含有检测标签IgG的表达载体、构建方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了含有检测标签IgG的表达载体、构建方法及其在目的蛋白的表达检测中的应用。该检测标签IgG为至少一个种属的IgG的恒定区基因；通过至少一个种属的IgG的恒定区基因与至少一个种属的二抗的直接反应实现目的蛋白的表达检测。含有检测标签IgG的表达载体的构建包括：设计至少一个种属的IgG的恒定区基因的上游引物和下游引物；以至少一个种属的cDNA为模板，采用上游引物和下游引物进行PCR扩增，得到至少一个种属的IgG的恒定区基因；将至少一个种属的IgG的恒定区基因与表达载体连接，构建成含有检测标签IgG的表达载体。本发明应用于目的蛋白的检测时可降低假阴性检测结果出现的概率，提高检测的准确度和灵敏度。
【专利说明】含有检测标签IgG的表达载体、构建方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学实验技术方法领域，涉及一种分子生物学实验技术。更具体地，本发明涉及含有检测标签IgG的表达载体、构建方法及其应用。
【背景技术】
[0002]分子生物学实验中，基因工程方法表达外源蛋白是常用的技术手段，同时该过程必需检测目的蛋白的表达。目前，通常检测目标蛋白的方法是通过蛋白对应的抗体来进行抗原抗体反应，再通过二抗显色来间接确定目的蛋白。这样会产生两个问题:(1)目的蛋白与抗体结合能力不能得到有效保证，抗原与抗体不结合而造成二抗不能有效显色，结果导致假阴性的实验结果，造成实验失败；(2) —些新的蛋白没有相应的抗体来检测，实验无法完成；(3)检测过程涉及到目的蛋白与抗体结合、抗体与二抗结合两步操作，影响检测速度和准确度。
【发明内容】
[0003]本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术中检测目的蛋白时可能存在假阴性实验结果、由于缺少抗体无法完成目的蛋白检测以及检测过程繁琐的问题，提供一种含有检测标签IgG的表达载体，从而提供操作简便、结果准确、使用范围广的目的蛋白的检测方法。本发明同时也提供上述表达载体的构建方法及其在目的蛋白的表达及检测中的应用。 [0004]本发明要解决的技术问题通过以下技术方案得以实现:提供一种含有检测标签IgG的表达载体,所述检测标签IgG为至少一个种属的IgG的恒定区基因；在表达载体中插入至少一个种属的IgG的恒定区基因得到所述含有检测标签IgG的表达载体。
[0005]在上述含有检测标签IgG的表达载体中，所述至少一个种属的IgG的恒定区基因包括人IgG的恒定区基因、兔IgG的恒定区基因、鼠IgG的恒定区基因、羊IgG的恒定区基因、马IgG的恒定区基因、牛IgG的恒定区基因、猪IgG的恒定区基因、猴IgG的恒定区基因、鸡IgG的恒定区基因、鸭IgG的恒定区基因、狗IgG的恒定区基因、熊猫IgG的恒定区基因和狼IgG的恒定区基因。
[0006]根据本发明的另一方面，提供含有检测标签IgG的表达载体的构建方法，所述检测标签IgG为至少一个种属的IgG的恒定区基因；所述方法包括以下步骤:
[0007]S1、设计所述至少一个种属的IgG的恒定区基因的上游引物和下游引物；
[0008]S2、以至少一个种属的cDNA为模板，采用所述上游引物和下游引物进行PCR扩增，得到至少一个种属的IgG的恒定区基因；
[0009]S3、将所述至少一个种属的IgG的恒定区基因与表达载体连接，构建成含有检测标签IgG的表达载体。
[0010]在上述含有检测标签IgG的表达载体的构建方法中，在所述步骤S3中，所述表达载体包括PET系列表达载体、GST系列表达载体、pTrxA系列表达载体、ρ⑶NA3.1/His C系列表达载体、PCDNA5/FRT/T0系列表达载体、pEGFP-Nl系列表达载体和pBudce4.1系列表达载体。
[0011]根据本发明的另一方面，提供含有检测标签IgG的表达载体在目的蛋白的表达检测中的应用，所述检测标签IgG为至少一个种属的IgG的恒定区基因；通过所述至少一个种属的IgG的恒定区基因与所述至少一个种属的二抗的直接反应实现所述目的蛋白的表达检测。
[0012]上述含有检测标签IgG的表达载体的应用包括以下步骤:
