一种线粒体药物性耳聋的检测引物组合物、试剂盒及方法
【专利摘要】本发明涉及生物检测技术领域，尤其是涉及一种线粒体药物性耳聋的检测引物组合物、试剂盒及方法，采用PNA Clamp LAMP技术，将PNA与LAMP法结合，利用PNA?4C封闭1494位点C等位基因，PNA?4T封闭1494位点T等位基因，PNA?5A封闭1555位点A等位基因，PNA?5G封闭1555位点G等位基因，从而使得相应的LAMP反应无法继续，以此实现线粒体基因位点突变检测的目的。该发明具有的优点在于该方法步骤简单，特异性高，鉴定简便，成本低廉，便于临床检验大范围普及。
【专利说明】
-种线粒体药物性耳聋的检测引物组合物、试剂盒及方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物检测技术领域，尤其是设及一种线粒体药物性耳聋的检测引物组 合物、试剂盒及方法。
【背景技术】
[0002] 药物中毒性耳聋(简称药物性耳聋），是指患者因使用或接触某些耳毒性药物而造 成的耳聋，运些药物(包括氨基糖巧类抗菌素、非氨基糖巧类抗菌素、水杨酸盐等)均对人类 听觉神经具有毒副作用，可破坏耳蜗，一般造成双侧、永久性耳聋，多不可逆。
[0003] 根据中国2006年第二次全国残疾人抽样调查结果显示，听力残疾患者人数约2004 万人，占全国8296万残疾人总数的24.16%，其中药物致聋的人数多达800万。其中，氨基糖 巧类抗生素的不恰当使用是造成药物性耳聋发生的最常见因素，运类抗生素包括常见的链 霉素、庆大霉素等。另外有研究结果表明，人类线粒体基因突变的发生与药物性耳聋密切相 关。在中国人群中，线粒体基因的A1555G、C1494T运两个位点突变的发生频率高达4%。 A1555G突变和C1494T突变会在12S rRNA的高度保守的A位形成新的1494C-G1555或1494U-A1555碱基对。运些改变使得12S rRNA在二级结构上与细菌的ieSrRNA的相应区域的二级结 构更加相似，导致糖巧类药物与之发生"不应该"的结合，引起细胞膜上的化+,K+-ATP累功 能障碍，造成毛细胞损伤，导致药物性听力受损甚至耳聋。目前用于检测运两个位点突变的 方法有很多种，如Sanger测序法，运种方法可W很直观得得到目的位点的突变情况，然而操 作复杂，需要两次PCR和大量的纯化工作，并且费用高昂，耗时较长，不适合大范围推广使 用;等位基因特异性PCR法，运种方法通过设计突变型和野生型特异的PCR引物，通过电泳比 较野生型和突变型PCR产物的大小不同W判定检测样本的突变状况，优点是费用低廉，然而 大规模检测时样本量较大，同时进行大量的电泳操作就会变得非常繁琐，而且容易造成交 叉污染;巧光定量PCR法灵敏度高，不需要人工检测，因此目前应用比较广泛，然而它依然不 能摆脱对昂贵的设备的依赖，同时，用于检测的探针也是一笔不小的支出。因此，非常有必 要开发一种既能快速准确又能价格低廉的检测方法。环介导的等溫扩增(LAMP)技术是日本 科学家于2000年提出的一种等溫扩增技术，其主要特点是针对祀基因的6个区域设计4条特 异引物，在链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)的作用下进行恒溫扩增，仅需15-90分 钟即可产生IO9-IOW数量级的产物。具有敏感性高、特异性好、操作简便、成本低廉且结果易 于判定的优点。
