铁蛋白用于治疗缺铁性障碍的用途的制作方法

专利名称：铁蛋白用于治疗缺铁性障碍的用途的制作方法
铁蛋白用于治疗缺铁性障碍的用途连续申请信息本申请要求分别于2007年1月四日提交的第60/886，972号美国临时专利申请 和2007年10月31日提交的第60/984,007号美国临时专利申请的权益，在此将它们的全 部内容引入本文作为参考。
背景技术：
铁蛋白作为原核生物和真核生物中的主要细胞内储铁蛋白，是包含M个多肽亚 基的大型多亚基复合物(差不多480kDa)。该储铁复合物在血清中以高浓度存在，能够包 含多达4，500个位于水合氧化铁核中的铁离子0^3+)。在哺乳动物中，存在两种不同的亚 基种类，分别是具有大约21kDa分子量的重型(H)和具有19kDa分子量的轻型(L)，它们具 有大约的序列同一性。H和L亚基呈现不同的功能L亚基提高铁核的稳定性，而H亚 基具有看上去对于迅速吸收亚铁离子所必需的亚铁氧化酶的活性。富含H的铁蛋白位于组 织中，经历局部离子浓度的迅速变化。例如，在经历分化、发育、增殖和代谢应激的细胞中， H亚基的表达相比L亚基优先增加。脑对离子获取提出了很高的要求，这是因为与可组成脑微血管的邻近内皮细胞相 结合的紧密联结高度发达。这些连接阻止分子从细胞旁路流进脑中。形成的血脑屏障(BBB) 是用于避免脑接触血液中循环的潜在有害物质的非常有效的机制。然而，这种阻碍的结果 是必须为许多正常脑功能所需的营养物质设计特异性转运机制。胞饮作用是绕开BBB的有 效方法，但是由胞饮作用产生的小泡对化合物穿过脑血管内皮细胞的非特异性转运的贡献 相对小些。传统地，转铁蛋白已被认为是细胞中铁递送的主要机制，并且转铁蛋白介导的转 运系统已在 BBB 中被识别(Jefferies W. A.等人.Nature 312 :162-163,1984 ；Fishman J.， Rubin J. , Handrahan J. , Connor J. ,Fine R. J. Neurosci. Res. 18 :299-304,1987)。然而， 已经利用缺乏转铁蛋白(hypotransferrinemic)小鼠表明了铁不依赖于转铁蛋白被递送 至丨J脑(Malecki E. A. , Cook B. M. , Devenyi A. G. , Beard J. L. and Connor J. R. J. Neurol. Sci. 170 :112-118,1999) 0已经提出乳铁蛋白也可以将铁转运到脑中(Ji B.等人.Life Sci. 78 :851-855, 2005)，但是血清中乳铁蛋白的浓度几乎不能被检测到并且该蛋白质通常 存在于细胞(中性粒细胞)中，因此不可能对将铁转运到脑和其它器官中起作用。发明简述本发明人已惊奇地发现，长期以来被认为是储铁蛋白的铁蛋白可以起到铁递送蛋 白的作用。具体地，本发明人已经证实了在培养物中的内皮细胞和大鼠脑微血管上的内皮 细胞上存在H-铁蛋白受体，其识别H-铁蛋白，作为用于跨过BBB转运铁的手段。本发明提 供了一种用于治疗患者缺铁性障碍的方法，该方法包括向有此需要的患者给予治疗有效量 的铁蛋白-铁复合物。在本发明的一个实施方案中，铁蛋白-铁复合物包含H-铁蛋白。在 另一个实施方案中，缺铁性障碍包含脑缺铁。本发明还提供一种将铁递送到脑的方法，该方 法包括向患者给予铁蛋白-铁复合物形式的铁，从而使所述铁跨过血脑屏障转运并递送至 脑；一种使用H-铁蛋白作为靶向部分的方法，该方法包括将H-铁蛋白结合到脂质体，从而使所述脂质体以脑和/或脑中的细胞为靶点；以及一种用于治疗患者铁过载障碍的方法， 该方法包括向有此需要的患者给予治疗有效量的多亚基铁蛋白复合物，其中所述多亚基铁 蛋白复合物具有小于100%的铁结合能力。附图的简要说明图IA显示在48小时循环之后，器官中来自重组人H-铁蛋白(rH-铁蛋白)的59Fe 的体内吸收，与马脾铁蛋白(脾铁蛋白)进行对比。将5^e标记的H-铁蛋白或脾蛋白注射 到成年大鼠的尾静脉中并使其循环48小时。确定1. 0克每种器官中的放射性，并且通过计 算每种器官的μ C量相比于注射总量来确定％总量/gm组织重量。以这种揭示相对量的标 准来显示两种脑结构。显示的数据为3只动物的平均值士S. E.，ρ < 0. 05*。图IB显示大鼠脑中来自铁蛋白的59Fe的体内吸收。如图IA中的图例所述，用59Fe 标记的H-铁蛋白或脾蛋白对大鼠经尾静脉进行注射。通过确定一个脑半球μ C/注射的总 μ CX 100%来计算％总量，ρ < 0. 005**。显示的数据为3只动物的平均值士S. Ε.。图2Α显示来自H-铁蛋白的59狗吸收进入H-铁蛋白缺失的小鼠(_/+)和野生型 (-/_)小鼠的全身器官。动物经腹膜内注射摄取了等量的H-铁蛋白。铁蛋白循环48小 时。将所示的器官(包括脑)摘除并且基于0. Ig的各种器官确定总放射性的百分比，ρ < 0. 05*。图2Β显示在H-铁蛋白缺失的小鼠(+/_)脑中与野生型小鼠(+/+)脑中通过H-铁 蛋白递送的5Ve吸收的对比。这些数据来自于用来产生图2Α中的数据的小鼠的脑。脑中 的放射性％通过将从脑获得的5Ve每分钟的衰变数比上注射的总μ C来确定，ρ < 0. 05*。 显示的结果为三只动物的平均值士标准误差。图3Α表示在H-铁蛋白缺失的小鼠(+/_)和野生型小鼠(+/+)的各种全身器官中 通过脾铁蛋白递送的5Ve吸收的对比。用含有5Ve的脾铁蛋白对小鼠进行腹膜内注射。在 48小时后，将小鼠处死并将器官摘除。确定0. Ig的各种器官的放射性以及确定总放射性的 百分比并呈现该图中。数据为三只动物的平均值士S. Ε.。没有差值达到统计学意义。图:3Β表示在H-铁蛋白缺失的小鼠(+/_)脑中和野生型小鼠(+/+)脑中通过脾蛋 白递送的5Ve吸收的对比。这些数据来自于图3Α所用的小鼠。报道的放射性的量为注射 进动物中的总量％。显示的结果为三只动物的平均值士标准误差。图4为显示荧光素标记的H-铁蛋白流动穿过单层BREC培养物。该图显示了在4 小时内底室(basal chamber)中FITC标记的H-铁蛋白的转运速率。转运速率根据方法 部分的描述来确定。显示的数据为流速的平均值以及平均值的标准方差，该流速是由每单 位量的顶室(top chamber)荧光的底室(bottom chamber)荧光(Bf/Tf)相对于时间作图 的斜率而得到的。相比于葡聚糖对照和脾铁蛋白，H-铁蛋白转运是具有统计学意义的(ρ <0.01)**。脾铁蛋白与葡聚糖对照无差异。用钾缺乏的介质来对BRECs进行预处理，造成 FITC H-铁蛋白的转运显著降低(ρ <0.05)*，而用菲律宾菌素进行预处理使胞饮作用最小 化，这对H-铁蛋白转运速率无影响。将转铁蛋白的转运包括在内作为阳性对照。显示的葡 聚糖流量值为未经处理的对照样品，而葡聚糖流速不随任何处理而改变(数据未显示)。图5A为显示结合到BREC细胞勻浆的125I-H-铁蛋白和125I-脾-铁蛋白的饱和度 曲线图。该图说明结合到BREC细胞的H-铁蛋白是饱和的，但没有脾铁蛋白结合的证据。在 4°C下进行饱和结合2小时。确定的Kd为2. 7士0. 9nM,而Bmax为465. 7士63. lfmol/mg蛋白。