[0013]获取至少一个种属的IgG的恒定区基因；构建含有至少一个种属的IgG的恒定区基因的表达载体；获取目的蛋白基因，并将所述目的蛋白基因连接于含有至少一个种属的IgG的恒定区基因的表达载体；将连接有目的蛋白基因、且含有至少一个种属的IgG的恒定区基因的表达载体转染于表达菌株中进行诱导培养，收集表达产物；以及采用所述至少一个种属的二抗进行ECL显色，以检测所述目的蛋白的表达。
[0014]上述含有检测标签IgG的表达载体的应用中于，获取至少一个种属的IgG的恒定区基因包括:设计所述至少一个种属的IgG的恒定区基因的上游引物和下游引物；以至少一个种属的cDNA为模板，采用所述上游引物和下游引物进行PCR扩增，获取至少一个种属的IgG的恒定区基因。
[0015]上述含有检测标签IgG的表达载体的应用中，构建含有至少一个种属的IgG的恒定区基因的表达载体包括:同时双酶切表达载体和至少一个种属的IgG的恒定区基因；利用DNA电泳同时回收双酶切产生的基因片段和载体片段；以及将所述载体片段和所述基因片段用连接酶进行连接反应，以构建含有至少一个种属的IgG的恒定区基因的表达载体。
[0016]实施本 发明可以获得以下有益效果:本发明中采用至少一个种属的IgG的恒定区基因作为检测标签，将包含其的表达载体应用于目的蛋白的表达检测时，由于IgG的恒定区基因的表达产物可与对应种属的二抗直接进行免疫反应，因此可以检测目的蛋白的表达状况。上述检测操作实现简单、使用方便且选择面广。另外，本发明选用可与实验室常用的二抗特异性结合的IgG检测标签，两者结合度高，可降低假阴性检测结果出现的概率，提高检测的准确度和灵敏度。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]以下将结合附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明。附图中:
[0018]图1是实施例1中pET28a_鼠IgG的酶切鉴定图；
[0019]图2是基于检测标签IgG检测实施例1中制得的目的蛋白的检测结果；
[0020]图3是基于检测标签IgG检测实施例2中制得的目的蛋白的检测结果；
[0021]图4是基于检测标签IgG检测实施例3中制得的目的蛋白的检测结果；
[0022]图5是基于检测标签IgG检测实施例4中制得的目的蛋白的检测结果。
【具体实施方式】
[0023]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0024]本发明提供了一种含有检测标签IgG的表达载体在目的蛋白的表达检测中的应用，这里所描述的检测标签IgG指的是至少一个种属的IgG的恒定区基因，并优选为二抗已知的实验室中常用的种属类别，例如兔、鼠等种属。具体应用过程中，首先构建本发明的含有检测标签IgG的表达载体，随后将目的蛋白连接到含有检测标签IgG的表达载体中，在表达菌株中完成表达后采用对应种属的二抗进行显色反应检测。由于检测标签IgG的高度保守性，其与相应二抗的结合能力和针对性强，可同时提高检测的精确度和灵敏度。
[0025]可在美国国立生物信息中心(NCBI)、欧洲生物信息中心(EBI)、法国免疫球蛋白基因序列数据库(MGT)等数据库查询不同种属的IgG的恒定区基因，并根据查询到的基因序列设计相应的PCR扩增引物(具体为设计上游引物和下游引物)。随后分别取不同种属动物的血样，各自提取总RNA并分别反转录成cDNA。以获得的cDNA为模板，采用构建的扩增引物进行PCR扩增，得到不同种属的基因片段。优选地，将基因片段的长度控制在900bp左右。
[0026]本发明所采用的表达载体为现有技术中通用的真核表达载体和原核表达载体。具体例如，采用的表达载体包括但不限于PET系列表达载体(pET28a)、GST系列表达载体(PGEX-4T-1)、pTrxA系列表达载体、pCDNA3.1/His C系列表达载体、pCDNA5/FRT/T0系列表达载体、pEGFP-Nl系列表达载体和pBudce4.1系列表达载体。
[0027]可使用不同酶切位点将至少一个种属的IgG的恒定区基因克隆到表达载体中时(即实现二者的连接时)。结合以下将详细说明的扩增引物设计可知，本发明可使用的酶切位点包含但不限于上游的Xho I酶切位点、Hind III酶切位点，下游的Xba I酶切位点、XhoI酶切位点等。