[0004] LAMP法具有操作简单，特异性强和成本低廉的优点。目前LAMP法较多用于病原体 和其他一些微生物的检测中，虽然对于使用LAMP法进行基因突变的检测也偶见报道，但运 些等位基因特异性引物的LAMP法在实际的应用中很不稳定，因此在市场上还没有WLAMP法 为基础的基因突变检测试剂盒出售。肤核酸(PM)是具有类多肤骨架的DNA类似物，骨架是 由N(2-氨基乙基)-甘氨酸与核酸碱基通过亚甲基幾基连接而成的。PNA可W特异性地和与 之互补的DNA或RNA杂交，形成稳定的复合体。当PNA与祀序列完全互补时，运种复合体的稳 定性要远远高于普通的DNA-DNA、DNA-RNA及RNA-RNA的双链结构。然而，当PNA与祀序列不完 全配对甚至只有一个碱基错配的时候，运种PNA-DNA复合物就变得非常不稳定，很容易打开 双链。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是现有的线粒体基因位点突变的检测存在费用高，检测 周期较长，操作繁琐等问题，不利于临床检验大范围普及。
[0006] 为解决上述问题，本发明将PNA与LAMP法结合，利用PNA-4C封闭1494位点C等位基 因，PNA-4T封闭1494位点T等位基因，PNA-5A封闭1555位点A等位基因，PNA-5G封闭1555位点 G等位基因，从而使得相应的LAMP反应无法继续，W此实现线粒体基因位点突变的检测，该 方法既快速灵敏又成本低廉。
[0007] 本发明的第一个目的在于提供一种线粒体药物性耳聋的检测引物组合物，包括： [000引正向外侧引物F3:
[0009] 5'-TGGGCTACATTTTCTACCC-3'（SEQ ID No.l);
[0010] 反向外侧引物B3:
[0011] 5'-ACACTTACCATGTTACGACT-3'（沈Q ID No.2);
[001 ^ 正向内侧引物FIP:
[0013] 5'-AGCACTCTACTCTTAGTTTACTGCTCAGAAAACTACGATAGCCCTT-3'（SEQ ID No.3);
[0014] 反向内侧引物BIP:
[0015] 5'-CCGTCACCCTCCTCAAGTATTGTCTCCTCTATATAAATGCGTA-3'（沈Q ID No.4);W及
[0016] 用于封闭1494位点C等位基因的肤核酸序列PNA-4C:
[0017] 5'-CCGTCACCCTCCTCA-3'（沈Q ID No.5);
[001引用于封闭1494位点T等位基因的肤核酸序列PNA-4T:
[0019] 5'-CCCGTCACTCTCCTCA-3'（沈Q ID No.6);
[0020] 用于封闭1555位点A等位基因的肤核酸序列PNA-5A:
[0021] 5'-TACGACTTGTCTCCTCTA-3'（沈Q ID No.7);
[0022] 用于封闭1555位点G等位基因的肤核酸序列PNA-5G:
[0023] 日'-TACGACTTGCCTCCTCT-3'（沈Q ID No.8)。
[0024] 本发明的第二个目的在于提供一种线粒体药物性耳聋的检测试剂盒，所述检测试 剂盒包括上述的引物和肤核酸序列。
[0025] 进一步地，所述检测试剂盒中还包括dNTP、缓冲液、Bs t聚合酶和超纯水。
[0026] 进一步地，所述检测试剂盒分为四个反应体系，分别为记为检测1494位点C等位基 因的反应体系C，检测1494位点T等位基因的反应体系T，检测1555位点A等位基因的反应体 系A和检测1555位点G等位基因的反应体系G:
[0027] 反应体系C中包括。3、83少1?、81?、？魁-4(：、(1肿？、缓冲液、831聚合酶和超纯水;反 应体系T中包括。3、83立1口、81口、口臟-41\(1肿口、缓冲液、831聚合酶和超纯水;反应体系4中包 括尸3、83^1?、81?、？麻-54、(1^?、缓冲液、831聚合酶和超纯水；反应体系0中包括。3、83、 門口、81?、？臟-56、(1饥1\缓冲液、831聚合酶和超纯水。
[00%]进一步地，所述四个反应体系中还包括用于显示体系颜色的指示剂。
[0029]优选地，所述指示剂为径基糞酪蓝。