图5B显示从大鼠脑中分离的微血管上的125I-H-铁蛋白和125I-脾-铁蛋白的饱和 度曲线。曲线显示了对H-铁蛋白的结合是饱和的，而脾铁蛋白不结合。Kd为7.9 士 1.6nM 和 Bmax 为 572. 6士64. Ofmol/mg 蛋白。图6A为显示未标记的H-铁蛋白和脾铁蛋白竞争BREC勻浆上的125I-H-铁蛋白结 合位点的图。该图显示了通过增大未标记的H-铁蛋白浓度来竞争性抑制125I-H-铁蛋白对 BREC勻浆的结合，而不是利用脾铁蛋白。图6B为显示大鼠微血管上的竞争结合试验的图。该图说明125I-H-铁蛋白的结合 可以通过未标记的H-铁蛋白而不是脾铁蛋白以浓度依赖的方式来解离。图7为显示重组酵母中H-铁蛋白表达的Western印迹(4-20%梯度)。通道1 为标准样品(重组人H-铁蛋白)。通道2和4为用人L-铁蛋白转化的两种不同酵母的 菌落。通道3和5为用人H-铁蛋白转化的两种不同酵母菌落。该研究中所使用的抗体为 抗-HF HS-59(1 40，000持续16小时)，这是小鼠抗H-铁蛋白的单克隆抗体，由Paolo Arosio (Brescia意大利)慷慨提供。图8为Western印迹。首先借助凝胶电泳将蛋白质分离，然后用Perl's反应将凝 胶染色，该反应是已被用于表征铁蛋白含量的铁的stand组织染色)。通道1和2来自已 用L-铁蛋白转化的酵母菌落。在这些通道中没有发现铁的反应产物。通道3和4为在常 规铁培养基条件下(通道4)和富含铁培养基条件下(通道幻表达H-铁蛋白的酵母的蛋 白质提取物。H-铁蛋白的标准样品被用作对照(通道5)。通道6含有分子量标记物来显 示铁蛋白的大小。图9显示了利用缺铁标准大鼠模型获得的结果。进行缺铁(ID)饮食的动物具有 最低含量的血色素(Hb)。摄取不含铁的酵母(无铁酵母)的动物具有与ID动物相似的Hb 含量。在其它三组中发现Hb含量改善，在这种改善中，摄取补铁并用铁蛋白(ft)强化的酵 母的动物出现了最迅速的增长。甚至是摄取补铁而没有铁蛋白的酵母的动物比I^eSO4组的 Hb含量改善得更多。

图10显示来自图9中的测试动物组的血细胞比容水平。这些数据显示酵母作为 铁的载体在H-铁蛋白存在与否时对血细胞比容的纠正同样有效，且两者比现有标准的处 理选择-FeSO4都明显更好。持续进行ID饮食的动物和摄取未补铁的酵母的动物的血细胞 比容在11天的测试中没有增长。图11显示在图9和图10中测试的动物组中测定铁动员的测试结果。这些数据显 示铁蛋白强化的富含铁的酵母(酵母-Fe+Ft)使转铁蛋白(Tf)饱和度增长最大，随后是富 含铁但不含铁蛋白的酵母(酵母-无Ft)。图12显示两个主要的脑发育区域-中脑腹侧和尾部的铁含量。将在Hb和Hct分 析中(图9和10)描述的动物在其日龄14天时处死，并且测定中脑腹侧(VMB)和尾部的铁 浓度。摄取已用铁蛋白强化并补铁的酵母(酵母-Fe+Ft)的动物在这两个脑区域中比任何 其它组含有更多的铁。图13显示在脑的伏隔核(Necleus accubens，ΝΑ)和前额皮质 (prefrontalcortex, PFC)区域中的铁含量。在该图中，由铁蛋白强化补铁的酵母(酵 母-Fe+Ft)递送的铁的区域特异性明显。在NA中(类似于图12所述的VMB和尾部)，相比 于其它铁递送模式，铁含量提高。然而，在PFC中，由铁蛋白强化补铁的酵母递送的铁与在其它组的结果相似。图14A显示人H-铁蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO 1)。图14B显示人H-铁蛋白的cDNA序列(SEQ ID NO 2)。起始(ATG)和结尾(TAA) 的密码子被加粗，且BamHI(序列的5'末端)和HioI (序列的3‘末端)的限制性位点用 下划线标出。发明详述本发明提供了一种用于治疗患者缺铁性障碍的方法，该方法包括向有此需要的患 者给予治疗有效量的铁蛋白-铁复合物。如本文所使用的，“缺铁性障碍”包括与铁缺乏、铁吸收和/或铁代谢相关的障碍和 疾病。缺铁性障碍的实例包括缺铁性贫血，例如由在饮食中摄取铁或铁吸收不足引起的缺 铁性贫血。缺铁性贫血可能与例如营养不良、妊娠(包括产后期)、严重子宫出血、慢性疾病 (包括慢性肾病)、癌症、肾透析、胃绕道手术、多发性硬化症、糖尿病(例如I型糖尿病和II 型糖尿病)、胰岛素抵抗和注意力缺陷障碍有关。在本发明的一个实施方案中，缺铁性障碍与脑中铁含量不足有关，例如其发生在 各种神经和/或神经退行性疾病，包括帕金森症、阿尔茨海默症、不宁腿综合征(RLQ、与女 性贫血有关的认知能力不佳(suboptimalcognitive performance)、抑郁和失眠中。在另一 个实施方案中，缺铁性障碍包括在出生后的发育期间与脑缺铁有关的神经功能缺失，包括 髓鞘形成减少以及由发育期间缺铁引发的脑发育缓慢，导致认知能力差和运动受损。在脑中缺铁以及多巴胺合成减少都是缺铁性障碍，例如RLS和在儿童发育中 的缺铁的重量因素。多巴胺是脑中合成的神经递质，其对于正常的中枢神经系统(CNS) 的功能而言是必不可少的。在合成多巴胺的过程中，铁是酶即酪氨酸羟化酶的辅助因 子，这是多巴胺代谢中的限速步骤(Cooper等人(1991)The biochemical basis of neuropharmacology. OxfordUniversity Press, New York, N. Y.)。多巴胺能体系中的铁看 来是RLS病理以及儿童行为，包括注意力缺陷多动障碍(ADHD)中的重要成分。尽管RLS 和对照中的铁蛋白和转铁蛋白的血清含量正常，但是RLS患者的脑脊液(CSF)铁蛋白小于 65%和CSF转铁蛋白(血铁转运蛋白)多于3倍。铁的浓度在整个脑中以及随着多巴胺 的合成位置变化；RLS患者的黑质中和脑壳部分中的铁较少。通常，铁蛋白含量降低标志着 RLS的严重性。还有报道称患有ADHD的儿童的血清铁蛋白含量减少。术语“铁蛋白-铁复合物”是指蛋白质复合物，其包含多个铁蛋白亚基和铁原子。 适合的铁蛋白-铁复合物包含哺乳动物的H-铁蛋白亚基。来自各种哺乳类的H-铁蛋白亚 基的氨基酸序列已经被鉴别，参见，例如，OrinoKoichi等人，Sequence analysis of feline ferritin H and L subunit cDNAs ；Veterinary Biochem. 42 :7-11 (2005) ；Accession number :06A006486。在一个实施方案中，H-铁蛋白为人H-铁蛋白(SEQ ID N0:1;参见图 14A)。H-铁蛋白还可以为天然形成的或合成的人H-铁蛋白的同源物或变体。在某些实施 方案中，H-铁蛋白的同源物具有与人H-铁蛋白大约80%至约100%的序列同一性，例如 具有与人 H-铁蛋白至少 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。H-铁蛋白保持着与铁 结合的能力并且形成多亚基铁蛋白-铁复合物，但可以突变以获得变化的铁与铁蛋白之间 的结合和解离强度。铁蛋白-铁复合物包含H-铁蛋白亚基，但还可以包含一些L-铁蛋白亚基。在某些实施方案中，复合物的铁蛋白亚基成分包含相对于L-铁蛋白至少20 %的H-铁 蛋白，例如相对于L-铁蛋白大约20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或者100% 的H-铁蛋白。在一个实施方案中，铁蛋白-铁复合物中的全部铁蛋白亚基(即，100%的铁 蛋白亚基)为H-铁蛋白。H-铁蛋白可以是重组的H-铁蛋白。例如，H-铁蛋白可以为人 H-铁蛋白或其同源物，所述人H-铁蛋白或其同源物产生于酵母菌株中，该酵母菌株包含在 适当的酵母启动子控制下的编码H-铁蛋白的多核苷酸序列。铁蛋白-铁复合物中的铁可以为铁分子，或可以为含铁的复合物形式。“含铁的复 合物”或“铁复合物”为含有(II)或(III)价氧化态铁的化合物，其与有机化合物复合。铁 复合物包括铁-聚合物复合物、铁-碳水化合物复合物以及铁-氨基聚糖(aminoglycosan) 复合物。这些复合物是可商购的和/或可以通过本领域已知的方法合成。铁-碳水化合物复合物的实例包括铁-糖复合物、铁-寡糖复合物以及铁-多糖 复合物，例如铁-羧基麦芽糖、铁-蔗糖、铁-聚异麦芽糖(铁-葡聚糖)、铁-多麦芽糖 (铁-糊精)、铁-葡糖酸盐、铁-山梨醇(sorbital)和铁-氢化葡聚糖)；它们可以进一 步与其它化合物，例如山梨醇(sorbitol)、柠檬酸和葡糖酸)复合(例如铁-糊精-山梨 醇-柠檬酸复合物和铁蔗糖-葡糖酸复合物；以及它们的混合物。