专利名称：人表皮生长因子铁蛋白重链亚基融合蛋白、构建方法及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医学领域靶向成像和给药的制备技术，具体地说涉及人表皮生长 因子铁蛋白重链亚基融合蛋白、制备方法及其用途。
背景技术：
纳米材料因其具有独特的性质使其在癌症诊断分析中展示了许多优势。将纳米技 术与生物医学领域相结合(纳米生物医学)已成为纳米技术领域中发展最为迅速的研究领 域之一。生物笼状蛋白材料(Protein cages)，如病毒外壳蛋白、热激蛋白70和铁蛋白等， 因为本身就是天然生物大分子，因而具有良好的生物兼容性。它们通常是由多个多肽亚基 结合而形成中空的结构，外部直径与中间空穴直径均在纳米尺度范围内。近来随着基因工 程、蛋白化学修饰技术与纳米技术的融合，这类生物纳米材料在蛋白的表面、内部以及各蛋 白亚基界面易于修饰的特性决定了它们能有效地组装各种功能分子以构建多功能纳米器 件，因此引起了的普遍关注和兴趣。因为人们可以根据需要赋予这类生物纳米材料各种各 样新的功能。本发明以铁蛋白重链亚基为载体构建功能化铁蛋白纳米粒子，涉及采用原核 表达PET系统制备包涵体铁蛋白重链亚基融合蛋白，并获得的人表皮生长因子铁蛋白重链 亚基融合蛋白(EGF: :FTH1)。表皮生长因子受体(以下简称EGFR)信号转导通路中在细胞 的增殖分化过程中起着很重要的作用。大量的研究表明，肿瘤细胞中的EGFR表达量过高。 这使得EGFR成为治疗肿瘤或者是肿瘤成像非常好的一个靶点。EGF是EGFR有效的一个配 体，将EGF修饰于纳米粒子表面用于肿瘤成像和治疗已见报道，但是将EGF融合于铁蛋白的 N端制备蛋白类的纳米粒子，使得该纳米粒子具有肿瘤细胞靶向性的研究尚未见报道。将 EGF融合于铁蛋白的C端会使得EGF存在于铁蛋白的内部，因而会丧失对肿瘤细胞的靶向 性，不属于本发明的讨论范畴。此外，本发明所采用的方法包括以Ecoil.BL21(DE3)为表达菌株构建EGF: :FTH1 工程菌，表达不可溶包涵体、包涵体分离与纯化、包涵体的变复性制备活性融合蛋白等步 骤。通过本发明制备的新的融合蛋白可以应用于表皮生长因子受体表达过量的肿瘤，如乳 腺癌的早期诊断和药物的传输系统。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的可用于肿瘤早期诊断和药物传输系统的载体蛋 白——人表皮生长因子铁蛋白重链亚基融合蛋白。本发明的目的还在于提供一种构建人表皮生长因子铁蛋白重链亚基融合蛋白的 方法。本发明的另一目的在于提供一种上述人表皮生长因子铁蛋白重链亚基融合蛋白 的用途。本发明所述的人表皮生长因子铁蛋白重链亚基融合蛋白其融合方式为hEGF融合
3于FTH1的N端，具有序列如下MAMNSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIEALDKYACNCWGYIGERCQYRDLKWWELREFMTTASTSQVRQN YHQDSEAAINRQINLELYASYVYLSMSYYFDRDDVALKNFAKYFLHQSHEEREHAEKLMKLQNQRGGRIFLQDIKKP DCDDWESGLNAMECALHLEKNVNQSLLELHKLATDKNDPHLCDFIETHYLNEQVKAIKELGDHVTNLRKMGAPESGL AEYLFDKHTL⑶SDNES。为实现以上技术目的，本发明采用基于PET原核表达制备活性蛋白的方法，包括 以下过程构建pET28a (+) /hEGF FTH1 表达工程菌采用重叠PCR技术扩增hEGF::FTHl的基因，并将片段插于pET28a(+)载体上。片 段和载体连接后，转化入DH5 a感受态细胞内以筛选正确序列的表达载体。之后，将序列正 确的表达载体转化入Ecoil. BL21 (DE3)表达菌株，以获得目标表达工程菌。诱导pET28a (+) /hEGF FTH1 表达菌表达 hEGF FTH1 目标蛋白将表达工程菌接种于新的LB培养液中，加入IPTG过夜培养。