分别转化表达菌株E. coli. BL21感受态细胞，轻轻混勻，冰浴30min，42°C水浴热击90s， 迅速放置碎冰中静置2min，然后加入Iml LB液体培养基(不含抗生素)，37°C静置45min， 5000rpm/min离心1分钟，弃上清，加入新鲜的LB液体培养基200 μ 1，均勻涂布在含有抗生 物的LB固体培养基上，37°C培养过夜，做为种子菌。(2)菌体收获将种子菌接入5ml LB液体培养基中(含氯霉素和氨苄青霉素)，37°C过夜复苏。然 后将复苏的菌液按1 100接种于50ml LB液体培养基中(含氯霉素和氨苄青霉素)，37°C 培养OD6tltl为0. 5-0. 6，加入ImM IPTG诱导培养，30°C诱导表达5h。用冷冻离心机8000rpm、 4°C下离心lOmin，收集菌体。(3)超声破菌将收集的菌体用1/10体积的PBS(pH8. 0)悬浮，置冰上，用超声裂解，采用功率水 平为6 7，超10s，停10s，共30次。当裂解液粘度变小，基本澄清时，说明菌体已经基本 破碎。基本破碎后，将破碎液在12000rpm，4°C离心lOmin，收集上清和沉淀，沉淀用等体积 PBS悬浮，冷冻保存，SDS-PAGE电泳分析。(4) SDS-PAGE 电泳分析按照以下步骤进行电泳样品处理取适量体积的各部分样品，包括诱导前和诱导后的菌体、超声后上清和沉淀，加入 1/5体积的5X SDS电泳缓冲液。100°C水浴加热IOmin使蛋白充分变性。凝胶配制12%分离胶的配制4mlA液、3.5ml B液、2. 5ml超纯水，50 μ LlO %过硫酸胺， 5 μ LTEMED0
4X浓缩胶配制0.67ml A液、Iml C液、2. 3ml超纯水、30 μ L10%过硫酸铵、5 μ L TEMED。加入TEMED后，立即混勻，灌胶。上样当PAGE胶凝固后，电泳槽内加入电泳缓冲液，上样。电泳电泳时先用较低电压，先150V，待样品进入分离胶后，电压提高到180V，直至溴酚 蓝至胶的底部为止。染色电泳完毕后，剥离分离胶，立即泡入考马斯亮蓝染色液中，摇床上缓慢摇30min，然 后更换脱色液冲洗两次，每次约45min，染色后扫描，确认有目标条带，以标准Marker做参 照估算特异性产物(序列表SEQ ID NO. 3,SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 7所述的氨基酸序列) 的表达量及其在菌体总蛋白中的比例。(5)上清过柱纯化将树脂加入层析柱中，结合缓冲液(20mmol/L磷酸钠；500mmol/L氯化钠；pH7. 8) 引流到顶部，使树脂沉淀至底部。将获得的细胞裂解液上清上柱，调整流速为每小时10个 柱体积，约3 4秒一滴。用6倍柱体积的结合缓冲液洗柱。用洗涤缓冲液(20mmol/L磷 酸钠；500mmol/L氯化钠；pH6. 0)洗柱，直至流出液280nm下的吸光值小于0. 01，大约为 20倍柱体积的缓冲液。用6个柱体积的lOOmmol/L的咪唑洗脱缓冲液(20mmol/L磷酸钠； 500mmol/L氯化钠；lOOmmol/L咪唑；pH7. 8)，洗脱结合的蛋白。分步收集蛋白，每份lml，检 测280nm下的吸光值。b、重组人干扰素α 2b的发酵优化(1)诱导温度的优化在3个250ml摇瓶中(含50ml LB液体培养基)分别接种表达菌，37°C培养至0D_ 为0. 6左右，加入终浓度ImM的IPTG诱导，分别在25°C、30°C、37°C诱导，继续培养5小时， 取出摇瓶，用冷冻离心机在8000rpm、4°C离心lOmin，收集菌体，取样分析。(2)诱导时间的优化按上述方法接种表达菌，37°C摇瓶培养至OD6tltl为0. 6左右时，加入ImM的IPTG， 在30°C下诱导，分别在lh、2h、3h、4h和5h取样电泳，分析不同诱导时间对蛋白表达量的影 响。(3)诱导剂浓度的确定按上述方法接种表达菌，37°C摇瓶培养至OD6tltl为0. 6左右时，加入0. lmM、0. 5mM、 ImM的IPTG，在30°C下诱导，取样电泳，分析不同诱导剂浓度对蛋白表达量的影响。结论从诱导温度、诱导时间和诱导剂浓度进行优化，初步确定发酵表达条件为30°C， IPTG浓度为ImM，诱导5h。(也可以用 pET43. la-rh-mIFN-2 替代 pBPE172-rh-mIFN_2、ρΕΤ43· la-rh-mIFN-3 替代 pBPE172-rh-mIFN-3、pET43. la-rh-mIFN-7 替代 pBPE172-rh-mIFN_7 进行诱导表达)实施例12本发明制备的重组人干扰素α 2b活性的测定(1)抗病毒活性检测
以WISH细胞/VSV系统进行抗病毒活性检测，按标准方法计算其抗病毒活性。结果为人天然干扰素为1. OX 108IU/mg。本发明所制备的三种重组人干扰素α 2b (序列表 SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 7所述的氨基酸序列)的活性分别为8. OXlO8IU/ mg、3.0X109IU/mg、5X109IU/mg，其抗病毒活性分别是人天然干扰素的8倍、30倍和50倍。(2)抗肿瘤活性检测以A549细胞作为靶细胞，用MTT法检测本发明所制备的三种重组人干扰素 a2b(序列表SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 7所述的氨基酸序列)的抗肿瘤活性， 以A549细胞作为靶细胞，以人天然干扰素作为对照。结果为以相同活性(抗病毒)的人天然干扰素与α 2b衡量它的抗增殖活性，本 发明所制备的三种重组人干扰素α 2b与人天然干扰素相比，都具有较高的抗增殖活性。
1权利要求
一种重组人干扰素α2b DNA片段，其特征是它是序列表SEQ ID NO.6所述的核苷酸序列。
2.权利要求1的一种重组人干扰素α2b DNA片段编码的蛋白质，其特征是它是序列表 SEQ ID NO. 7所述的氨基酸序列。
全文摘要
本发明公开了一种重组人干扰素α2b DNA片段及编码的蛋白质，重组人干扰素α2bDNA片段是序列表SEQ ID NO.6所述的核苷酸序列，重组人干扰素α2b DNA片段编码的蛋白质是序列表SEQ ID NO.7所述的氨基酸序列。本发明的重组人干扰素α2b DNA片段编码的蛋白质主要以可溶性方式存在，其抗病毒活性是人天然干扰素的几十倍。其抗肿瘤活性，与人天然干扰素相比，具有较高的抗增殖活性。
文档编号C12N15/21GK101906424SQ201010239210
公开日2010年12月8日 申请日期2008年12月18日 优先权日2008年12月18日
发明者张和平, 杜磊, 梁玲玲, 祝琳琪, 赵广荣 申请人:天津大学