[0028]在其中一个【具体实施方式】中，在本发明涉及的不同种属的所有上游引物中引入Xho I酶切位点，在下游引物中引入Xba I酶切位点。对获取的相应种属的IgG的恒定区基因和采用的表达载体进行同样的酶切后，将相应种属的IgG的恒定区基因连接/克隆到真核表达载体P⑶NA3.1/His C中，构建出含有不同种属的检测标签IgG的真核表达载体。该实施方式中设计的多个引物序列如下。
[0029]1-1、人IgG的恒定区基因的引物设计
[0030]上游引物的引物序列1:5’ -CCG CTC GAG GTC TCC TCA GCC TCC ACC-3，，
[0031]下游引物的引物序列2:5’ -GAG TCT AGA TCA TTT ACC CGG AGA CAG GGA-3，；
[0032]1-2、鼠IgG的恒定区基因的引物设计
[0033]上游引物的引物序列3:5’ -CCG CTC GAG GCC CCA TCT GTC TAT CCC-3，，
[0034]下游引物的引物序列4:5’ -GAG TCT AGA TCA TTT ACC AGG GGA GCG AGA-3，；
[0035]1-3、兔IgG的恒定区基因的引物设计
[0036]上游引物的引物序列5:5’ -CCG CTC GAG CAA CCT AAG GCT CCG TCA-3，，
[0037]下游引物的引物序列6:5’ -GAG TCT AGA TCA TTT ACC CGG AGA GCG GGA-3，；
[0038]1-4、羊IgG的恒定区基因的引物设计
[0039]上游引物的引物序列7:5’ -CCG CTC GAG GTG GTG GTG GAC GTG GGC CAG-3’，
[0040]下游引物的引物序列8:5，-GAG TCT AGA TCA TTT ACC CGG AGG CTT AGA GAT-3，;
[0041]1-5、马IgG的恒定区基因的引物设计
[0042]上游引物的引 物序列9:5’ -CCG CTC GAG GCC TCC ACC ACC GCC CCG-3，，
[0043]下游引物的引物序列10:5’ -GAG TCT AGA TCA TTT ACC CGG GTT CTT GGA-3，；[0044]1-6、牛IgG的恒定区基因的引物设计
[0045]上游引物的引物序列11:5，-CCG CTC GAG GCC TCC ACC ACA GCC CCG-3，，
[0046]下游引物的引物序列12:5，-GAG TCT AGA TCA TTT ACC CGC AGA CTT AGA-3，；
[0047]1-7、猴IgG的恒定区基因的引物设计[0048]上游引物的引物序列13:5’ -CCG CTC GAG CCT CCA CCA AGG GCC CAT-3，，
[0049]下游引物的引物序列14:5，-GAG TCT AGA TCA TCT GCG TGT AGT GGT TGT-3，；
[0050]1-8、鸡IgG的恒定区基因的引物设计
[0051]上游引物的引物序列15:5，-CCG CTC GAG GCG AGC CCC ACA TCG CCC-3，，
[0052]下游引物的引物序列16:5’ -GAG TCT AGA TCA TTT ACC AGC CTG TTT CTG-3，；
[0053]1-9、狗IgG的恒定区基因的引物设计
[0054]上游引物的引物序列17:5，-CCG CTC GAG CAC TGG CCC CCA GCT GCG GGT-3，，
[0055]下游引物的引物序列18:5’ -GAG TCT AGA TCA TTT ACC CGG AGA ATG GGA-3’ ；
[0056]1-10、猪IgG的恒定区基因的引物设计
[0057]上游引物的引物序列19:5’ -CCG CTC GAG GCC CCA TCT GTC TAT CCC-3，，
[0058]下游引物的引物序列20:5，-GAG TCT AGA TCA TTT ACC CGG AGA AAT GGA-3，；
[0059]1-11、熊猫IgG的恒定区基因的引物设计
[0060]上游引物的引物序列21:5，-CCG CTC GAG CCT CCA CCA CGG GCC CCA TCG-3，，