铁-氨基聚糖复合物的实例包括铁-硫酸软骨素，铁-硫酸皮肤素，铁-硫酸角质 素；它们可以进一步与其它化合物复合；以及它们的混合物。铁-聚合物复合物的实例包括 铁-透明质酸复合物，铁-蛋白质复合物及其混合物。本文所使用的“治疗(treatment) ”或“治疗(treating) ”，是指病症的完全消除以 及任何临床的或可定量测定的减轻，该病症为正在被治疗的患者或受试者的病症。“治疗” 是意在防止病理或障碍的症状发展或改变病理或障碍的症状而进行的干预。相应地，“治 疗”既指治疗性治疗也指预防或防范性措施。“治疗”还可以具体指姑息护理。需要治疗的 对象包括已经患有一种或多种缺铁性障碍以及要预防这些障碍的对象。在治疗有此需要的患者的过程中，向其给予治疗有效量的根据本发明的铁蛋 白-铁组合物。如本文所使用的，术语“治疗有效量”是指示用于治疗的组合物的量，而该 量不得超过可能造成明显副作用的量。评价治疗性治疗有效性的方法为本领域技术人员已 知。“有此需要的患者”是指可以从本发明的治疗方法中获益的任何患者或受试者。在 某些实施方案中，有此需要的患者为倾向于向一种或多种缺铁性障碍发展的患者，或患有 一种或多种缺铁性障碍但未显现任何临床症状的受试者，或患有一种或多种缺铁性障碍且 正经受一种或多种缺铁性障碍症状的患者。有此需要的患者可以为哺乳动物，例如人、狗、 猫、母牛、马、啮齿动物(例如小鼠、大鼠或仓鼠)或灵长动物。在一个实施方案中，患者为 人。在某些实施方案中，本发明的方法被用于实验动物、兽医应用和/或用于疾病的动物模 型的培育中。根据治疗的周期、给药频率、宿主和障碍的本质和严重性来变化给药剂量。本领域 技术人员不需要过度实验就可以确定剂量。以足以确保将充足剂量单位的铁蛋白-铁复合 物释放至患者中的剂量浓度来给予本发明的组合物，以提供希望的对缺铁性障碍的治疗。 根据生理和病理因素，例如患者的年龄、体重、病症的严重性和/或临床病史来确定实际给 药剂量。可以给予活性成分以实现大约50 μ M至大约1000 μ M的铁蛋白-铁复合物的体内血浆浓度。例如，本发明的方法可以利用组合物来提供每天每kg体重约0. 1至约1，OOOmg 或约1至约IOOmg的铁蛋白-铁复合物，例如每天每kg体重约30mg的铁蛋白-铁复合物。 然而，应理解的是，偏离提供的范围的剂量水平也可以适用于特定障碍的治疗。本发明的铁蛋白-铁复合物可以为适合给药的任何形式。这样的给药形式包括 片剂，缓冲片剂，丸剂，胶囊，肠溶包衣胶囊，糖衣丸，糯米纸囊剂，粉剂，颗粒剂，气雾剂，脂 质体，栓剂，乳膏，洗剂，油膏，皮肤贴剂，非肠道剂，锭剂，口服液，例如悬浮齐U、溶液和乳剂 (水包油或油包水)，滴眼液和注射液或它们的缓释剂型。希望的剂量可以通过连续输注， 或通过缓释制剂全天以规定的间隔、以几次增量的方式提供，或可以以大药丸剂、药糖剂或 糊剂提供。在一个实施方案中，通过与一种或多种药学上可接受的载体混合来制备包含铁 蛋白-铁复合物的药学组合物或制剂。在一些情况下，铁蛋白-铁复合物可以以包含铁 蛋白-铁复合物和缓冲液的组合物来递送，铁分子和铁蛋白分子溶解在该缓冲液中以使 铁-铁蛋白相结合(即形成铁蛋白-铁复合物)。然而，如果需要的话，可以加入其它产品 从而将铁的递送、储存最大化，或者将具体的运送方法最优化。此外，本发明包括如本文所 述的包含铁蛋白-铁复合物与其它适用于治疗缺铁性障碍的其它药剂相组合的组合型组 合物的用途。本发明所使用的，“药学上可接受的”意思是对于药学和兽医领域的使用是可接受 的，与制剂的其它成分相容且无毒，或与利益风险比合理地相称。“药学上可接受的载体”或 “稀释剂”包括任意且全部的溶剂、分散介质、涂覆层、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延 迟剂等等，它们与包含铁蛋白-铁复合物的组合物的药学给药相容。这样的载体或稀释剂 的实例包括但不限于，水、盐水、Finger’ s溶液和右旋糖溶液。如由医学专业人员所确定 的，药学组合物的体积是基于希望的给药模式和个体患者的安全体积。载体的选择还取决于希望的给药模式。本发明的组合物可以通过任何多种便利的 方式来给药，包括但不限于全身给药(例如，静脉注射、胃肠外注射、吸入、透皮递送、口服 递送、经鼻递送、直肠递送等等)和/或局部给药(例如，直接注射至目标组织中，通过插管 递送至组织中，通过植入随时间释放的材料来递送至目标组织中)、通过泵、口服、胃肠外、 骨、脑脊髓流体等递送进组织中。进一步的给药模式包括面颊、舌下、阴道、皮下、肌肉或皮 下给药。在一个实施方案中，利用适于与铁蛋白-铁复合物组合的用于口服消化的物质来 制备要口服给药的组合物。这样的物质包括但不限于，糖，例如乳糖(含水的且流动快)、葡 萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米粉和土豆粉；纤维素及其衍生物，包括微晶纤维素、羧甲基纤 维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；粉末化的黄蓍胶(tragancanth)；胶体二氧化硅；交联 羧甲基纤维素钠；麦芽；明胶；滑石；硬脂酸；硬脂酸镁；硫酸钙，植物油，例如花生油、棉籽 油、芝麻油、橄榄油和玉米油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；琼脂; 褐藻酸；抗酸剂，例如氢氧化铝或氢氧化镁；缓冲剂，例如柠檬酸钠、乙酸盐或碳酸氢盐； 水；等渗盐水和磷酸缓冲溶液。也可以存在润湿剂；润滑剂，例如十二烷基硫酸钠；稳定剂； 压片剂；抗氧化剂；防腐剂；着色剂和风味剂。适用于胃肠外给药的组合物或制剂包括含水和不含水的等渗无菌注射溶液，其可 以含有抗氧化剂，缓冲液，抑菌剂或使得制剂与血液等渗的溶质；以及可以包括悬浮剂和增稠剂的含水和不含水的无菌悬浮液。组合物可以存在于单位剂量或者多剂量的密封容器 中，例如安瓿和管，并且可以在恰好使用前仅需加入无菌液体载体，例如用于注射的水的冷 冻干燥条件(冻干的)下储存。即用注射溶液和悬浮液可以由无菌粉剂、颗粒或片剂等来 制备。适用于静脉给药的组合物或制剂包括载体，例如生理盐水、抑菌水、CREM0PH0R ELTM(BASF ；Parsippany，N. J.)或者磷酸缓冲盐水(PBS)。组合物必须是无菌的且应当是流 体，以利于用注射器来给药。这样的组合物在制备和储存期间应当是稳定的且必须在防止 微生物，例如细菌和真菌污染的条件下储存。载体可以是分散介质，该分散介质含有，例如 水；多羟基化合物，例如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇；以及其它相容的适合的混合物。各 种抗菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸以及硫柳汞可能包含 微生物污染。等渗剂，例如糖；多元醇，例如甘露醇、山梨醇以及氯化钠可以包含在组合物 中。可以延缓吸收的组合物包括例如单硬脂酸铝和明胶的试剂。制备用来制备无菌注射溶 液的无菌固体的方法包括真空干燥和冷冻干燥，用来产生包含铁蛋白-铁复合物以及任何 其它希望的成分的固体。全身给药可以是例如跨粘膜的或透皮的。对于跨粘膜给药或透皮给药而言，选择 可以渗透目标屏障的渗透剂。跨粘膜的渗透剂包括清洁剂、胆盐和夫西地酸衍生物。鼻腔 喷雾剂或栓剂可以用于跨粘膜给药。对于透皮给药而言，将活性化合物制成油膏、软膏、凝 胶或乳膏。包含铁蛋白-铁复合物的组合物可以用防止复合物从体内迅速消除的载体，例 如控制释放的制剂，包括植入体和微胶囊化的递送系统来制备。可以使用生物可降解的 聚合物或生物可相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚羟基乙酸、胶原、聚原 酸酯和聚乳酸。