[0030] 优选地，所述指示剂在四个反应体系中的浓度相同，径基糞酪蓝的浓度为120測。
[0031] 进一步地，所述四个反应体系中还包括添加剂，所述添加剂在四个反应体系中的 浓度一致。
[0032] 优选地，所述添加剂为甜菜碱，甜菜碱的浓度为0.8M。
[0033] 优选地，所述四个反应体系中缓冲液的浓度相同，其包括：TriS-HCl 20mM，KCl 50mM，（NH4)2S〇4 10mM，MgS〇4 4mM，Tween-20 0.1 % (体积分数）。
[0034] 优选地，所述四个反应体系中：F3的浓度相同，均为0.4iiM;B3的浓度相同，均为0.4 ixM;FIP的浓度相同，均为1.6iiM;BIP的浓度相同，均为1.6iiM;所述四个反应体系中相应肤核 酸序列的浓度相同，均为化M。
[003引优选地，四个反应体系中dNTP的浓度相同，均为1.4mM;两个反应体系中Bst聚合酶 的浓度相同，均为8U。
[0036] 本发明的第=个目的在于提供一种线粒体药物性耳聋的检测方法，其使用上述的 检测试剂盒，包括如下步骤：
[0037] (1)抽取静脉血W邸TA抗凝管保存；
[0038] (2)用DNA提取试剂盒提取全基因组DNA作为待检测的模板，同时W已知突变质粒 作为阳性对照；
[0039] (3)采用PNA Clamp LAMP技术，对待检测的模板和突变质粒进行LAMP反应，将模板 和突变质粒分别加入到反应体系C、反应体系T、反应体系A和反应体系G中，于63°C下反应， 然后升溫至80°C保持20min进行酶灭活处理，之后降溫，观察体系颜色变化。
[0040] 进一步地，所述反应时间为70~90min。
[0041] 在本发明的四个反应体系中，当反应体系中存在指示剂时，选用径基糞酪蓝作为 指示剂时，反应前体系中的儀离子与dNTP馨合，体系呈现紫罗兰色；当有阳性反应时，儀离 子与副产物焦憐酸形成沉淀，溶液pH发生改变，颜色逐渐由紫罗兰色变为天蓝色。因此，观 察反应体系颜色的变化就可W直接判定是否发生扩增反应。
[0042] 本发明具有的优点和积极效果是：
[0043] 本发明采用PNA Clamp LAMP技术，将PNA与LAMP法结合，利用PNA将相应的等位基 因"封闭"，从而使得LAMP反应无法继续;而当检测样本中存在另外一个或者几个等位基因 时，PNA由于不能有效对其进行"封闭"，使得LAMP反应得W顺利进行，W此达到线粒体基因 位点突变检测的目的。
[0044] 与现有技术相比，PNA Clamp LAMP法具有如下有益效果：
[0045] (1)步骤简单:LAMP法本身对模板的要求并不严格，其反应模板甚至可W是DNA的 粗提物，只需反应体系配置完毕后放置在恒溫水浴锅中进行反应扩增即可，不需要预先进 行双链DNA的变性及类似于PCR循环反应中的反复变性、退火、延伸等变溫过程；
[0046] (2)高特异性:典型的LAMP反应需要四条引物，它们共六个不同的模板结合区域， 远远高于普通PCR的两条引物，因此LAMP扩增的特异性很高，可W根据是否扩增就能判断目 标基因的存在与否；
[0047] (3)扩增反应快速、高效:整个扩增过程不超过1.化，且产率高；
[0048] (4)鉴定简便:反应完成后通过肉眼观察颜色变化即可判定结果，结果的观察可W 脱离凝胶成像的操作要求和仪器限制；
[0049] (5)成本低廉:整个检测反应仅需要水浴锅就可开展，无需任何其他检测设备。
【附图说明】
[0050] 图1-图2分别是检测样本MO的1494位点和1555位点的测序图；
[0051 ]图3是检测样本M4的1494位点的测序图；
[0化2]图4是检测样本M5的1555位点的测序图。
【具体实施方式】
[0053]为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明，但 不限定本发明的保护范围。