[0061]下游引物的引物序列22:5’ -GAG TCT AGA TCA TTT ACC CGG AGACTG GGA-3，。
[0062]以上涉及的动物种属多为实验室中使用的常见种属，例如兔、鼠、羊、马等等。可以根据所拥有的二抗的种属选择含有不同检测标签IgG的表达载体，进一步提高构建此类表达载体的便利度。除以上列举的动物种属外，还可采用狼、猩猩等动物的IgG的恒定区基因。
[0063]在另一【具体实施方式】中，在本发明涉及的不同种属的所有上游引物中引入HindIII酶切位点，在下游引物中引入Xh0 I酶切位点。对获取的相应种属的IgG的恒定区基因和采用的表达载体进行同样的酶切后，将相应种属的IgG的恒定区基因连接/克隆到原核表达载体pET28a中，构建出含有不同种属的检测标签IgG的原核表达载体。该实施方式中设计的多个引物序列如下。
[0064]2-1、人IgG的恒定区基因的引物设计
[0065]上游引物的引物序列23:5’ -CCG AAG CTT GTC TCC TCA GCC TCC ACC-3，，
[0066]下游引物的引物序列24:5，-GAG CTC GAG TCA TTT ACC CGG AGA CAG GGA-3，；
[0067]2-2、鼠IgG的恒定区基因的引物设计
[0068]上游引物的引物序列25:5’ -CCG AAG CTT GCC CCA TCT GTC TAT CCC-3’，
[0069]下游引物的引物序列26:5，-GAG CTC GAG TCA TTT ACC AGG GGA GCG AGA-3，；
[0070]2-3、兔IgG的恒定区基因的引物设计
[0071]上游引物的引物序列27:5，-CCG AAG CTT CAA CCT AAG GCT CCG TCA-3，，
[0072]下游引物的引物序列28:5，-GAG CTC GAG TCA TTT ACC CGG AGA GCG GGA-3，；
[0073]2-4、羊IgG的恒定区基因的引物设计
[0074]上游引物的引物序列29:5’ -CCG AAG CTT GTG GTG GTG GAC GTG GGC CAG-3’，
[0075]下游引物的引物序列30:5’ -GAG CTC GAG TCA TTT ACC CGG AGG CTT AGAGAT-3，；
[0076]2-5、马IgG的恒定区基因的引物设计
[0077]上游引物的引物序列31:5，-CCG AAG CTT GCC TCC ACC ACC GCC CCG-3，，
[0078]下游引物的引物序列32:5’ -GAG CTC GAG TCA TTT ACC CGG GTT CTT GGA-3，；
[0079]2-6、牛IgG的恒定区基因的引物设计
[0080]上游引物的引物序列33:5’ -CCG AAG CTT GCC TCC ACC ACA GCC CCG-3，，
[0081]下游引物的引物序列34:5’ -GAG CTC GAG TCA TTT ACC CGC AGA CTT AGA-3’ ；
[0082]2-7、猴IgG的恒定区基因的引物设计
[0083]上游引物的引物序列35:5’ -CCG AAG CTT CCT CCA CCA AGG GCC CAT-3，，
[0084]下游引物的引物序列36:5，-GAG CTC GAG TCA TCT GCG TGT AGT GGT TGT-3’ ；
[0085]2-8、鸡IgG的恒定区基因的引物设计
[0086]上游引物的引物序列37:5’ -CCG AAG CTT GCG AGC CCC ACA TCG CCC-3，，
[0087]下游引物的引物序列38:5，-GAG CTC GAG TCA TTT ACC AGC CTG TTT CTG-3，；
[0088]2-9、狗IgG的恒定区基因的引物设计
[0089]上游引物的引物序列39:5，-CCG AAG CTT CAC TGG CCC CCA GCT GCG GGT-3，，
[0090]下游引物的引物序列40:5，-GAG CTC GAG TCA TTT ACC CGG AGA ATG GGA-3’ ；
[0091]2-10、猪IgG的恒定区基因的引物设计
