专利名称：虾夷扇贝铁蛋白基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于水产动物抗病基因筛选技术领域，具体涉及一种虾夷扇贝铁蛋白基因及其应用。
背景技术：
研究表明铁蛋白是一种重要的免疫蛋白，在维持胞内铁离子平衡和先天免疫系统中起着重要作用。铁蛋白参与了海洋无脊椎动物的诸多重要生理过程，在炎症反应、铁离子吸收、去氧化解毒等方面均有重要作用。比如，海湾扇贝经鳗弧菌胁迫后，其体内铁蛋白水平有了明显提高；同样，太平洋白对虾经过白斑病毒感染后，铁蛋白基因也明显上调表达。此外，经金属离子及高温胁迫处理后，血蛤的铁蛋白也明显提高，以上研究表明铁蛋白在海洋无脊椎动物的先天免疫中起了重要作用。因此，筛选不同物种的铁蛋白，从而更准确的检 测海水养殖物种的免疫系统具有重要的作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种虾夷扇贝铁蛋白基因及其应用，为贝类育种中病害防治提供技术手段，从而弥补现有技术的不足。本发明的虾夷扇贝铁蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO :1。上述虾夷扇贝铁蛋白基因的核苷酸序列为SEQ ID NO :2。本发明还涉及用于表达上述的虾夷扇贝铁蛋白基因的重组载体。本发明的虾夷扇贝铁蛋白用于制备抗菌剂。本发明克隆了虾夷扇贝铁蛋白基因，并对其体外重组表达产物进行了铁氧化和抑菌活性分析。研究表明本发明的虾夷扇贝铁蛋白不仅具有螯合铁的功能，而且具有抑菌活性，能够抑制贝类重要致病性细菌的生长。因此，虾夷扇贝铁蛋白在病害防治中具有良好的应用潜能。
图I :本发明的ife下夷扇贝铁蛋白基因的序列分析图；其中长方形方框中的为铁反应元件IRE ;实下划线aataaa为加尾信号；虚下划线为A + U不稳定元件；图2 :本发明的虾夷扇贝铁蛋白的立体结构图；图3 :本发明的虾夷扇贝铁蛋白重组表达后的电泳图；图4 :本发明的虾夷扇贝铁蛋白的铁氧化活性检测图；图5 :本发明的虾夷扇贝铁蛋白的抗菌活性图。
具体实施例方式下面通过实施例对本发明做进一步说明。
实施例I :虾夷扇贝铁蛋白基因的分离及性质分析本发明中的虾夷扇贝铁蛋白基因的cDNA序列克隆包括下列步骤a)虾夷扇贝总RNA提取；b)虾夷扇贝5’ RACE和3’ RACE文库构建；
c)虾夷扇贝铁蛋白cDNA全长序列的获得；d)目的基因的生物信息学分析。具体操作如下a)虾夷扇贝总RNA的提取按照trizol提取方法从虾夷扇贝肝胰腺中提取总RNA。b)奸夷扇贝 RACE文库构建利用 Clontech公司 SMART RACE cDNA AmplificationKit 构建 5’ RACE 和 3’ RACE 文库。c)虾夷扇贝铁蛋白cDNA全长序列的获得根据虾夷扇贝转录组文库中铁蛋白的部分序列信息，设计目的基因RACE引物，3’ RACE引物5’ -ATGTTGAAACCGAGGCTGGAATCAACCG-3，和 5，RACE 引物:5，-GCATGTTCACGCTCTTCGTCAGACTTGGT-3’。分别利用 3，RACE 引物和 5’ RACE 引物与接头引物 NUP (5’ - AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT - 3’ )进行 3’ 末端和 5’末端的扩增。PCR产物用I. 2%琼脂糖凝胶电泳进行检测，用胶回收试剂盒(上海生工)进行PCR产物纯化，再与pMD18-T载体(大连宝生物工程有限公司)连接，参照《分子克隆第三版》(黄培堂译，科学出版社，2002年)的方法转化大肠杆菌DH5 α。菌落PCR检测后，挑取阳性克隆进行测序，两端序列拼接后得到cDNA全长序列，为SEQ ID NO :2，其编码的蛋白序列为SEQ ID NO 2ο其中3’和5’末端扩增的条件如下50 μι反应体系
Si(Si)-RACE-ReadycDNA2.5μΙ