[0化4] 一种线粒体药物性耳聋的检测引物组合物，包括：
[00对正向外侧引物F3:
[0056] 5'-TGGGCTACATTTTCTACCC-3'（SEQ ID No.l);
[0化7] 反向外侧引物B3:
[005引 5'-ACACTTACCATGTTACGACT-3'（沈Q ID No.2);
[0化9] 正向内侧引物FIP:
[0060] 5 '-AGCACTCTACTCTTAGTTTACTGCTCAGAAAACTACGATAGCCCTT-3 '（SEQ ID No.3);
[0061] 反向内侧引物BIP:
[0062] 5'-CCGTCACCCTCCTCAAGTATTGTCTCCTCTATATAAATGCGTA-3'（沈Q ID No.4);W及
[0063] 用于封闭1494位点C等位基因的肤核酸序列PNA-4C:
[0064] 5'-CCGTCACCCTCCTCA-3'（沈Q ID No.5);
[0065] 用于封闭1494位点T等位基因的肤核酸序列PNA-4T:
[0066] 5'-CCCGTCACTCTCCTCA-3'（沈Q ID No.6);
[0067] 用于封闭1555位点A等位基因的肤核酸序列PNA-5A:
[006引 日'-TACGACTTGTCTCCTCTA-3'（沈Q ID No.7);
[0069] 用于封闭1555位点G等位基因的肤核酸序列PNA-5G:
[0070] 日'-TACGACTTGCCTCCTCT-3'（沈Q ID No.8)。
[0071] -种线粒体药物性耳聋的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括上述的引物和肤核酸 序列，还包括dNTP、缓冲液、Bst聚合酶、超纯水、径基糞酪蓝和甜菜碱。
[0072] 所述检测试剂盒分为四个反应体系，分别为记为检测1494位点C等位基因的反应 体系C，检测1494位点T等位基因的反应体系T，检测1555位点A等位基因的反应体系A和检测 1555位点G等位基因的反应体系G:
[0073] 反应体系C中包括。3、83少1?、81?、？臟-4(：、(1饥1\缓冲液、831聚合酶、超纯水、径基 糞酪蓝和甜菜碱;反应体系T中包括。3、83立1?、81?、？臟-41\(1肿？、缓冲液、83*聚合酶、超纯 水、径基糞酪蓝和甜菜碱;反应体系A中包括。3、83立1?、81?、？酷-54、(1饥1\缓冲液、83*聚合 酶、超纯水、径基糞酪蓝和甜菜碱;反应体系G中包括。3、83立1?、81?、？臟-56、(1肿？、缓冲液、 Bst聚合酶、超纯水、径基糞酪蓝和甜菜碱。
[0074] 四个反应体系中各组分的浓度可按正常LAMP反应的浓度设置，作为一种实施方 案，四个反应体系中：F3的浓度相同，均为0.4iiM; B3的浓度相同，均为0.4咖;FIP的浓度相 同，均为1.6iiM;BIP的浓度相同，均为1四个反应体系中相应肤核酸序列的浓度相同， 均为UiM;dNTP的浓度相同，均为1.4mM;Bst聚合酶的浓度相同，均为洲;缓冲液的浓度相同， 均包括：Tris-HCl 20mM，KCl 50mM，（NH4)2S〇4 IOmM,MgS〇4 4mM，Tween-20 0.1%(体积分 数）；?基糞酪蓝的浓度相同，均为120yM;甜菜碱的浓度相同，均为0.8M。
[0075] -种线粒体药物性耳聋的检测方法，使用上述的检测试剂盒，具体为:抽取静脉血 W抓TA抗凝管保存；用DNA提取试剂盒提取全基因组DNA作为待检测的模板，同时W已知突 变质粒作为阳性对照;采用PNA Clamp LAMP技术，对待检测的模板和突变质粒进行LAMP反 应，将模板和突变质粒分别加入到反应体系C、反应体系T、反应体系A和反应体系G中，于63 °C下反应，然后升溫至80°C保持20min进行酶灭活处理，之后降溫，观察体系颜色变化。作为 优选，所述反应时间为70~90min。