[0092]上游引物的引物序列41:5’ -CCG AAG CTT GCC CCA TCT GTC TAT CCC-3，，
[0093]下游引物的引物序列42:5，-GAG CTC GAG TCA TTT ACC CGG AGA AAT GGA-3，；
[0094]2-11、熊猫IgG的恒定区基因的引物设计
[0095]上游引物的引物序列43:5’ -CCG AAG CTT CCT CCA CCA CGG GCC CCA TCG-3，，
[0096]下游引物的引物序列44:5’ -GAG CTC GAG TCA TTT ACC CGG AGA CTG GGA-3，。
[0097]应该注意的是，虽然以上列示了两种实施方式中使用的上游引物和下游引物，但可应用于本发明的上游引物和下游引物并不受限于此。在上述数据库中查询到所需的IgG的恒定区基因序列后，本领域技术人员可根据后续将采用的表达载体，结合IgG的恒定区基因设计相应的扩增引物。此处不再对此做过多解释和说明。
[0098]以下通过具体实施例详细说明如何构建本发明中含有检测标签IgG的表达载体，并进一步详细说明如何将该含有检测标签IgG的表达载体应用于目的蛋白的表达检测。实施例1-2为采用鼠IgG的恒定区基因的具体示例，实施例3-4为采用兔IgG的恒定区基因的具体示例。
[0099]实施例1:
[0100]本实施例采用pET28a原核表达载体。提取鼠的血样，提取总RNA后将其反转录为cDNA。设计2-2所示的上游引物和下游引物，以鼠的cDNA为模板，采用上述扩增引物进行PCR扩增，得到所需的鼠IgG的恒定区基因。以Hind III和Xho I双酶切鼠IgG的恒定区基因，同时以Hind III和Xho I双酶切pET28a表达载体，利用DNA电泳同时回收两种酶切片段，以1:4的摩尔比将载体片段和基因片段用T4DNA连接酶进行连接反应，于16°C反应2小时，取10微升连接产物加入100微升大肠杆菌DH5 α感受态细胞中，静置于冰水混合物中30分钟后于42°C中热激90秒，再于冰水混合物上静置1分钟，加入100微升37°C的SOC培养基，于37°C摇床中温育1小时涂于含有卡那霉素的平板上，放入37°C培养箱中培养过夜，构建得到含鼠检测标签IgG的原核表达载体(pET28a-鼠IgG原核表达载体)。挑取单菌落于含有卡那霉素的LB培养基于37°C培养，采用2-2所示的上游引物和下游引物进行PCR鉴定，将阳性结果的菌液提取质粒，将质粒pET28a-鼠IgG用HindIII和Xho I双酶切进行酶切鉴定(如图1所示)，并最终进行序列分析确定鼠检测标签IgG成功克隆于表达载体中，终止S码子在IgG标签末端。
[0101] 本实施例中采用CAP蛋白作为目的蛋白。设计如下所示的扩增引物，并在上游引物和下游引物中分别引入BamH I和EcoR I酶切位点。
[0102]上游引物45 为:5’ -ATT GGATCC GGA GTA TTG TGG GAT GTC-3’ ；
[0103]下游引物46 为:5’ -ATT GAATTC GAT TGG AGA TCC TGA GGT-3’ ；
[0104]以CAP基因为模板，采用以上两个扩增引物扩增含有BamH I和EcoR I酶切位点的CAP基因片段。随后以BamH I和EcoR I双本酶切CAP基因及pET28a-鼠IgG载体，利用DNA电泳同时回收两种酶切片段，以1:4的摩尔比将载体片段和基因片段用T4DNA连接酶进行连接反应，于16°C反应2小时，取10微升连接产物加入100微升大肠杆菌DH5 α感受态细胞中，静置于冰水混合物中30分钟后于42°C中热激90秒，再于冰水混合物上静置I分钟，加入100微升37°C的SOC培养基，于37°C摇床中温育I小时涂于含有卡那霉素的平板上，放入37°C培养箱中培养过夜，构建得到含鼠检测标签IgG的原核表达质粒(pET28a-CAP-鼠IgG原核表达质粒)。挑取单菌落于含有卡那霉素的LB培养基于37°C培养，采用引物45，46所示的上游引物和下游引物进行PCR鉴定，将阳性结果的菌液提取质粒，将质粒pET28a-CAP-鼠IgG用BamHI和EcoR I双酶切进行酶切鉴定，并最终进行序列分析质粒pET28a-CAP-鼠IgG，最终构建完成的pET28a_CAP_鼠IgG质粒转化于大肠杆菌表达菌株Rosetta中，挑取单克隆菌落于含有卡那霉素的LB培养基中于37°C培养，至菌体OD值达到0.6时用IPTG诱导表达3小时，收集细胞，用TBST (含有I %的Triton)裂解细胞。