重组人IFN-β-1a及其生产和纯化方法
【专利摘要】本发明提供了编码重组人IFN-β-1a的核酸序列，包含该核酸序列的表达质粒和转染有该质粒的稳定细胞系以及利用该细胞系大规模生产重组人IFN-β-1a的发酵方法。使用所述发酵方法生产重组人IFN-β-1a的产量可达60.52mg/L，比活为282,000MIU/mg。此外，本发明还提供了从稳定细胞系获得高纯度的人重组IFN-β-1a的的纯化方法，纯化后的重组人重组IFN-β-1a蛋白的纯度在98%以上，且具有同市售商品化人重组IFN-β-1a相当的体外活性。相对于以往的纯化方法，本发明的纯化方法保持了蛋白样品的活性，简化了后续的纯化步骤，并可以获得更高的产率，更适于工业的大规模生产。
【专利说明】重组人IFN-PHa及其生产和纯化方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物制品【技术领域】，涉及一种重组人IFN-β-1a稳定细胞系的构建、重组人IFN-β -1a的大规模生产及其纯化。
【背景技术】
[0002]1957年,英国病毒生物学家Alick Isaacs和瑞士研究人员Jean Lindenmann在利用鸡胚绒毛尿囊膜研究流感干扰现象时了解到，病毒感染的细胞能产生一种因子，后者作用于其他细胞，干扰病毒的复制，故将其命名为干扰素(IFN)。1966-1971年，Friedman发现了干扰素的抗病毒机制，引起了人们对干扰素抗病毒作用的关注。而后，干扰素的免疫调控及抗病毒作用、抗增殖作用以及抗肿瘤作用逐渐被人们认识(A.Yabrov.Medical Hypotheses,Vo15，Issue7:769-797，1n Bresser.Biochimie, Vo189，Issue6_7:723-728)。[0003]目前在人类身上共发现α、β、Y三种类型的干扰素:α型干扰素(IFN-α)是由白细胞产生的(Wolf Peter Hofmann et.Al, Journal of Clinical Virology,Vol32, Issue2:86-91) ；β型干扰素(IFN-β )是由成纤维细胞(纤维母细胞)产生的；Y型干扰素是(IFN-Y)由免疫系统中的T细胞和自然杀伤细胞产生的(Alfons Billiauet.al, Cytokin&Growth Factor Reviews, Vol20, Issue2, 97-113)。人干扰素 β ( β 型人干扰素)是一种天然的可溶糖蛋白。有广泛的生物学活性，如抗病毒、抗增殖及免疫调节作用(Robert J.Fox, TREND in Immunology, Vol25, N0.12:632-636)。
[0004]多发性硬化症(Multiple Sclerosis)是中枢神经系统和免疫有关的发炎及去髓鞘(demyelinatin)疾病。可引起各种症状，包括感觉改变、视觉障碍、肌肉无力、忧郁、协调与讲话困难、严重的疲劳、认知障碍、平衡障碍、体热和疼痛等，严重的可以导致活动性障碍和残疾。欧美地区为该疾病的高发区，是年轻人除了外伤之外导致神经障碍最常见的疾病(G.Rosati，Neurol Sci (2001) 22:117-139)。近年来，随着诊断水平的提高以及对该病认识程度的增加，亚洲国家如日本、中国等，多发性硬化症的发病率呈现上升趋势(吉良润一，中华神经科杂志，2009年6月，第42卷，第6期，422-424)。由于我国人口基数巨大，因此国内市场对于有效药物的需求庞大。
[0005]目前，多发性硬化症在临床上难以治愈，但是免疫调节疗法在缓解疾病症状以及预防疾病的反复发作方面效果显著。常用的免疫调节药物包括重组人干扰素β(IFN- β )，合成小妝 Glatiramer 乙酸盐及单抗药物 Natalizumab (Oliver Neuhauset.al, Journal of Neurological Sciences259 (2007):27-37)。根据多年的临床试验结果表明，重组人IFN-β不仅可以降低复发缓解型多发性硬化症患者的急性发作次数，而且还能有效延迟复发缓解型和继发缓解型多发性硬化症患者的病程进展(Ayman Tourbahet.al，Biochimie, Vol89:899-902)。人IFN-β用于多发性硬化症的治疗，主要是通过以下作用方式:一为抗病毒作用；二为抑制生长、诱导凋亡的作用；三为免疫调节的作用。目前，重组人IFN-β为治疗多发性硬化症的一线用药。主要的商品包括Merck Serono公司生产的Rebif ;以及Biogen Idec公司生产的Avonex ;仅此两个药品在2010年的销售额就达到47亿美元，市场前景非常巨大。