这样的材料可以从ALZA Corporation (Mountain View, Calif)禾Π NOVA Pharmaceuticals, Inc. (Lake Elsinore, Calif)商购获得，或者由本领域技术人员制备。在适合的液态载体，例如缓冲盐水或生理盐水、脂质体或碱性氨基酸中制备用于 眼部给药的组合物。可以采用适当的基质，例如甘油三酸酯基质、脂质体或碱性氨基酸制备 乳膏、洗剂和油膏，用于局部应用。这样的乳膏、洗剂和油膏还可以含有表面活性剂。在本发明的实施方案中，以表达H-铁蛋白的重组酵母菌株的方式来给予铁蛋 白-铁复合物。适于铁营养补充的重组酵母菌株可以将铁以对于哺乳动物，包括人来讲 高生物活性的形式来储存。酵母菌株包括满足用于人消耗的Generally Regarded As Safe(GRAS)要求的那些。在该实施方案中，铁-储存基因，例如H-铁蛋白编码序列可以置 于铁-储存表达盒中适当的酵母启动子的控制下，以达到用作适当的铁补充载体的酵母所 必需的铁-储存蛋白质水平。适合的启动子为本领域所已知，并且包括诱导高水平构成性 表达的启动子和其表达可以被环境条件调节的启动子。此外，可以进一步调控酵母的基因 构成以实现大量潜在的有益结果。例如，可以调控蛋白质水解来提高铁-储存蛋白质或铁 运送机制的稳定性，包括但不限于细胞表面的那些、液泡或线粒体。此外，可以改变酵母来 提高铁-储存蛋白质或细胞隔室中铁的水平。可以通过向有酵母生长的培养基中加入已知 量的铁化合物来调节酵母的铁含量。利用重组酵母、人或其它动物的铁补充可以通过任何 的许多种方式来完成，包括但不限于，消耗作为营养补充物的重组酵母或消耗从重组酵母 中提纯或分离的铁蛋白-铁复合物。可以出于补铁的目的特异性培养酵母，或者它们可以是另一过程的副产物(例如，发酵)。供选择地或此外，铁蛋白-铁复合物可以包含本领域已知的其它表达体系，例如 大肠杆菌、杆状病毒和转基因动物中生成的H-蛋白质。在一个实施方案中，可以通过在适 当的缓冲液中孵育铁蛋白和铁分子来形成铁蛋白-铁复合物，随后将任何未结合铁分子与 得到的铁蛋白-铁复合物分离。在某些实施方案中，铁蛋白-铁复合物还包含靶向部分，例如抗体、适配子、受体、 配体或它们的结合片段。靶向部分可以识别一种或多种细胞、组织和/或器官特异性标记 物，因此调节或改进向体内希望的靶点或位置的递送。在一个实施方案中，铁蛋白-铁复合 物可以包含含有铁蛋白亚基的融合蛋白，例如与靶向肽融合的H-铁蛋白。在另一个实施方 案中，可以将铁蛋白-铁复合物包封在脂质体、脂质体构建物或其它膜包裹的囊泡，例如红 细胞影中来进行递送或给予。脂质体、脂质体构建物或其它囊泡可以包含靶向部分，例如被 引入到脂质体或载体中的对于特定的细胞表面蛋白质或受体(见上)具有特异性的抗体 或配体。靶向部分可以将铁蛋白-铁复合物或含有铁蛋白-铁复合物的囊泡定向至脑和/ 或血脑屏障。适合的靶向部分的实例包括转铁蛋白、白细胞介素-13 (用于向星形细胞瘤递 送)和脂多糖(LPS)。在本发明的另一个实施方案中，H-铁蛋白自身可以被用于定向至其它部分。例如， H-铁蛋白可以结合至生物活性剂从而将该药剂递送至脑。在一个实施方案中，H-铁蛋白肽 与另一种生物活性肽融合。供选择地或此外，H-铁蛋白可以被接合至脂质体或其它囊泡，以 向脑递送囊泡和囊泡内容物。在又一个实施方案中，H-铁蛋白可以结合至诸如对比增强化 合物的药剂来增强大脑的视觉化(例如，白质束(white matter tracts)和其中的缺陷)。 类似于生物活性剂，对比增强化合物可以结合H-铁蛋白蛋白质或在H-铁蛋白蛋白质中或 被包封在脂质体或其它囊泡中，它们通过具有受体配体作用的接合脂质体的H-铁蛋白来 定向至脑中的H-铁蛋白受体。在本发明的另一个实施方案中，H-铁蛋白可以被用于治疗与铁过量或铁过载有关 的障碍。铁过载，临床上被称为是血色素沉着症，其与例如癌症、心力衰竭、肝功能损伤和糖 尿病的风险增大有关。脑中的铁过载可以造成许多种神经退行性疾病，例如帕金森症、阿尔 茨海默症、肌萎缩性侧索硬化症、Hallervorden-spatz病和亨廷顿氏(Huntington，s)症。 由于H-铁蛋白显著的结合铁的能力，H-铁蛋白和/或含有H-铁蛋白的多亚基复合物可以 被用作铁螯合剂。“多亚基铁蛋白复合物”的意思是包含多铁蛋白亚基和任选的铁的蛋白质 复合物。H-铁蛋白为如上所述的哺乳动物铁蛋白或其同源物或变体。多亚基铁蛋白复合物 可以在相对不含铁的环境中制备，使得得到的复合物具有小于其总量的100%的铁结合能 力。在某些实施方案中，复合物具有50 %或更小的铁结合能力，例如大约50 %、40 %、30 %、 20%、10(%、5(%或1(%的铁结合能力。在一个实施方案中，复合物可以有大约0%的铁结合 能力(即不含铁的铁蛋白或脱铁铁蛋白，具有100%的铁结合能力或保持着接近100%的铁 结合能力)。H-铁蛋白可以被改性来减小其会被任何内生受体识别的可能性或来增加其通 过身体的排泄。这样的改性在本领域从业人员的专业范围内是有益的，并且这些改性不会 影响蛋白质结合铁的能力。适合用作铁螯合剂的多亚基铁蛋白复合物包含H-铁蛋白亚基， 但还可以包含一些L-铁蛋白亚基。在某些实施方案中，相比于L-铁蛋白，多亚基铁蛋白复 合物包含至少20 %的H-铁蛋白，例如相比于L-铁蛋白大约20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70%、80%、90%或 100%的 H-铁蛋白。递送用作铁螯合剂的多亚基铁蛋白复合物可以包括与如在本申请任何其它地方 所描述的用于递送铁蛋白-铁复合物来治疗缺铁性障碍相同范围的递送机制(即靶向部分 和/或脂质体或其它囊泡)。可以将多亚基铁蛋白复合物递送至胃肠道、或沿着胃肠道的细 胞中(在这里所述复合物可以被吸收但不进入到血流中)、或血液本身中，在这里所述复合 物可以有效地与非转铁蛋白竞争以及甚至可能转运结合的铁。利用该方法可以消除铁以不 经调节的方式不合适地进入脑，反之则不可以。此外，来自血液和全身器官的螯合铁可以促 进铁在体内的再分布，包括铁从脑中释放。在一些情况下，低于100%的总铁结合能力的脱 铁铁蛋白物或铁蛋白复合物可以被直接递送进脑脊髓流体中，以刺激铁从脑中的释放。铁蛋白不仅仅具有结合铁的能力，而且还具有结合许多对身体有毒的金属的能 力。因此，本发明的另一个实施方案涉及利用脱铁铁蛋白(或其它具有低于100%总铁结合 能力的多亚基铁蛋白复合物)来大体地减少并且消除来自胃肠系统、血液、脑和身体的潜 在的有毒金属。因此，脱铁铁蛋白能够被用作血液的一般金属清洁剂。在输血中，在输注过程中至少15%的细胞将溶解，释放具有潜在危害的游离铁。对 需要红细胞(RBCs)并且因此是贫血的患者进行输血。本发明涉及用于将脱铁铁蛋白(或者 其它具有低于100%总铁结合能力的多亚基铁蛋白复合物)与输血混合，其不仅仅提供用 于由于细胞溶解而释放的铁的螯合剂，而且能够使得铁以更符合生理条件或生物可利用的 形式来用于身体。需要频繁输血的一类患者群体包括患有地中海贫血(thalessima)的患 者。该群体最终由于过量的铁蓄积而遭受肝损害的痛苦。H-铁蛋白和/或含有H-铁蛋白 的多亚基铁蛋白复合物可以帮助铁更有效地分布在体内，因此限制其在肝中过量的蓄积。 另一类经常接受输血的群体是新生儿，特别是早产儿。提供H-铁蛋白、含有H-铁蛋白的多 亚基铁蛋白复合物、和/或与输血一起提供铁蛋白-铁复合物将改善铁的分布，包括用于脑 发育的铁在脑中分布。包括H-铁蛋白亚基的铁蛋白亚基可以在患者体内表达。在该实施方案中，铁蛋 白-铁复合物可以在体内形成。大量的质粒载体和转染试剂系统可离体转染细胞，以产生 稳定的转化子或者暂时转染的细胞用于再输注到宿主动物或患者中。适合的表达质粒如 转染试剂一样是可商购的，其中后者中的许多为一类或另一类阳离子脂质体。对于体内以 及离体基因转移而言，例如基因疗法，适合的载体是本领域已知的，并且包括逆转录病毒载 体、腺病毒载体、腺相关的病毒载体、慢病毒载体和电穿孔系统。在考虑以下说明性实施例的基础上理解本发明的其它方面和优点。实施例不意在 以任何方式来限制本发明的范围。本领域技术人员考虑本发明公开的内容，应当理解在公 开的具体实施方案中可以作出变化并且仍然获得相像或相似的结果，而不脱离本发明的精 神和范围。本申请所引用的全部参考文献、出版物和专利文献均被引入本文作为参考。通过 在本文中引用各种参照文件，本申请人不承认任何特定的参考文献是他们的发明的“现有 技术”。