次日离心洗涤，收集 菌体。上述的表达工程菌以1 100比例接种于新的LB培养液中。分离与纯化包涵体破碎菌体，离心后回收沉淀。以含有tritonX-100溶液洗涤沉淀。变复性制备活性hEGF FTH1目标蛋白以8M尿素溶液溶解以上步骤获得的包涵体。之后梯度透析复性制备hEGF: :FTH1 目标蛋白。本发明的制备方法，包括两大阶段，即表达工程菌的构建和目标融合蛋白的制备。 本发明的第一部分为工程菌的构建。该工程菌的构建的核心是pET28a(+)/hEGF: :FTH1表 达载体的构建，目前有文献报道了人表皮生长因子和铁蛋白重链亚基的融合蛋白的制备， 但是本发明的不同之处在于hEGF融合于FTH1的N端。这种融合方式能很好地使得融合短 肽存在于FTH1壳状蛋白的表面，有利于肿瘤细胞的靶向结合，而文献中的C端融合虽可以 很好地实现可溶表达和制备，但是不能实现肿瘤细胞的靶向结合，不属于发明的讨论范畴 [Nucleic Acids Research,2005,33(12) :3751_3762]。本发明的第二部分目标蛋白的制备与纯化。本发明首次实现了 EGF: :FTH1融合蛋 白的制备。出于成本的考虑，本发明优先采用原核表达系统中的常规包涵体变复性法制备 活性EGF::FTH1融合蛋白。通过蛋白的电镜和活性实验证明了该目标蛋白的活性，可以实 现EGFR受体介导的乳腺癌MCF-7等多种细胞的靶向，可以用于生物医学领域的靶向成像和 靶向给药。所述抗人表皮生长因子受体单链抗体-铁蛋白重链亚基蛋白可以应用于表皮生 长因子受体表达过量的肿瘤，如乳腺癌的早期诊断和药物的传输系统，作为靶向成像试剂 或靶向药物载体。
图lhEGF FTH1融合蛋白序列图2实施例4中所制备的hEGF: :FTH1目标融合蛋白的透射电镜3用流式细胞术研究实施例5中所制备的EGF::FTH1融合蛋白对乳腺癌MCF-7细胞EGFR受体的靶向效果图，其中，(A)FTH1_F5M阴性对照，geo. mean 4. 26 ； (B) hEGF: :FTH1-F5M, geo. mean 13. 84 ； (C)EGF 阻断 hEGF: :FTH1_F5M，geo. mean 9. 70
具体实施例方式实施例1构建本发明的蛋白的具体方法，包括以下步骤步骤1)构建pET28a (+) /hEGF FTHl 表达工程菌采用重叠PCR技术扩增hEGF: :FTH1的基因，使片断在5’端带有Nco I酶切位点， 在3’端带有Not I酶切位点。酶切后并将片段插于pET28a(+)载体的NcoI和NotI之间。 片段和载体连接后，转化入DH5 α感受态细胞内，以菌落PCR、酶切鉴定法筛选阳性克隆。之 后，通过测序将序列正确的表达载体转化入Ecoil. BL21(DE3)表达菌株，以获得目标工程 表达菌。hEGF: :FTH1融合蛋白序列如下MAMNSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIEALDKYACNCWGYIGERCQYRDLKWWELREFMTTASTSQVRQN YHQDSEAAINRQINLELYASYVYLSMSYYFDRDDVALKNFAKYFLHQSHEEREHAEKLMKLQNQRGGRIFLQDIKKP DCDDWESGLNAMECALHLEKNVNQSLLELHKLATDKNDPHLCDFIETHYLNEQVKAIKELGDHVTNLRKMGAPESGL AEYLFDKHTLiiDSDNES步骤2)诱导 pET28a (+) /hEGF FTHl 表达菌表达 hEGF FTHl 目标蛋白从平板上挑取单克隆工程表达菌落，至于25ml LB液体培养基中(40% NaCl，40% Tryptone, 20% Yeast Extract，卡那霉素浓度 50μ g/ml)，置于 37°C 恒温摇床内，200rpm， 过夜培养。于次日按接种量接种至200ml LB液体培养基中(成分及抗生素浓度同上)。 