[0006]IFN-β -1a
[0007]IFN-β由166个氨基酸组成，相对分子质量为20Κ Da，是一种糖蛋白，由两个单海藻糖的寡糖链组成(Conradt et.al, Journal of Biological Chemistry,Vol262，14600-14605)。糖基化对其可溶性有重要作用，用糖肽酶F处理后，IFN-β发生沉淀。在大肠杆菌中表达的IFN-β也由于缺少糖基化而在折叠中产生错误。经人工改造过的可以在大肠杆菌中表达的突变型IFN-β，被称为IFN-13-lb，而天然形式的IFN-β称为IFN-β-la。IFN-β-1b的N端减少一位氨基酸，并且17位氨基酸由半胱氨酸突变为丝氨酸，这种人工改造的突变体虽然可以在大肠杆菌中表达，但是却缺乏糖基化修饰，活性仅为天然形式IFN-β-1a的十分之一(Rudick RA et.al, Experimental CellResearch, 317 (2011): 1301-1311)。天然形式IFN-β-1a通常使用真核细胞进行表达，如人胚肾细胞ΒΗΚ21，小鼠结缔组织纤维细胞LTK，中国仓鼠卵巢细胞CHO等(Reiser Wet.at, Drug Research, 37 (I):482-485 ；Chernajovsky et.al, DNA, Vol3, 297-308 ；InnisMA et.al, Methods Enzymol, 1986:397-403)。
[0008]美国专利US4966843公开了一种人IFN-β -1a表达载体，以及利用这种载体在CHO细胞中表达人IFN-β -la，但该方法得到的表达量仅为2.2mg/L。另外，W02007/022799专利也公开了一种生产人IFN-P-1a的方法，该方法得到的稳定细胞系在反应器中仅能得到20mg/L的产量；其在生物反应器中采用了微载体的培养方法，该方法对微载体及血清的消耗非常巨大，增加了生产成本；同时，该方法在生产中采用了三步降温的方式，在实际生产过程中操作繁琐；另外，在生长期向生产期转换过程中需要对生长期血清进行冲洗，不可避免的造成终产物的 血清残留；再次，微载体的生产方法对于工业化生产的规模放大比较困难。
[0009]IFN-β-1a 的纯化
[0010]已有一些文章和专利报道了 IFN-β-1a的纯化方法，如亲和色谱(U.S.Pat.N0.4，278，661，U.S.Pat.N0.4，289，689 和 U.S.Pat.N0.4，521，952)，可控多孔玻璃色谱(U.S.Pat.N0.4，359，389，U.S.Pat.N0.5，066，786 和 U.S.Pat.N0.5，244，665)，金属螯合色谱(U.S.Pat.N0.5，244，665，U.S.Pat.N0.4，257，938，U.S.Pat.N0.4，359，389 和 U.S.Pat.N0.4，541,952)常被用于IFN-β-1a的样品捕获；而阳离子色谱(CIEX)和反相色谱(RP-HPLC)常被用于IFN-β -1a的中度纯化；分子排阻色谱(SEC)常被用于IFN-β -1a的精细纯化(U.S.Pat.N0.0, 305，669 和 U.S.Pat.N0.0, 93，649)。
[0011]在亲和层析色谱中，Blue Sepharose FF由于其良好的分辨率和较高的动态载量被更多地用于IFN-P-1a的样品捕获。在使用Blue Sepharose FF对IFN-进行纯化时，往往需要使用有机溶剂如乙二醇、丙二醇或者利用降低缓冲液的PH值对样品进行洗脱；并在应用下一步柱层析前需要对洗脱样品进行透析换液以去掉有机溶剂或者提高洗脱溶液的PH值。但是在从高浓度的有机溶剂透析入低浓度有机溶剂，或者从低pH换液进入高pH时，IFN-13-la会不稳定，甚至会造成活性的丧失(Y.K.Tan et al.，J.Biol.Chem.，1979，254:8067-8073)。另外，在中度纯化过程中，一些专利(U.S.Pat.N0.0, 305，669，U.S.Pat.N0.0, 093，649等)利用了 RP-HPLC对样品进行纯化，并使用有机溶剂如乙腈、乙醇等对样品进行洗脱，而在纯化过程中反复使用有机溶剂有可能会对样品IFN-β-1a的活性产生影响。