实施例实施例1
铁蛋白的制备在本实施例中的所有实验都使用重组人H-铁蛋白或马脾铁蛋白。通过用His标 记的重组人H-铁蛋白质粒转化化学感受态的Br21细胞来制备重组人H-铁蛋白。在细胞 生长之后，用镍蛋白过滤柱将蛋白质纯化至2. 8mg/ml的最终浓度。马脾铁蛋白由商购获得 (Sigma)，并且是经过挑选的，因为其含有的L、H-铁蛋白亚基为大约90 10。细胞培养和单层内皮细胞的制备我们使用牛视网膜细胞(BRECs)作为血脑屏障碍(BBB)的体外模型，是为了检测 铁蛋白可以被转运穿过内皮细胞层的假设，并且开始提出铁蛋白转运穿过BBB的机制。已 经表明该充分研究的模型拥有血液-神经屏障的全部必要特性和属性(Antonetti D. A.等 人，J. Neurochem. 80 :667-677,2002)。从当地的屠宰场获得母牛的眼睛，并且根据以前公 开的方法来分离并处理牛视网膜内皮细胞(BRECs) (Gardiner Τ. Α.等人，Lablnvest. 72 439-444,1995)。BRECs 在添力口 10 % FBSUOng/mL EGF、0. 2mg/mLEND0 GR0 (VEC Techniologies, Inc. , Rensselaer, NY, USA)、0. 09mg/ml 肝素、抗生素 / 抗真菌溶液(Gibco, Rockville，MD，USA)和泰乐菌素抗生素(Sigma)的 MCDB-131 培养基(Sigma, St. Louis,MO, USA)中生长。起初，将细胞在烧瓶中培养直到它们达到至少80%的融合。随后，对BRECSs 进行轻微的胰蛋白酶处理，并在COSTAR TRANSWELL O.4ym的多孔过滤器(Coming， Acton ΜΑ)上生长至融合。将纤维连接蛋白以1 μ g/cm2的浓度加入，以促进贴附到过滤器。 然后清洗细胞并移至不含血清、不含EGF的、添加IOOnm氢化可的松达72小时的MCDB-131 培养基中。向这些细胞培养物中加入氢化可的松有助于形成紧密连接。铁蛋白在BBB模型中的转运购买经预纯化的转铁蛋白，并且将其再悬浮至2. 5mg/ml的最终浓度。将大约 250 μ g的重组人H-铁蛋白、马脾铁蛋白(Sigma)和转铁蛋白在IOOmM碳酸盐/碳酸氢盐缓 冲液(pH 9.0)中用异硫氰酸荧光素(FTIC) (Pierce Biotechnology)标记。通过流过5_ml G-25的脱盐柱来实现对过量或水解的FITC的去除。将接合FITC的H-铁蛋白、脾铁蛋白和 转铁蛋白浓缩，并且在CENTRIPREP 浓缩器(Amicon，Inc. , 10, 000MWC0)中将缓冲液 与PBS交换。被包含的转铁传递蛋白作为BREC模型中的阳性转运对照(Burdo J. R.等人， Neuroscience 121 :883-890,2003) 流动穿过融合的BREC单层的速率根据之前Burdo等人，2003描述的来确定并对 其进行一些修改，其中采用公式(Bf/Tf)*(Vb/A) = (Flux)*t。简言之，在向顶室(顶端) 加入140 μ g FITC标记的H-铁蛋白、脾-铁蛋白或转铁蛋白之前，将BRECs在透孔装置 (transwell apparatus)中生长至融合。通过从在不同时间点(15、30、45、60、120、180和 240分钟)收集的底室(底端)的100 μ 1等分试样取样，随后向顶室加入示踪物来确定示 踪物的转运。然后在荧光分光光度计(SPECTRAMAX GEMINI，MolecularDevices) 中对底室的等分试样进行荧光分析。获得的流速为每单位量的顶室荧光的底室荧光(Bf/ Tf)相对于时间(t)作图的斜率。这里，Bf表示被转运穿过单层的示踪物的量，其相对于底 室的体积(Vb)以及用于转运的表面积(A)进行归一化。顶室中的Tf的浓度在实验进行的 4小时内没有明显的改变，因此认为用于计算时它是恒定的。在转运试验结束时G小时) 从100 μ 1等分试样中得到顶室中的荧光量。作为细胞间流动的对照，将RITC葡聚糖(70kDa)同时加入到顶室作为对照。内皮细胞所吸收的葡聚糖未达到可测量的水平(Raub T. J.等人J.CellPhysiol. 149 :141-151, 1991)。因此，底室中任何葡聚糖的积聚都归因于细胞间的转运。没有条件影响在各个条件 下都是最小值的葡聚糖流速。转运机制的确定为了确定胞饮作用是否显著地有助于铁蛋白的转运，在加入铁蛋白和葡聚糖之 前，将50μ g/ml菲律宾菌素加到透孔装置的顶室保持30分钟。菲律宾菌素的加入可以显 示出胞饮作用抑制非特异性转运活动Gtremmel W等人，Lipids 36 =981-989, 2001) 0为 了确定H-铁蛋白的吸收是否通过依赖网格蛋白的内吞作用来产生，在缺钾的培养基中进 行了研究(100mMNaCl/50mM HEPEQ。在加入铁蛋白之前，将细胞在缺钾的培养基中孵育10 分钟。细胞内缺钾抑制了通过网格蛋白包覆的小窝产生的受体介导内吞作用过程。如通过 葡聚糖转运增加来显示的，在缺钾改变细胞与细胞连接的整体性之前，这些在后的实验仅 可以进行1个小时。各个处理条件(或标准)最少进行6次。贯穿整个实验过程，肉眼评 价培养物以确保实验性处理和操作不影响细胞的活力。如在基线实验中，包含RITC标记的 葡聚糖作为紧实连接整体性的指示剂。利用单向方差分析来分析不同条件下FTIC H-铁蛋 白的均值之间的差异。对于具有明显不同的均值的那些测量值而言，进行Bonferroni post hoc对比来分析成对的差异。显著水平被设定为ρ < 0. 05。结合实验饱和度分析利用125I-重组人H-铁蛋白或马脾铁蛋白以第四通道的BREC细 胞来进行BREC细胞同源物的结合实验，每个实验进行两次。两者的特异性活性均为 340,000cpm/pmoL·为了确定总的、特异性和非特异性结合，在存在或不存在摩尔数过量 1000倍的未标记H-铁蛋白的情况下，将一定范围浓度的125I-H-铁蛋白加入到IOOyg BREC 细胞同源物总蛋白中。结合的缓冲液由50mM Tris-HCKpH 7. 4)、0. 1 % BSA组成。在22°C 下孵育2小时。通过加入3ml冰冻的50mM Tris-HCl来终止结合。利用细胞收集器，通过 在Whatman玻璃纤维C过滤器上迅速地过滤和冲洗来分离被结合的放射性，该过滤器之前 用5%的脱脂奶粉和0. lmg/ml马脾铁蛋白包被。进行平衡竞争性结合试验，其中将高浓度的未标记的H-铁蛋白用25μ g的BREC 同源物蛋白和0.4nM 125I-H-铁蛋白在与上述相同的结合缓冲液中在22°C下孵育120分钟。 结合的终止、膜的分离和特异性结合的计算都如上所述地进行。大鼠脑的微血管微血管的制备将6只成年大鼠用于制备各个微血管。用致命剂量的戊巴比妥钠 (100mg/kg体重)来麻醉大鼠，然后将其斩首。将大脑摘除并置于冰上的培养皿中。将小脑 和脑膜除去并将5倍体积的微血管缓冲液(IX MVB-IX盐，IX HEPES, 0. 5% BSA和5mM葡萄 糖)同蛋白酶抑制剂一起加入。