取20 μ I蛋白上样loading buffer于95°C温度上变性5分钟后，进行SDS-PAGE电泳，转膜后进行Western Blot检测，用鼠二抗反应I小时后，ECL显色，可以清楚检测到目的蛋白的表达。图2是用鼠二抗进行Western Blot的实验图，在该图中可以看到有大小为55KD的蛋白表达带，与本实验中目的蛋白与鼠的IgG融合蛋白理论大小一致，说明目的蛋白已表达成功。其检测原理是通过检测鼠IgG蛋白的表达来间接检测融合蛋白的表达，表达带的大小与理论大小一致说明，目的蛋白与鼠IgG蛋白成功表达产生融合蛋白，也间接证明目的蛋白表达成功。
[0105]实施例2 ；
[0106]本实施例采用P⑶NA3.1/His C真核表达载体。提取鼠的血样，提取总RNA后将其反转录为cDNA。设计1-2所示的上游引物和下游引物，以鼠的cDNA为模板，采用上述扩增引物进行PCR扩增，得到所需的鼠IgG的恒定区基因。以Xho I和Xba I酶切位点双酶切的鼠IgG基因、同时以Xho I和Xba I双酶切P⑶NA3.1/His C载体，利用DNA电泳同时回收两种酶切片段，以1:4的摩尔比将载体片段和基因片段用T4DNA连接酶进行连接反应，于16°C反应2小时，取10微升连接产物加入100微升大肠杆菌DH5a感受态细胞中，静置于冰水混合物中30分钟后于42°C中热激90秒，再于冰水混合物上静置I分钟，加入100微升37°C的SOC培养基，于37°C摇床中温育I小时涂于含有卡那霉素的平板上，放入37°C培养箱中培养过夜，构建得到含鼠检测标签IgG的原核表达质粒(P⑶NA3.1/His C-鼠IgG真核表达质粒)。挑取单菌落于含有氨苄青霉素的LB培养基于37°C培养，采用引物1-2所示的上游引物和下游引物进行PCR鉴定，将阳性结果的菌液提取质粒，将质粒pCDNA3.1/HisC-鼠IgG用Xho I和Xba I双酶切进行酶切鉴定，并最终进行序列分析质粒ρ⑶NA3.1/HisC-鼠IgG将鼠IgG的恒定区基因克隆至pCDNA3.1/His C中，构建得到pCDNA3.1/His C-鼠IgG真核表达载体，并最终进行序列分析，终止密码子在IgG标签末端。
[0107]本实施例中同样采用CAP蛋白作为目的蛋白。在上游引物和下游引物中分别引ABamH I和EcoR I酶切位点。以CAP基因为模板，扩增含有BamH I和EcoR I酶切位点的CAP基因片段。随后以BamH I和EcoR I双酶切CAP基因及pCDNA3.1/His C-鼠IgG表达载体，并连接转化到大肠杆菌DH5 α中，提取质粒，酶切鉴定，测序，将最终构建完成的PCDNA3.1/His C-CAP-鼠IgG质粒转染于293细胞中，48小时后收集细胞，用TBST (含有I %的Triton)裂解细胞，取20 μ I蛋白上样loading buffer于95°C温度上变性5分钟后，进行SDS-PAGE电泳，转膜后进行Western Blot检测，用鼠二抗反应I小时后，ECL显色，可以清楚检测到目的蛋白的表达。图3是直接使用鼠二抗进行的Western Blot实验图，在该图中可以看到有大小为55KD的蛋白表达带，与本实验中目的蛋白大小一致。
[0108]实施例3:[0109]本实施例采用pET28a原核表达载体。提取兔的血样，提取总RNA后将其反转录为cDNA。设计2-3所示的上游引物和下游引物，以兔的cDNA为模板，采用上述扩增引物进行PCR扩增，得到所需的兔IgG的恒定区基因。以Hind III和Xho I双酶切的兔IgG的恒定区基因、同时以Hind III和Xho I双酶切pET28a载体，利用DNA电泳同时回收两种酶切片段，以1:4的摩尔比将载体片段和基因片段用T4DNA连接酶进行连接反应，于16°C反应2小时，取10微升连接产物加入100微升大肠杆菌DH5 α感受态细胞中，静置于冰水混合物中30分钟后于42°C中热激90秒，再于冰水混合物上静置I分钟，加入100微升37°C的SOC培养基，于37°C摇床中温育I小时涂于含有卡那霉素的平板上，放入37°C培养箱中培养过夜，构建得到pET28a-兔IgG表达载体。挑取单菌落于含有卡那霉素的LB培养基于37°C培养，采用3-2所示的上游引物和下游引物进行PCR鉴定，将阳性结果的菌液提取质粒，将质粒pET28a-兔IgG用Hind III和Xho I双酶切进行酶切鉴定，并最终进行序列分析确定兔检测标签IgG成功克隆于表达载体中，终止、码子在IgG标签末端。