[0012]因此，本领域需要高产率、便捷、低成本地生产和高活性地纯化重组人IFN-P-1a的方法。
【发明内容】
[0013]本发明的目的是提供一种表达重组人IFN-β -1a的稳定细胞系，并大规模生产和纯化重组人IFN-β-la。
[0014]因此，第一方面，本发明提供了一种核酸，其编码人IFN-13-la且包含SEQ ID N0.1所示的核酸序列。
[0015] 特别地，本发明还提供了包含所述核酸的表达质粒和用所述表达质粒转染的哺乳动物细胞系。
[0016]第二方面，本发明提供了构建表达重组人IFN-P-1a的稳定哺乳动物细胞系的方法，所述方法包括；
[0017]使用G418硫酸盐进行筛选并选择甲氨蝶呤(MTX)加压扩增系统，其中MTX的浓度为 10-?000ηΜ，优选为 10~20ηΜ，例如 10ηΜ、15ηΜ 或 20ηΜ ；
[0018]其中，所述重组人IFN-β -1a由所述核酸编码。
[0019]第三方面，本发明提供了大规模生产重组人IFN-P-1a的方法，其中所述方法使用表达重组人IFN-β -1a的稳定哺乳动物细胞系，且所述方法包括:
[0020]使用具有双层滤网的旋转过滤器的生物反应器，滤网的孔径为5 μ m-?ο μ m,例如5μπι、8μπι和10 μ m，优选使用5μπι和10 μ m组成的双层滤网，通过双层滤网截留细胞，收获发酵液。
[0021]第四方面，本发明还提供了纯化哺乳动物细胞系表达的重组人IFN-13_la的方法，所述方法依次使用亲和层析色谱、金属离子螯合色谱和阳离子交换色谱对重组人IFN-P-1a进行纯化。
[0022]现通过以下实施方式并且结合附图来进一步描述本发明，应理解，这些实施方式仅用于例证的目的，不限制本发明的范围，同时本领域普通技术人员根据本发明所做的显而易见的改变和修饰也包含在本发明范围之内。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1为XOGC-1fn β Ia质粒构建流程图。
[0024]图2为PCR扩增SEQ ID N0.1所示的重组人IFN- β -1a编码序列的结果，泳道1:DNA分子量标记；泳道2为PCR扩增的重组人IFN- β -1a序列。
[0025]图3为PCR和酶切鉴定阳性XOGC-1fn β Ia质粒的结果，泳道1:DNA分子量标记；泳道2:PCR扩增的结果；泳道3:酶切鉴定结果。
[0026]图4为从中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表达产物中制备具有高纯度的重组人IFN-β-1a的纯化工艺的一个【具体实施方式】的流程图。
[0027]图5为使用亲和色谱柱Blue Sepharose6Fast Flow对前期处理过的CHO发酵液进行纯化后所得的洗脱曲线图。
[0028]图6为使用金属锋离子螯合色谱柱IMAC HP-Zinc对Blue Sepharose6Fast Flow的洗脱液进行纯化所得的洗脱曲线图。
[0029]图7为使用强阳离子交换色谱柱Source S对IMAC-Zinc洗脱液进行纯化所得的洗脱曲线图。
[0030]图8为使用SDS-PAGE对所得的IFN-β -1a蛋白样品的纯度检测结果。
[0031]图9为使用RP-HPLC对所得的IFN-β -1a蛋白样品的纯度检测结果。
[0032]图10为对所得IFN-β -1a蛋白样品进行体外抗增殖活性实验的测定结果。
[0033]图11为使用所得的IFN-β -1a蛋白样品进行体外抗病毒活性实验的测定结果。
[0034]图12 为 SEQ ID N0.1、2 和 3 的序列。
【具体实施方式】
[0035]本发明的第一方面提供了一种核酸，其编码人IFN-β -1a且包含SEQ ID N0.1所示的核酸序列。
[0036]特别地，本发明还提供了包含所述核酸的表达质粒和用所述表达质粒转染的哺乳动物细胞系。
[0037]所述表达质粒可以是任何适用于在哺乳动物细胞系中进行目的蛋白的表达的表达质粒，包括 pcMV、 pEGFP、pcDNA、pUB6、pVAX 和 XOGC 等，优选 X0GC。