利用玻璃-聚四氟乙烯均质器(0.25mm间隙)以20次击 打将脑与在4°C下以1000XG离心10分钟的同源物轻柔地混合。弃去上清液并在针对每 只大鼠5倍体积的17%葡聚糖(IX盐和IX HEPES，与葡聚糖的比率为1 1)中再悬浮团 块，随后进行涡流，并在4°C下以3000XG离心。从管壁上收集微血管并在20ml的IX MVB 缓冲液中再悬浮。通过120μ网过滤微血管。然后，通过粘附在40μ网上承载的玻璃珠 (Sigma)来进一步将制备的微血管纯化。用加入蛋白酶抑制剂的缓冲液来洗涤珠。将珠在 5mlMVB中清洗，然后通过在4°C下以1000XG离心15分钟来将微血管团聚。将微血管在Iml HES+(IOmM HEPES, ImM EDTA，250mM 蔗糖，pH 7. 4 和蛋白酶抑制剂混合物)(Sigma)中 再悬浮，并且确定总蛋白浓度。将样品在-80°C下保存直到使用。结合悬浮液由50mM Tris-HCl (pH 7. 4),0. 1 % BSA和20 μ g膜蛋白制剂组成，该膜 蛋白制剂加入或不加入最终体积为250 μ 1的1 μ M未标记的H-铁蛋白。通过加入3ml冰 冻的50mM Tris-HCl来终止结合。通过在Whatman玻璃纤维C过滤器上的迅速过滤来分离 结合的放射性，该过滤器之前用5%脱脂奶粉(Blotto)和0. lmg/ml脾铁蛋白包被。凭经 验地确定该组合将辐射标记的蛋白质与过滤器的非特异性结合减少至加入总量的1_3%。 利用含有200mM NaCl的冰冻的3ml 50mMTris洗涤5次。在MICR0MEDIC 4/200中以自动 Y-计数器来对过滤器计数。通过不存在过量未标记的H-铁蛋白时的结合(总结合)来减 去存在过量未标记的H-铁蛋白时的结合(非特异性结合)来计算出特异性结合。饱和度分析各个结合实验都进行两遍。将高浓度的125I-H-铁蛋白加到结合悬浮液，该结合悬 浮液由与之前描述相同的结合缓冲液和20 μ g膜蛋白质制剂组成，该膜蛋白质制剂加入或 不加入最终体积为250 μ 1的1 μ M未标记的H-铁蛋白。在22°C下孵育120分钟之后，终止 结合，并且如之前所述计算总的结合、非特异性结合和特异性结合。竞争试验在与之前描述相同的结合缓冲液中存在0. 4nM 125I-H-铁蛋白的情况下，将高浓度 的未标记的竞争剂(H-铁蛋白和脾铁蛋白)与IOOyg膜蛋白在22°C下孵育60分钟。结 合、终止结合、膜分离和特异性结合的计算均如上所述进行。将竞争试验进行两遍。体内吸收研究将H-铁蛋白和脾铁蛋白(1. 2mg)在40 μ 1 ImM的氨基三乙酸 (nitriolotriacetic acid) (pH 6. 0)，0. 5 μ 1 硫酸亚铁铵，2 μ 1 0. 5Μ 碳酸氢钠、和 40 μ C 59FeCl中在37°C下孵育4小时。在孵育后，将铁蛋白在置于IXPBS中的10，000丽滤筒 (cartridge)中透析，以去除任何未结合的59Fe。H-铁蛋白的特异性活性为0. 04μ C/g，而 脾铁蛋白的特异性活性为0.08yC/g。将放射性标记的蛋白质(3. 4μ g/g重量)注射到雌 性Sprague-Dawley大鼠( 350g)的尾静脉中(n = 3)。在48小时后，将大鼠斩首并立即 将器官摘除。将各个器官切开并在0. IM PBS中清洗。对于脑而言，将大脑与小脑分开并将 其一分为二，并且将脑膜与脑彻底分离。Ig各个器官的组织(湿重量)被用于确定铁的吸 收。H-铁蛋白缺失的小鼠被作为实验模型进行评价，来确定器官中潜在的受损害的铁 调控是否可以影响铁蛋白的铁递送。使用相似的方法来研究对照和H-铁蛋白缺失的小鼠 中的铁蛋白吸收，方法如上文所述的用于大鼠的方法，除了小鼠经腹膜内注射。H-铁蛋白的 特异性活性为0. 06 μ C/g，而脾铁蛋白的特异性活性为0. 31 μ C/g。注射铁蛋白并使其在血 流中循环48小时，直到将小鼠处死并将其器官摘除。以基于碘化钠(NaI)的单通道分析器孔计数器系统运行1分钟来确定各个器官中 放射性的量。从Y计数/分钟(cpm)中减去背景数，除以计数效率，然后再除以每分钟的 衰变数来计算μ C。为了计算％总量，器官的μ C除以注射μ C总量，然后再乘以100%。铁蛋白体内吸收通过将含有放射性标记的59Fe的H-铁蛋白或脾铁蛋白注射到 成年大鼠的尾静脉中，来确定不同的大鼠器官可以吸收结合到铁蛋白的铁的可能性。在脑、心脏、肾、肌肉和肺中，来自H-铁蛋白的铁吸收明显高于来自脾铁蛋白的铁吸收(图1A)。 当59Fe呈现出与H-铁蛋白结合时，与其与脾铁蛋白在一起时相比，脑中的59Fe的量要高出 2倍(ρ < 0. 005)(图1B)。只有在肝中，来自脾铁蛋白的铁吸收比来自H-铁蛋白的铁吸收 高(P < 0. 05)。为了确定在各种器官中铁储存能力的潜在变化对H-铁蛋白和脾铁蛋白向各 个器官递送铁的影响，我们研究了在H-铁蛋白缺失的小鼠系中来自这些蛋白的raI^吸 收(Thompson K. J.，Fried Μ. G，Zhang Y.，Boyer P.，Conner J. R. J. CellSci. 115 2165-2177, 2002) 0相比于同窝出生的对照，H-铁蛋白受损害的小鼠的脾、肺和肌肉中由 H-铁蛋白递送的铁减少(P < 0. 05)(图2A)。在脑中也观察到相似的现象(图2B)。在铁 储存受损害的小鼠的任何器官中，脾蛋白的吸收都无变化(图3A和3B)。铁蛋白的转运虽然血清铁蛋白能够不受限制地通过全身器官而有效地向脑递送 铁，但是它将不得不穿过内皮细胞屏障(BBB)。为了开始研究铁蛋白转胞吞作用是可能的的 可能性，我们采用了 BBB的细胞培养物模型。H-铁蛋白而非脾铁蛋白以显著的量转运穿过 BREC细胞单层(图4)。FITC标记的H-铁蛋白转运穿过BREC单层的速率是RITC标记的葡 聚糖的5倍(ρ <0.001)。脾铁蛋白的转运速率与在葡聚糖对照中所见的水平相似。为了 确定H-铁蛋白被转胞吞的机制，我们在不含钾的培养基中进行转运试验来阻止网格蛋白 包覆的囊泡形成。未形成网格蛋白包覆与H-铁蛋白运送速率降低80%有关(ρ <0.001)。 相反地，菲律宾菌素对BRECs的预处理阻止了胞饮作用，未造成速率的显著降低。葡聚糖的 对照样品被包含在各个实验条件中，并且根据未处理条件下的图中的显示，速率没有变化 (数据未显示)。包含转铁蛋白转运作为阳性对照并且如以前的报道来检测(Burdo J.R.， Antonetti D. A. ,Wolpert Ε. B. , Connor J. R. Neuroscience 121 :883_890，2003) 。 - +示 记的转铁蛋白和铁蛋白的特异性活性是不同的，因此不能得出关于这两种蛋白质相对转运 速率的结论。铁蛋白结合分析为了更彻底地评价脑通过铁蛋白来递送铁的机制，进行结合研 究来确定BREC模型中铁蛋白的运送是否是受体调节的。此外，为了扩展对结合到体内系统 的铁蛋白的评价，将微血管从大鼠脑中分离(RBMVs)。利用饱和度实验和竞争性实验来实施 铁蛋白对 BREC 和 RBMV 的结合。利用 GRAPHPAD PRISM 4. 0 (GraphPad Software, Inc) 的非线性回归来从两种方法中得到Kd和Bmax值。饱和度曲线将各种浓度(1、2、3、5、7和IOnM)的125I标记的铁蛋白(rH_铁蛋白 或脾铁蛋白)与100 μ g组织(BRECs或RBMVs) —起孵育。通过在Whatmarm过滤器上进行 试验来获得结合的总量和非特异性结合(在IOOOnM未标记的铁蛋白的存在下)。为了从这 样的结合试验中获得Kd和Bmax，对单一位点的结合进行非线性整体回归。在该方法中，将结 合的总量和非特异性结合相对于标记的铁蛋白的浓度来制图。得到的图与公式非特异性 =NS*X和总量=特异性+非特异性相拟合，其中特异性=Bmax*X/(Kd+X))。