[0110]本实施例中同样采用CAP蛋白作为目的蛋白。在上游引物和下游引物中分别引入BamH I和EcoR I酶切位点。以CAP基因为模板，扩增含有BamH I和EcoR I酶切位点的CAP基因片段，以BamH I和EcoR I双酶切CAP基因及pET28a_兔IgG表达载体，利用DNA电泳同时回收两种酶切片段，以1:4的摩尔比将载体片段和基因片段用T4DNA连接酶进行连接反应，于16°C反应2小时，取10微升连接产物加入100微升大肠杆菌DH5 α感受态细胞中，静置于冰水混合物中30分钟后于42°C中热激90秒，再于冰水混合物上静置I分钟，加入100微升37°C的SOC培养基，于37°C摇床中温育I小时涂于含有卡那霉素的平板上，放入37°C培养箱中培养过夜，构建得到含兔检测标签IgG的原核表达质粒(pET28a-CAP-兔IgG原核表达质粒)。挑取单菌落于含有卡那霉素的LB培养基于37 °C培养，采用引物45，46所示的上游引物和下游引物进行PCR鉴定，将阳性结果的菌液提取质粒，将质粒pET28a-CAP-兔IgG用BamH I和EcoR I双酶切进行酶切鉴定，并最终进行序列分析质粒pET28a_CAP_兔IgG，最终构建完成的pET28a-CAP_兔IgG质粒转化于大肠杆菌表达菌株Rosetta中，挑取单克隆菌落于含有卡那霉素的LB培养基中于37 °C培养，至菌体OD值达到0.6时用IPTG诱导表达3小时，收集细胞，用TBST (含有1 %的Triton)裂解细胞，取20 μ l蛋白上样loadingbuffer于95°C温度上变性5分钟后，进行SDS-PAGE电泳，转膜后进行Western Blot检测，用兔二抗反应1小时后，ECL显色，可以清楚检测到目的蛋白的表达。图4是直接使用兔二抗进行Western Blot的实验图，在该图中可以看到有大小为55KD的蛋白表达带,与本实验中目的蛋白大小一致。
[0111]实施例4;
[0112]本实施例采用P⑶NA3.1/His C真核表达载体。提取兔的血样，提取总RNA后将其反转录为cDNA。设计1-3所示的上游引物和下游引物，以兔的cDNA为模板，采用上述扩增引物进行PCR扩增，得到所需的兔IgG的恒定区基因。以Xho I和Xba I酶切位点双酶切兔IgG的恒定区基因、同时以Xho I和Xba I双酶切P⑶NA3.1/His C载体，利用DNA电泳同时回收两种酶切片段，以1:4的摩尔比将载体片段和基因片段用T4DNA连接酶进行连接反应，于16°C反应2小时，取10微升连接产物加入100微升大肠杆菌DH5 α感受态细胞中，静置于冰水混合物中30分钟后于42°C中热激90秒，再于冰水混合物上静置I分钟,加入100微升37°C的SOC培养基，于37°C摇床中温育I小时涂于含有卡那霉素的平板上，放入37°C培养箱中培养过夜，构建得到P⑶NA3.1/His C-兔IgG真核表达载体。挑取单菌落于含有氨苄青霉素的LB培养基于37°C培养，采用引物1-3所示的上游引物和下游引物进行PCR鉴定，将阳性结果的菌液提取质粒，将质粒P⑶NA3.1/His C-兔IgG用Xho I和Xba I双酶切进行酶切鉴定，并最终进行序列分析质粒PCDNA3.1/His C-兔IgG将兔IgG的恒定区基因克隆至pCDNA3.1/His C中，构建得到pCDNA3.1/His C-兔IgG真核表达载体，并最终进行序列分析，终止密码子在IgG标签末端。