[0076] 具体实施时，抽取一个听力正常的人的Iml静脉血WEDTA抗凝管保存，每管取 200ul血液，用全式金或者其它公司的DNA提取试剂盒，参照试剂盒说明书提取全基因组DNA 作为待检测的模板，记为MO,另有两个已知14940T和1555A〉G的质粒作为阳性对照，分别记 为M4和M5;对各个模板采用PNA Clamp LAMP技术，使待检测的模板进行LAMP反应，分为四个 反应体系，第一个针对1494位点的C等位基因，即体系C;第二个针对1494位点的T等位基因， 即体系T;第S个针对1555位点的A等位基因，即体系A;第四个针对1555位点的G等位基因， 即体系G。四个体系中的指示剂均为径基糞酪蓝，添加剂均为甜菜碱。将模板Mn(n为组别编 号，n为0、4、5)分别加入到反应体系C、反应体系T、反应体系A和反应体系G中，模板Mn在四个 反应体系中的浓度一致，均为IOng/化(实际操作中可W是0.01-5化g/化均可），四个反应体 系反应时，于63 °C下反应70min，之后升溫至80 °C保持20min进行灭活处理，之后降溫，观察 体系颜色变化。
[0077] 利用检测试剂盒的四个反应体系对模板Mn进行检测，作为一种实施方式，检测试 剂盒的四个反应体系各为2如L，其内的组分和含量如下表1-表4所示：
[007引表1反应体系C的组分和含量
[0079]
[0080]
[0081]
[0082]
[0083]
[0085] 表4反应体系G的组分和含量
[0084]
[0086]
[0087] 反应按照上述的检测方法进行，反应前，体系颜色均为紫罗兰色，反应后，各组别 反应体系的颜色及基因型判断如下表5所示：
[0088] 表5各组别反应体系的颜色及基因型判断
[0089]
[0090] 为进一步验证反应的准确性，用PCR测序法将实验组的模板MO、M4和M5进行分型， MO的1494位点和15 55位点的测序图如图巧日图2所示，M4的1494位点的测序图如图3所示，M5 的1555位点的测序图如图4所示，对比基因测序图谱和本发明提供的检测试剂盒的检测结 果可知，二者的检测结果完全一致，验证了本发明的结果精确。
[0091] W上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例， 不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等， 均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。
【主权项】
1. 一种线粒体药物性耳聋的检测引物组合物，其特征在于:包括： 正向外侧引物F3: 5'-TGGGCTACATTTTCTACCC-3'（SEQ ID No.l); 反向外侧引物B3: 5'-ACACTTACCATGTTACGACT-3'（SEQ ID No.2); 正向内侧引物FIP: 5 '-AGCACTCTACTCTTAGTTTACTGCTCAGAAAACTACGATAGCCCTT-3 '（SEQ ID No·3); 反向内侧引物BIP: 5 ' -CCGTCACCCTCCTCAAGTATTGTCTCCTCTATATAAATGCGTA-3 '（ SEQ ID No · 4);以及 用于封闭1494位点C等位基因的肽核酸序列PNA-4C: 5'-CCGTCACCCTCCTCA-3'（SEQ ID Νο·5); 用于封闭1494位点Τ等位基因的肽核酸序列ΡΝΑ-4Τ: 5'-CCCGTCACTCTCCTCA-3'（SEQ ID Νο·6); 用于封闭1555位点Α等位基因的肽核酸序列ΡΝΑ-5Α: 5'-TACGACTTGTCTCCTCTA-3'（SEQ ID No.7); 用于封闭1555位点G等位基因的肽核酸序列PNA-5G: 5'-TACGACTTGCCTCCTCT-3'（SEQ ID No.8)。