在整体法中， 特异性结合并不来自结合总量和非特异性结合的数据。相反地，Kd和Bmax值是通过在两种 数据集(总量和非特异性)之间分配(sharing)非特异性结合常数(赂)来获得的。该回归 分析得到的数据显示在图5A和5B中。只有rH-铁蛋白与BRECs或RBMVs的结合都是明显 饱和。RBMVs 的 Kd 和 Bmax 分别为 7. 9士 1. 6nM 和 572. 6士64. 0fmol/mg 蛋白质。对于 BRECs 而言，Kd 为 2. 7士0. 9nM，而 Bmax 为 465. 7士63. lfmol/mg 蛋白质。对于 BRECs 和 RBMVs 而言，曲线拟合度的R2值>0.8。竞争曲线各种浓度的冷铁蛋白(0.03,0. 1,0. 3,1. 3、10、30、100、300 和 IOOOnM) 与IOOyg BRECs或RBMV组织以及0.4nM的放射性标记的铁蛋白一起孵育。通过在 Whatmarm过滤器上进行试验来获得结合总量。然后将结合总量(fmol/mg蛋白质)相对 于log[浓度(nM)]来作图。然后将这些图与单一位点竞争公式总量=底室+(顶室-底 室)/(1+10 (X-LogEC5tl))相拟合。该数据显示在图6A和6B中。结果显示了 H-铁蛋白可以 有效地竞争结合位点，而脾铁蛋白不可以。从BRECs的竞争曲线确定Kd和Bmax，得到的Kd为 2. OnM 且 Bmax 为 235. lfmol/mg 蛋白质。RBMVs 相应的值为 Kd = 3. 4nM 且 Bmax = 304. 6fmol/ mg蛋白质。对于BRECs和RBMVs而言，曲线拟合度的R2值>0.95。通过两条不同曲线产 生的值都在可接受的范围内。讨论该研究的结果揭示了铁蛋白可以将铁递送到多种器官，包括脑。此外，对大 多数器官，除了肝以外，当通过H-铁蛋白而不通过L-铁蛋白递送铁时，通过铁蛋白递送的 铁的量增大。当铁的储存能力受损时，会改变由细胞吸收的H-铁蛋白铁的量；如在H-铁蛋 白缺失的小鼠中所证实的，由L-铁蛋白来递送铁在该模型中不受明显的影响。这些在后的 结果表明了 H-铁蛋白的反馈系统。因此，我们已识别了向脑递送铁的新的转运系统，与转 铁蛋白相比(最大值为2个!^e原子)，该系统可以被给予非常高量的铁(最高达4500个 狗原子)，所述铁可以被装载在单个铁蛋白分子中。非转铁蛋白依赖性的向脑递送铁的系 统的识别与我们之前的报道相一致，该报道显示在不存在血清转铁蛋白的情况下铁向脑递 送(Malecki E. A. ,Devenyi A. G. ,Beard J· L ,Connor J.R.J Neurosci Res· 56 113-122，
1999)。该研究还促进了对铁蛋白受体存在的继续探索。虽然该模型和脑中的饱和度未能 证明(Hulet S. W. , Heyliger S. 0. , Powers S. , Connor J. R. J. Neurosci Res. 61 :52-60,
2000)，但是已有报道证实了肝细胞上的铁蛋白受体(MackU.等人，JBiol. Chem 258 4672-4675,1983)。近来，一种蛋白已被鉴别为推定的铁蛋白受体(Chen Τ. Τ.等人.J Exp Med. 202 :955-65,2005)。在脑中，除了结合到受体之外，铁蛋白必须经转胞吞作用来穿过BBB。在该研究中， 我们证实了铁蛋白可以转运穿过BBB的细胞培养物模型。在该细胞培养物模型中，铁蛋白 的转运是依赖网格蛋白的并经受体介导，并且偏好H-亚基。优选进行H-铁蛋白结合是与 转运数据相一致的。在大鼠脑的微血管上也证实了铁蛋白的结合，并且这种结合类似于细 胞培养物模型，也很偏好H-亚基。结合和转运数据与吸收铁的数据相一致，所述吸收铁的 数据揭示了如果相对于脾(富含L)铁蛋白，铁与H-铁蛋白相结合，向脑的递送增加。铁蛋 白的吸收、H-铁蛋白与L-铁蛋白之间在铁递送上的差异和在H-铁蛋白受损的小鼠的H-铁 蛋白吸收的变化都显示了铁蛋白受体的可能性，并且以两种不同的内皮细胞源直接证实了 H-铁蛋白的结合。显示铁蛋白被转运穿过BBB是依赖于网格蛋白而不是通过胞饮作用的数据，与 之前利用相同的转铁蛋白系统识别的数据类似(Burdo J.R.，Antonetti D. A.，Wolpert Ε. B. , Connor J. R. Mechanisms and regulation oftransferrin and iron transport in a model blood-brain barrier system. Neurosci. 121 :883-890, 2003)。向脑递送铁的 机制和对这些机制的调节对于理解铁如何积累或者不能达到正常水平，并因此引起或促进 许多神经障碍而言是很重要的(kcca L, Youdim MB, Riederer P. Connor JR, CrichtonRR. NatRev Neurosci. 5 :863_873，2004)。对结合到转铁蛋白的铁的转胞吞作用的研究提 供了矛盾的结果。一些研究显示进入到脑的铁结合到转铁蛋白，而其它研究显示铁转运与 转铁蛋白无关。我们已提供的证据表明存在向脑递送铁的转铁蛋白依赖性系统和非转铁 蛋白依赖性系统，以及相比一种途径优先选择另一种途径看起来是依赖于内皮细胞的铁含 量的。在脑吸收铁的机制的研究中，形成BBB的内皮细胞的铁含量以及该铁含量如何影响 用于转铁蛋白介导的铁吸收的转铁蛋白受体的调节被大大忽视了(参见Burdo和Connor 2003的综述)。由细胞的细胞内铁含量来调节细胞转铁蛋白受体的表达是公知的(Aisen P.等人，Int J Biochem Cell Biol. 33 :940_959，2001)，并且内皮细胞具有与其它细胞相 同的转铁蛋白受体的铁调节机制(GeorgieffM. K.等人，J Pediatr. 141 =405-9, 2002) 脑 的内皮细胞还表达二价金属转运蛋白，其功能是介导细胞中内涵体的铁释放，并且含有显 示铁储存存在的相对高含量的铁蛋白。脑内皮细胞具有其自身相当高的铁需求并且调节其 自身的铁吸收的观点与在这些细胞中高浓度的线粒体以及因此铁需求高相一致。因此，至 少一些通过转铁蛋白递送至这些细胞的铁应当被保留在内皮细胞中。铁从铁蛋白释放的机 制并未充分了解，并且一些人已提出需要降解铁蛋白来释放铁。因此，具有高铁含量的铁蛋 白更可能完整地被转胞吞，并且相比于转铁蛋白不太可能与内皮细胞来分享它的铁。调节 向脑递送铁蛋白的机制在此时还是未知的，在H-铁蛋白缺失的小鼠中H-铁蛋白递送的铁 的减少显著地表明这样的调节机制的存在。虽然已经充分地确定了铁蛋白作为铁储存蛋白的作用，但是H-铁蛋白可以由细 胞主动分泌并且可能递送铁的概念在之前并未被研究。血液中铁蛋白含量甚至在正常条件 下都大幅波动。铁蛋白mRNA结合到多核糖体，所述多核糖体结合到大鼠肝细胞的内质网， 所述内质网会支持铁蛋白的分泌途径。铁蛋白的直接分泌(两种亚基)已在分化的大鼠肝 细胞瘤细胞中被证实，并且已经显示出培养物中的小胶质细胞释放H-铁蛋白而非L-铁蛋 白(Zhang X. ，Surguladze N. ，Slagle-Webb B. ，Cozzi A. ，Connor J. R. Glia54 :795-804, 2006)。BBB和其它器官上的受体的铁蛋白来源假设来自于血清。充分明确了血清中存在 铁蛋白，但传统上血清铁蛋白被认为是主要由L-亚基构成。该富含L的血清铁蛋白来源主 要来自溶解的巨噬细胞(McGowan S. E.等人，J. Lab Clin. Med. 111 :611_617，1988)。然而， 我们令人惊奇地表明了铁蛋白的结合、铁蛋白的转运和铁向脑的递送都强烈地偏好富含H 的铁蛋白。因此，我们发现是基于血清中H-铁蛋白的量相对少，该发现的生理学意义在于 表明了铁蛋白可以作为继转铁蛋白之后脑的铁来源。