置于37°C恒温摇床内，培养至OD为0. 5-0. 6时，加入终浓度为ImM异丙基-β -D-硫代半乳 糖苷(IPTG)，37°C，诱导过夜。最后在4°C、5000rpm条件下经30min离心收集菌体，菌体存 放于-20°C。步骤3)分离与纯化包涵体取出经过反复冻融的菌体，加入IOml的重悬液重悬菌体[50mM tris (三羟甲基氨 基甲烷)，PH 7. 9]。在功率为300W的超声破碎仪中破碎菌体150个周期(每个周期工作 3s,间隙7s)。在4°C，5000rpm条件下30min离心，除去上清，收集沉淀。加入洗涤液[50mM Tris,50mMNaCl, ImM EDTA(乙二胺四乙酸)，1% tritonX-100 (C34H62O11)，ρΗ7· 9]，洗涤所得 的沉淀4次，得到较纯的包涵体。步骤4)变复性制备活性hEGF FTHl目标蛋白向洗涤液中加入 25ml 变性液[50mM Tris_HCl，8M Urea(尿素)，ImM EDTA, IOmM DTT(二硫苏糖醇)，ρΗ7. 9]重悬洗涤后的包涵体。置于28°C的恒温摇床中过夜，使包涵体 溶解。次日，用变性液对溶解的包涵体进行稀释，使蛋白最终的浓度为0. lmg/mL并至于透 析带中。在4°C下浸没于复性液中透析，每隔6h，更换一次复性液(每次更换的复性液见下 表)。待透析复性结束后，过滤收集复性后的蛋白溶液，用50KD的超滤管超滤浓缩目标蛋白。复性液的配方如下
权利要求
一种人表皮生长因子铁蛋白重链亚基融合蛋白，其融合方式为hEGF融合于FTH1的N端，具有氨基酸序列如下MAMNSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIEALDKYACNCWGYIGERCQYRDLKWWELREFMTTASTSQVRQNYHQDSEAAINRQINLELYASYVYLSMSYYFDRDDVALKNFAKYFLHQSHEEREHAEKLMKLQNQRGGRIFLQDIKKPDCDDWESGLNAMECALHLEKNVNQSLLELHKLATDKNDPHLCDFIETHYLNEQVKAIKELGDHVTNLRKMGAPESGLAEYLFDKHTLGDSDNES。
2.—种构建如权利要求1所述的人表皮生长因子铁蛋白重链亚基融合蛋白的方法，其 特征在于，包括以下过程(1)构建pET28a(+)/hEGF: :FTH1 表达工程菌采用重叠PCR技术扩增hEGF:: FTHl的基因插于pET28a (+)载体上，转化入DH5a感受 态细胞内之后，将序列正确的表达载体转化入Ecoil. BL21 (DE3)表达菌株，以获得目标表 达工程菌；(2)诱导pET28a(+)/hEGF: FTHl 表达菌表达 hEGF: FTHl 目标蛋白 将表达工程菌接种于LB培养基中，IPTG诱导，离心收集菌体；(3)分离与纯化包涵体破碎步骤(2)获得的菌体，离心后回收并洗涤沉淀；(4)变复性制备活性hEGF:FTHl目标蛋白以8M尿素溶液溶解(3)步骤获得的包涵体，之后梯度透析复性制备hEGF: :FTH1目标蛋白。
3.如权利要求2所述的构建人表皮生长因子铁蛋白重链亚基融合蛋白的方法，其特征 在于，步骤(2)中所述的表达工程菌和LB培养基的接种比例为1 100。
4.一种如权利要求1所述人表皮生长因子铁蛋白重链亚基融合蛋白的用途，其特征在 于，作为靶向成像试剂和靶向药物载体的用途。
全文摘要
本发明提供一种可用于肿瘤早期诊断和药物传输系统的载体蛋白——人表皮生长因子铁蛋白重链亚基融合蛋白、构建方法及其用途。该融合蛋白是将人表皮生长因子融合于铁蛋白重链亚基蛋白的N端。本发明的融合蛋白具有很好的人表皮生长因子受体介导的肿瘤细胞靶向性，可以用于靶向成像试剂和靶向给药载体。
文档编号C12P21/02GK101942023SQ20101023950
公开日2011年1月12日 申请日期2010年7月29日 优先权日2010年7月29日
发明者叶邦策, 曹旭妮, 朱培, 李旭, 阎青 申请人:华东理工大学