2. -种线粒体药物性耳聋的检测试剂盒，其特征在于:包括权利要求1所述的引物和肽 核酸序列。3. 根据权利要求2所述的线粒体药物性耳聋的检测试剂盒，其特征在于:还包括dNTP、 缓冲液、Bst聚合酶和超纯水。4. 根据权利要求3所述的线粒体药物性耳聋的检测试剂盒，其特征在于:所述检测试剂 盒分为四个反应体系，分别为记为检测1494位点C等位基因的反应体系C，检测1494位点T等 位基因的反应体系T，检测1555位点A等位基因的反应体系A和检测1555位点G等位基因的反 应体系G: 反应体系C中包括?333、？1?、81?、？嫩-4(：、(1犯1\缓冲液、88丨聚合酶和超纯水； 反应体系T中包括?3、83、？1?、81?、？熟-41\(1犯1\缓冲液、88丨聚合酶和超纯水； 反应体系A中包括?3、83、？1?、81?、？嫩-54、(1犯1\缓冲液、88丨聚合酶和超纯水； 反应体系G中包括?3、83、？1?、81?、？嫩-56、(1犯1\缓冲液、88丨聚合酶和超纯水。5. 根据权利要求4所述的线粒体药物性耳聋的检测试剂盒，其特征在于:所述四个反应 体系中还包括用于显示体系颜色的指示剂。6. 根据权利要求5所述的线粒体药物性耳聋的检测试剂盒，其特征在于:所述指示剂为 羟基萘酚蓝。7. 根据权利要求6所述的线粒体药物性耳聋的检测试剂盒，其特征在于:所述指示剂在 四个反应体系中的浓度相同，羟基萘酚蓝的浓度为120μΜ。8. 根据权利要求4所述的线粒体药物性耳聋的检测试剂盒，其特征在于:所述四个反应 体系中还包括添加剂，所述添加剂在四个反应体系中的浓度一致。9. 根据权利要求8所述的线粒体药物性耳聋的检测试剂盒，其特征在于:所述添加剂为 甜菜碱，甜菜碱的浓度为〇. 8Μ。10. 根据权利要求4-9中任一项所述的线粒体药物性耳聋的检测试剂盒，其特征在于： 所述四个反应体系中缓冲液的浓度相同，其包括：Tris-HCl 20mM，KCl 50mM，（NH4)2S〇4 10mM，MgS〇4 4mM，Tween-20 0.1% (体积分数）。11. 根据权利要求4-9中任一项所述的线粒体药物性耳聋的检测试剂盒，其特征在于： 所述四个反应体系中：F3的浓度相同，均为0.4μΜ;Β3的浓度相同，均为0.4yM;FIP的浓度相 同，均为1.6μΜ;ΒΙΡ的浓度相同，均为1.6μΜ;所述四个反应体系中相应肽核酸序列的浓度相 同，均为1虚。12. 根据权利要求4-9中任一项所述的线粒体药物性耳聋的检测试剂盒，其特征在于： 四个反应体系中dNTP的浓度相同，均为1.4mM;四个反应体系中Bst聚合酶的浓度相同，均为 8U〇13. -种线粒体药物性耳聋的检测方法，使用权利要求3-12任一所述的检测试剂盒，其 特征在于:包括如下步骤： (1) 抽取静脉血以Η)ΤΑ抗凝管保存； (2) 用DNA提取试剂盒提取全基因组DNA作为待检测的模板，同时以已知突变质粒作为 阳性对照； (3) 采用PNA Clamp LAMP技术，对待检测的模板和突变质粒进行LAMP反应，将模板和突 变质粒分别加入到反应体系C、反应体系T、反应体系A和反应体系G中，于63°C下反应，然后 升温至80°C保持20min进行酶灭活处理，之后降温，观察体系颜色变化。14. 根据权利要求13所述的线粒体药物性耳聋的检测方法，其特征在于:所述反应时间 为70~90min。
【文档编号】C12Q1/68GK105861687SQ201610298592
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年5月6日
【发明人】汪大为, 张井存
【申请人】北京晋祺生物科技有限公司