然而，必须记住的是，相比1摩尔转铁 蛋白，1摩尔铁蛋白可以递送2000多倍的铁。此外，存在血浆中H-铁蛋白升高的病症，例如炎症和与一些癌症相关的病症 (Elliott R.L.等人，Breast Cancer Res. Treat. 30 :305-309,1994) 因此，慢性炎症病症 可以增加脑的铁含量，该观点与大量神经退行性疾病包括阿尔茨海默症和帕金森症中的铁 蓄积现象相吻合。实施例2引言我们开发了新的饮食方法来缓解缺铁。该方法基于我们在体内，包括脑中H-铁蛋 白受体的发现，以及对相对于富含L的铁蛋白，H-铁蛋白是将铁吸收进入除了肝之外的所有器官的优选方式的证实。其他人已经表明H-铁蛋白在母奶中含量丰富，这表明该蛋白是 母体和婴儿之间递送铁的机制。该在后的阐述对于所有哺乳动物，不仅仅是人而言都是潜 在真实的。此外，H-铁蛋白基因序列和蛋白结构在动物界是高度保守的。因此，H-铁蛋白 作为递送铁的蛋白质的用途不应仅限于人。我们已经设计出利用酵母递送作为饮食补充剂的H-铁蛋白的方法。为了启动该 方法，最初的研究是转化酵母来表达人H-铁蛋白基因，所述基因可以被翻译成H-铁蛋白的 蛋白。图7中所示的免疫印迹表明酵母表达了 H-铁蛋白并且不存在与L-铁蛋白的交叉反 应。其次的研究是证实强化培养基使得酵母在培养基中与硫酸亚铁一起生长，这样将提高 它们表达的铁蛋白中的铁含量。这些结果显示在表8中。进食研究为了测试经铁蛋白强化的酵母作为治疗缺铁的模型的效果，我们使用标准缺铁大 鼠模型。由缺铁母鼠喂养大鼠幼仔直到在25日龄时断奶。在断奶时，将动物分配至5组中 的一组。组1 维持缺铁性(ID)饮食。组2:饲喂35mg/kg FeSO4的标准补铁饮食。组3: 饲喂含有未补充铁的酵母(无1 的酵母)的饮食。组4:用包含已补充铁但未用H-铁蛋 白强化的酵母(无Ft的酵母)的饮食来饲喂。组5:已用H-铁蛋白转化并补充铁的酵母 O^e+Ft酵母)。在断奶后的第3、7、9和14天从这些动物收集血液样品。结果显示在图9 中。持续食用ID饮食的动物具有最低水平的血色素(Hb)。摄取无铁酵母的动物具有与ID 动物相似的Hb水平。在其它3组中可以看到Hb含量的改善，其中最迅速的改善发生在摄 取补铁且用铁蛋白强化的酵母的动物中。甚至是摄取补铁而无铁蛋白的酵母的动物的Hb 含量改善要比!^SO4组更高。还监视在相同的动物组中的血细胞比容水平。这些数据显示在图10中。这些数 据显示作为铁载体的酵母在H-铁蛋白存在或不存在的情况下对于纠正血细胞比容同样有 效，并且两者均明显地优于现有的标准治疗选择-FeSCV持续摄取ID饮食的动物和摄取未 补铁酵母的动物在测试的11天中未显示出血细胞比容的增长。转铁蛋白的饱和度水平是重要的分析，其显示身体的铁动员能力，可能间接地显 示铁的生物利用度水平。转铁蛋白是主要的铁动员蛋白，并且以高浓度存在于血清中。转 铁蛋白饱和度的量从正常的高达30%波动到贫血病症时的低于10%。动物模型的转铁蛋 白饱和度分析显示在图11中，它被我们用来评价铁蛋白强化的富含铁的酵母的效力。在该 图中，可以看出铁蛋白强化的富含铁的酵母导致转铁蛋白饱和度的最大增高，其次是不含 铁蛋白但富含铁的酵母。该研究再次证实了在饮食中，酵母相比!^SO4作为递送铁的载体 的优越性。持续摄取ID饮食的动物或用对照酵母(不含铁或富含铁蛋白)饲喂的动物具 有最低的Tf饱和度。对脑中铁的作用由于缺铁对脑发育具有重大的影响，因此监视摄取不同饮食的动物的特定脑区域 的铁含量。在图12中，显示了脑的两个重要发育区域，中脑腹侧和尾部的铁含量。这些区 域注定将成为成熟动物，例如人中相对富含铁的区域。这些脑区域涉及运动活性的调节；因 此特别是在发育过程中发生缺铁时，缺铁造成运动技能的损害。与Hb和Hct分析中描述的 相同的动物在14日龄时处死，检测中脑腹侧和尾部中铁的浓度。摄取已由铁蛋白强化且补 铁的酵母的动物的这两个脑区域中比其它任何组都具有更多的铁。这令人兴奋的新发现表明铁蛋白强化的饮食补充可以成为限制与缺铁有关的神经缺陷的途径。该项观察资料不仅 提高了公共健康而且优化了神经功能，其对于对抗整体缺铁的行动产生了重大影响。为了进一步评价脑中铁含量的区域性变化，对另外两个脑区域一伏隔核(Necleus accubens，NA)和前额皮质(prefrontal cortex,PFC)进行研究。这些结果显示在图13中。 在该图中，由铁蛋白强化的补铁酵母递送的铁的区域特异性是明显的。在NA中，类似于图5 中的VMB和尾部，铁含量相对于铁运送的其它模式是升高的。然而，在PFC中，由铁蛋白强 化的补铁的酵母递送的铁与在其它组中的发现相似。这些数据表明存在一种机制，该机制 以一种不同于其它铁递送系统的方式来调节由铁蛋白强化的补铁酵母的铁递送，并且与我 们的脑微血管上的H-铁蛋白受体的发现相一致。总结脑对铁吸收的增加以及可能更重要的吸收特异性是意料不到的，是与本发明相关 的重大发现。这些数据显示利用铁蛋白强化的补铁酵母应当使出生后发育期间与缺铁有关 的神经、认知、行为缺陷改善。血液学参数的数据无疑是有力的，显示了铁蛋白强化的补铁 酵母是通过饮食补铁的优良模型。
权利要求
1.一种用于治疗患者缺铁性障碍的方法，该方法包括向有此需要的患者给予治疗有效 量的铁蛋白-铁复合物。
2.权利要求1所述的方法，其中所述铁蛋白-铁复合物包含H-铁蛋白。
3.权利要求2所述的方法，其中所述H-铁蛋白为哺乳动物H-铁蛋白。
4.权利要求3所述的方法，其中所述哺乳动物H-铁蛋白为人H-铁蛋白或其同源物。
5.权利要求4所述的方法，其中所述同源物具有与人H-铁蛋白至少90%的序列同一性。
6.权利要求2所述的方法，其中所述H-铁蛋白为重组H-铁蛋白。
7.权利要求6所述的方法，其中所述重组H-铁蛋白由酵母产生。
8.权利要求1所述的方法，其中所述缺铁性障碍与脑中缺铁有关。
9.权利要求8所述的方法，其中所述缺铁性障碍为神经障碍和/或神经退行性障碍。
10.权利要求8所述的方法，其中所述缺铁性障碍选自帕金森症、阿尔茨海默症、不宁 腿综合征、注意力缺陷障碍、抑郁症和失眠。
11.权利要求8所述的方法，其中所述缺铁性障碍包括出生后的发育期间与缺铁有关 的神经、认知、行为和/或运动缺陷。
12.权利要求1所述的方法，其中所述铁蛋白-铁复合物还包含靶向部分。
13.权利要求12所述的方法，其中所述靶向部分选自抗体、适配子、受体、配体和它们 的结合片断。
14.权利要求12所述的方法，其中所述靶向部分识别脑和/或血脑屏障的特异性标记物。
15.一种向脑递送铁的方法，所述方法包括向患者给予铁蛋白-铁复合物，从而使所述 铁被转运穿过血脑屏障并且被递送至脑。
16.一种将H-铁蛋白用作靶向部分的方法，所述方法包括将H-铁蛋白连接至脂质体， 从而使所述脂质体以脑和/或脑中的细胞为靶点。
17.一种治疗患者铁过载障碍的方法，所述方法包括向有此需要的患者给予治疗有效 量的多亚基铁蛋白复合物。
18.权利要求17所述的方法，其中所述多亚基铁蛋白复合物具有小于100%的铁结合 能力。
19.权利要求17所述的方法，其中所述多亚基铁蛋白复合物包含哺乳动物H-铁蛋白或 其同源物。
全文摘要
大鼠脑微血管中的内皮细胞上的H-铁蛋白受体是用于将铁跨血脑屏障转运的手段。治疗患者脑中的缺铁性障碍的方法包括向有需要的患者给予治疗有效量的H-铁蛋白-铁复合物。利用H-铁蛋白作为靶向部分的方法包括将H-铁蛋白与脂质体连接，该脂质体以脑或脑中细胞为靶点。治疗患者铁过载障碍的方法包括向患者给予具有小于100％铁结合能力的多亚基铁蛋白复合物。
文档编号A61K38/40GK102065686SQ200880129474
公开日2011年5月18日 申请日期2008年3月28日 优先权日2008年3月28日
发明者J·R·康纳, R·L·凯尔 申请人:西纳有限责任公司