IOxAdvantage 2 PCR buffer5.0μΙ
IOmM dNTP MixΙ.ΟμΙ
IOxUPM5.0μΙ
2μΜ 5'(3')RACE 引物5.0μΙ
50xAdvantage 2 Polymerase Mix Ι.ΟμΙ PCR-Grade Water30.5μΙ扩增所用PCR反应程序94°C预变性5min ;94°C变性30sec，72°C 3min，5个循环；94°C变性 30sec，70°C退火 30sec，72°C延伸 3min，5 个循环；94°C变性 30sec，65°C退火30sec, 72°C延伸 3min, 28 个循环；72°C延伸 IOmin0对筛选出的虾夷贝铁蛋白基因进行分析表明基因序列全长920 bp，包括516 bp的开放阅读框，117 bp的5’非编码区和287 bp的3’非编码区，在3’非编码区有一个加尾信号，5’非编码区有一个铁反应元件IRE (图I)。该基因编码171个氨基酸，分子量为21.921^)，等电点为5.52。生物信息学分析显示，该序列有铁蛋白典型的二级结构特征(图2):四个长α螺旋，一个短α螺旋和一个长茎环；存在铁氧化活性中心(Ε25，Υ32, Ε59,Ε60, Η63, Ε105, Q139)和铁离子矿化中心(D58, Ε59, Ε62)，属于M型铁蛋白。实施例2 :本发明的虾夷扇贝铁蛋白基因的重组表达本发明中的体外重组铁蛋白制备及活性分析包括下列步骤a)重组铁蛋白表达质粒的构建；
b)重组铁蛋白的表达；c)重组铁蛋白的纯化；d)铁蛋白的活性分析。具体操作如下a)重组铁蛋白表达质粒的构建根据SEQ ID NO 2的cDNA序列，结合表达载体的多克隆位点，设计引物，其中正向引物的序列为5 ’ -CCACATATGACTGAAAGTCAACCTCGC-3，反向引物的序列为5’- GGGAAGCTTAGTCCAGGGATTTCTTGTCG -3’。以虾夷扇贝肝胰腺cDNA为模板，进行蛋白编码区PCR扩增，20 μ I反应体系包含
灭菌双蒸水10.2 μΙ
10 X PCR Buffer2 μΙ
dNTPs (2.5 mM)1.6 μΙ
MgCI2 (25 mM)1.6 μΙ
正向引物(2μΜ)2μΙ
反向引物(2 μΜ)2μΙ
cDNA 模板0.5 μΙ
ExTaq 酶(5 U/μΙ) 0.1 μΙ按下列程序进行PCR 扩增，95°C变性 5 min ；94°C 30 s, 62. 8°C 30 s，72°C 2min，共35个循环；72°C延伸10 min。采用胶回收试剂盒(上海生工)进行PCR产物纯化，纯化后的PCR产物与pMD18-T载体(大连宝生物工程有限公司)连接，参照《分子克隆第三版》(黄培堂译，科学出版社，2002年)的方法转化大肠杆菌DH5a，挑选克隆进行菌落PCR检测，而后挑取阳性克隆进行序列测定。培养含有目的重组质粒的克隆，提取质粒，用NdeI和Hind III于37°C完全酶切后，按照《分子克隆第三版》的方法将其连接到pET28a表达载体中，转化大肠杆菌BL21 (DE3)，经测序确认表达框与SEQ ID NO. 2的序列一致。b)重组铁蛋白的表达挑取含有目的重组质粒的阳性克隆，接种于含卡那霉素的LB液体培养基中，37°C 200 rpm振荡培养过夜，作为种子菌。取种子菌按I :100体积比接种于新鲜的含卡那霉素的LB培养基中，37°C 200rpm振荡培养；培养至0D600约为O. 5时，在4°C静置Ih后，加入异丙基硫代_β -D-半乳糖苷(Isopropyl-β -D-thiogalactopyr,IPTG)至终浓度I mmol/L, 15°C诱导表达10h。4°C 5000 rpm离心10 min,收集菌体。c)重组铁蛋白的纯化用预冷的PBS缓冲液重悬菌体。采用超声波细胞粉碎仪以320 W的功率在冰水浴下超声(总共7min ;工作5s停IOs)破碎细菌细胞，4°C 12000 rpm离心30 min,取上清液备用。