[0038]所述哺乳动物细胞系可以是任何经修饰以表达IFN-P-1a的哺乳动物细胞，包括动物细胞和人细胞，任选分泌表达IFN-β -1a的动物细胞，例如3Τ3细胞、COS细胞、人骨肉瘤细胞、MRC-5细胞、BHK细胞，VERO细胞、包括CH0/DG44 (dhfr_)的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、CHO-S细胞、HEK293细胞、常人纤维母细胞、基质细胞、肝细胞和PER.C6细胞等。优选地，所述细胞为CHO细胞，更优选为CH0/DG44 (dhfr_)细胞系。
[0039]本发明的第二方面提供了构建表达重组人IFN-P-1a的稳定哺乳动物细胞系的方法，所述方法包括:
[0040]使用G418硫酸盐进行筛选并选择甲氨蝶呤(MTX)加压扩增系统，其中MTX的浓度为 10-?000ηΜ，优选为 10~20ηΜ，例如 ΙΟηΜ、15ηΜ 或 20ηΜ ；
[0041]其中，所述重组人IFN-β -1a由包含SEQ ID N0.1的核酸序列编码。
[0042]在一个实施方式中，其中使用XOGC作为表达质粒，使用CH0/DG44(dhfr_)细胞系作为宿主细胞系。
[0043]本发明的第三方面提供了大规模生产重组人IFN-P-1a的方法，其中所述方法使用表达重组人IFN-β -1a的稳定哺乳动物细胞系，且所述方法包括:
[0044]使用具有双层滤网的过滤器的生物反应器，通过双层滤网截留细胞，收获发酵液，其中所述滤网的孔径为5 μ m-ΙΟ μ m,例如5μηι、8μηι或10 μ m,优选使用5μηι和10 μ η!组成的双层滤网。
[0045]在一个实施方式中，所述大规模生产重组人IFN-β -1a的方法还包括:
[0046]在大规模生产前将表达重组人IFN-β -1a的稳定哺乳动物细胞系进行无血清悬浮适应培养，并使最初的贴壁细胞适应无血清悬浮生长。
[0047]在一个实施方式中，采用直接降低血清的方法进行无血清悬浮适应培养。例如，向贴壁细胞中直接加入无血清培养基，在37°C、5%C02的细胞培养箱里静置培养，待2至3天后，部分细胞在培养基中悬浮起来，将此部分细胞收集起来，放入三角摇瓶中，在摇床上震荡培养。
[0048]在一个实施方式中，无血清悬浮适应也可以采用逐步降低血清的方法。例如，将血清浓度由最初的10%，逐步下降至5%，2%，1%，0.5%，0.1%，至最终为0%，每个血清浓度适应3至5代次，待细胞恢复至正常生长状态即可下降至下一个浓度。经过无血清悬浮适应后的细胞，其活力应保持在95%以上，倍增时间在20至30小时左右。
[0049]在一个实施方式中，在大规模生产重组人IFN-P-1a的过程中使用的培养液为无血清培养液。
[0050]在一个实施方式中，所述生物反应器为改造的生物反应器，即在其原有滤筒的基础上再加上一层不锈钢滤网，其孔径为5 μ m-10 μ m,例如5 μ m、8 μ m和10 μ m,优选为5 μ m。
[0051]在一个实施方式中，所述大规模生产重组人IFN-β -1a的方法还包括:
[0052]采用灌注培养的方式，每天灌注体积为f 10倍罐体积，优选f 1.5倍罐体积；
[0053]生产的过程包括两个阶段，第一阶段为生长期，在37°C温度下进行，第二阶段为生产期，温度低于37°C，优选在30°C温度下进行。
[0054]在一个实施方式中，所述大规模生产重组人IFN-β -1a的方法还包括:
[0055]在所述第二阶段生产期，培养液中加入浓度为0.rimM的丁酸钠，例如浓度为0.lmM、0.3mM 或 ImM，优选 0.3mM 的丁酸钠。
[0056]在一个实施方式中，其中所述温度降低为连续降温，如每半小时降0.5°C，如降低至小于37。。，如33°C或30°C。
[0057]在一个实施方式中，在大规模生产重组人IFN-P-1a的过程中将细胞培养液的pH控制在7.1至7.4之间。所述控制可以通过例如加入7.5%的NaHCO3溶液实现。
[0058]在一个实施方式中，在大规模生产重组人IFN-P-1a的过程中向细胞培养液中加入消泡剂。
[0059]所述消泡剂可以为适用于重组人IFN-β -1a的生产的任何消泡剂，例如anti foamSE-15 (Sigma, A8582-500P)。
[0060]在一个实施方式中，在生长期时细胞培养液的溶氧(DO)为40-60%，例如约50% ;在生产期时细胞培养液的溶氧(DO)为20~40%，例如约30%。
[0061]在一个实施方式中，在生产期降低培养液中的葡萄糖和谷氨酰胺浓度，例如将浓度降低为生长期使用的培养液的25~50%，例如降低为50%，如将葡萄糖和谷氨酰胺的浓度分别降为2g/L和0.15g/L。