[0113]本实施例中同样采用CAP蛋白作为目的蛋白。在上游引物和下游引物中分别引入BamH I和EcoR I酶切位点。以CAP基因为模板，扩增含有BamH I和EcoR I酶切位点的CAP基因片段，以BamH I和EcoR I双本酶切CAP基因及pCDNA3.1/His C-兔IgG载体，并连接转化到大肠杆菌DH5a中，提取质粒，酶切鉴定，测序，将最终构建完成的pCDNA3.1/HisC-CAP-兔IgG质粒转染于293细胞中，48小时后收集细胞，用TBST (含有I %的Triton)裂解细胞，取20 μ l蛋白上样loading buffer于95°C温度上变性5分钟后，进行SDS-PAGE电泳，转膜后进行Western Blot检测，用兔二抗反应1小时后，ECL显色，可以清楚检测到目的蛋白的表达。如图5所示的采用兔二抗进行的Western Blot实验图中，可以看到有大小为55KD的蛋白表达带，与本实验中目的蛋白大小一致。
[0114]综上所述，本发明提供了一种将含有检测标签IgG的表达载体应用于目的蛋白的表达检测方法，该检测过程基于IgG的恒定区基因与相应二抗的特异性结合来实现，不仅操作简单而且具有较高的检测灵敏度和检测准确性。
【权利要求】
1.一种含有检测标签IgG的表达载体，其特征在于，所述检测标签IgG为至少一个种属的IgG的恒定区基因；在表达载体中插入至少一个种属的IgG的恒定区基因得到所述含有检测标签IgG的表达载体。
2.根据权利要求1所述的含有检测标签IgG的表达载体，其特征在于，所述至少一个种属的IgG的恒定区基因包括人IgG的恒定区基因、兔IgG的恒定区基因、鼠IgG的恒定区基因、羊IgG的恒定区基因、马IgG的恒定区基因、牛IgG的恒定区基因、猪IgG的恒定区基因、猴IgG的恒定区基因、鸡IgG的恒定区基因、鸭IgG的恒定区基因、狗IgG的恒定区基因和熊猫IgG的恒定区基因。
3.含有检测标签IgG的表达载体的构建方法，其特征在于，所述检测标签IgG为至少一个种属的IgG的恒定区基因；所述方法包括以下步骤: 51、设计所述至少一个种属的IgG的恒定区基因的上游引物和下游引物； 52、以至少一个种属的cDNA为模板，采用所述上游引物和下游引物进行PCR扩增，得到至少一个种属的IgG的恒定区基因； 53、将所述至少一个种属的IgG的恒定区基因与表达载体连接，构建成含有检测标签IgG的表达载体。
4.根据权利要求3所述的含有检测标签IgG的表达载体的构建方法，其特征在于，在所述步骤S3中，所述表达载体包括pET系列表达载体、GST系列表达载体、pTrxA系列表达载体、pCDNA3.1/His C系列表达载体、pCDNA5/FRT/T0系列表达载体、pEGFP-Nl系列表达载体和pBudce4.1系列表达载体。
5.含有检测标签IgG的表达载体在目的蛋白的表达检测中的应用，其特征在于，所述检测标签IgG为至少一个种属的IgG的恒定区基因；通过所述至少一个种属的IgG的恒定区基因与所述至少一个种属的二抗的直接反应实现所述目的蛋白的表达检测。
6.根据权利要求5所述的含有检测标签IgG的表达载体的应用，其特征在于，包括以下步骤: 获取至少一个种属的IgG的恒定区基因； 构建含有至少一个种属的IgG的恒定区基因的表达载体； 获取目的蛋白基因，并将所述目的蛋白基因连接于含有至少一个种属的IgG的恒定区基因的表达载体； 将连接有目的蛋白基因、且含有至少一个种属的IgG的恒定区基因的表达载体转染于表达菌株中进行诱导培养，收集表达产物；以及 采用所述至少一个种属的二抗进行ECL显色，以检测所述目的蛋白的表达。
7.根据权利要求6所述的含有检测标签IgG的表达载体的应用，其特征在于，获取至少一个种属的IgG的恒定区基因包括: 设计所述至少一个种属的IgG的恒定区基因的上游引物和下游引物； 以至少一个种属的cDNA为模板，采用所述上游引物和下游引物进行PCR扩增，获取至少一个种属的IgG的恒定区基因。
8.根据权利要求6所 述的含有检测标签IgG的表达载体的应用，其特征在于，构建含有至少一个种属的IgG的恒定区基因的表达载体包括: 同时双酶切表达载体和至少一个种属的IgG的恒定区基因；利用DNA电泳同时回收双酶切产生的基因片段和载体片段；以及将所述载体片段和所述基因片段用连接酶进行连接反应，以构建含有至少一个种属的IgG的恒定区基因的表达载体。
【文档编号】C12N15/63GK103898136SQ201210587233
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2012年12月28日 优先权日:2012年12月28日
【发明者】易俊波, 苏庆宁, 买制刚, 卢海蓉, 周兆平, 林枫 申请人:深圳大学