用Novagen公司Ni-NTA柱纯化上清液中目的蛋白，具体操作如下将Iml 50% Ni-NTA His · Bind树脂悬液加入到4ml制备好的细菌裂解上清液中，在旋转混合器上200 rpm轻柔摇动混匀后，4°C结合60 min。将裂解液Ni-NTA His · Bind树脂混合物加入下端封闭的空色谱柱中，除去柱下端封闭盖子，让液体自由流下。以4 mlIXNi-NTA 漂洗缓冲液 I (50mM NaH2P04,pH 8. 0,300mM NaCI,20mM 咪唑)漂洗 2 次；再以
O.5 ml IXNi-NTA 漂洗缓冲液 II (50mM NaH2P04,pH 8. 0,300mM NaCI, IOOmM 咪唑)漂洗4 次。以 0.5 ml IXNi-NTA 洗脱缓冲液(50mM NaH2P04，pH 8. 0,300mM NaCI,250mM 咪唑)洗脱目的蛋白4次。取洗脱下来的目的蛋白溶液吸到透析袋中，置于IL O. 15M NaCl中，4°C透析。隔2h换一次NaCl溶液，换第三次后，过夜透析。透析完毕后，将透析袋中的目的·蛋白冷冻干燥，置于_80°C保存。通过高保真PCR技术，扩增编码铁蛋白成熟肽的基因片段，并将其克隆到pET28a表达载体中，在大肠杆菌BL21 (DE3)中成功实现了原核体外重组表达。采用Nickel-NTA凝胶柱的活性回收方法，纯化得到可溶性的重组铁蛋白(图3)实施例3 :本发明的铁蛋白的活性分析铁蛋白的活性分析称取一定量目的蛋白溶解于灭菌水中，Bradford法测定蛋白含量。而后用于活性验证。铁氧化活性验证根据Levi et al. (1988)方法,将O. I M硫酸亚铁铵,4 mg/ml人拓扑转铁蛋白(Sigma, Aldrich)，O. 2M醋酸钠(pH 7· O)和20 μ g/ml纯化得到的重组铁蛋白混合，室温反应，10 min后再加入等体积的人拓扑转铁蛋白。从开始到结束的20min内，每隔Imin记录470nm处溶液的吸光值。结果显示加入铁蛋白后，溶液吸光值明显提高，表明该表达产物具有铁氧化活性，即将二价铁离子转化成三价铁离子(图4)。抑菌活性验证将鳗弧菌培养至指数期，而后用MH培养基稀释到IO5 CFU/ml。将20 μ 稀释后的鳗弧菌分别加入到180μ1含有纯化后重组铁蛋白(70 Pg/ml)和180μ1不含有纯化后重组铁蛋白的MH液体培养基中，混匀后，28° C静置培养24h。于0h，12h，24h，测定600nm处吸光值。实验重复3次。结果显示加入铁蛋白的培养基内，鳗弧菌生长明显受到抑制，从而在吸光度上比对照组明显低，表明本发明筛选的铁蛋白具有抑菌活性(图5)。因此，本发明分离的铁蛋白能够用来制备水产养殖中应用的抗菌剂。
权利要求
1.一种虾夷扇贝铁蛋白，其特征在于，所述的铁蛋白的氨基酸序列为SEQ ID N0:1。
2.如权利要求I所述虾夷扇贝铁蛋白，其基因⑶NA序列为SEQID NO :2。
3.—种重组载体，其特征他在于，所述的重组载体用于表达权利要求I所述虾夷扇贝铁蛋白。
4.权利要求I所述的虾夷贝铁蛋白在制备抗菌剂中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种虾夷铁蛋白基因及其应用，本发明从虾夷贝中分离得到了铁蛋白基因，其蛋白序列为SEQ ID NO:1，cDNA序列为SEQ ID NO:2。本发明克隆了虾夷扇贝铁蛋白基因，并对其体外重组表达产物进行了铁氧化和抑菌活性分析。研究表明本发明的虾夷扇贝铁蛋白不仅具有螯合铁的功能，而且具有抑菌活性，能够抑制贝类重要致病性细菌的生长。因此，虾夷扇贝铁蛋白在病害防治中具有良好的应用潜能。
文档编号C12N15/63GK102850449SQ20121038501
公开日2013年1月2日 申请日期2012年10月11日 优先权日2012年10月11日
发明者包振民, 张月月, 张玲玲, 胡晓丽, 陆维 申请人:中国海洋大学