[0062]在一个实施方式中，在细胞生长期的中后期即活细胞密度达到30X105时，开始补加植物蛋白水解物并随着密度的增加逐步增加其浓度，由起始的lg/L提高到3g/L。
[0063]在一个实施方式中，在细胞密度为20X105时开始灌注。起初以0.2WV (工作体积)的速率开始灌注，之后每天逐步提 高0.2WV的灌注速率，当活细胞密度达到140X105时灌注速率达1.5WV/天，在活率大于95%时开始降温将细胞转入生产期。进入生产期的第三天，活细胞密度达到最高值200-250X105时，逐步调低灌注速率。为使细胞密度和活率长期维持最高值，最低灌注速率为IWV/天。在生产的中后期活细胞密度开始减少、活率下降，逐步降低灌注速率，当活细胞密度小于100X105、活率低于70%时停止该批次培养。
[0064]在一个实施方式中，所使用的表达重组人IFN-P-1a的稳定哺乳动物细胞系为本发明第二方面获得的细胞系。[0065]在一个实施方式中，其还包括纯化所述重组人IFN-β -la。
[0066]在一个实施方式中，所述纯化可以按照如下所述的纯化方法来进行。
[0067]本发明的第四方面提供了纯化哺乳动物细胞表达的重组人IFN-β-1a的方法，所述方法包括依次使用亲和层析色谱、金属离子螯合色谱和阳离子交换色谱对重组人IFN-P-1a进行纯化。
[0068]在一个实施方式中，所述纯化方法包括:
[0069]1)应用亲和层析色谱对经过前期处理后的IFN-β -1a进行纯化；
[0070]2)应用金属离子螯合色谱对亲和层析色谱的洗脱液进行纯化；
[0071]3)应用阳离子交换色谱对IFN-β -1a进行进一步的纯化。
[0072]在一个实施方式中，所述纯化还包括:
[0073]将金属离子螯合色谱的洗脱液进行稀释。
[0074]在一个实施方式中，所述纯化还包括将含有IFN-β -1a的细胞上清进行过滤、浓缩、换液的前期处理。
[0075]在一个实施方式中，在亲和层析色谱和金属离子螯合色谱之间不需要置换缓冲液、调整pH。
[0076]在一个实施方式中,所使用的亲和层析色谱填料为Blue Sepharose系列,优选为Blue Sepharose6Fast Flow。
[0077]在一个实施方式中，所使用的金属离子螯合色谱填料为IMAC Sepharose系列，优选为 IMAC Sepharose High Performance。
[0078]在一个实施方式中，所述金属离子螯合色谱填料所螯合的金属离子包括Cu2+、Me2+、Zn2+、N1.和 Fe3+，优选为 Zn2+。
[0079]在一个实施方式中，所用的阳离子交换色谱填料为强阳离子性离子交换吸附剂，优选磺丙基型。
[0080]在一个实施方式中，将所述亲和层析色谱的洗脱组分直接进行金属离子螯合色谱。例如，中间不需要置换缓冲液、调整pH。
[0081]更具体地，本发明所述的纯化方法是指在IFN-β-1a样品的捕获阶段和中度纯化阶段分别使用亲和层析色谱和金属离子螯合色谱进行纯化，并且中间没有透析换液步骤；然后应用阳离子色谱对金属离子螯合色谱的洗脱液进行精细纯化，不需要调整PH即可上样。
[0082]在本发明中，对含有IFN-P-1a的细胞上清进行前期处理主要是指:将细胞上清用孔径为0.45微米的微滤膜包(Sartorius Stedim biotech)进行过滤；然后用孔径为5KDa的超滤膜包(Sartorius Stedim biotech)进行浓缩及透析换液,并使换液后IFN-P-la的浓度小于0.5mg/ml。此过程中所应用的缓冲液为磷酸缓冲液，pH范围可以为7.0-7.6，优选为7.4 ;样品经透析换液处理后调整NaCl浓度为0.8-1.2M，优选为1M，调整盐浓度所用母液为5M NaCl ;调整完样品的NaCl浓度后，对样品进行离心，转速范围为5000-10000rpm，时间范围为20-40分钟，优选为7000rpm，30分钟。
[0083]在本发明中，对含有IFN-P-1a的细胞上清进行前期处理后，应用亲和层析色谱Blue Sepharose6Fast Flow对含IFN-β-1a的样品进行纯化。纯化过程包括层析柱的平衡、上样、杂质蛋白的洗脱以及含IFN-P-1a样品的洗脱过程，缓冲液为磷酸缓冲液，pH范围为7.0-7.6，优选为7.4。 平衡缓冲液为含有IMNaCl的磷酸缓冲液，平衡过程应不少于3个柱体积，流速为50-80cm/hr ;样品上样流速为50-80cm/hr，上样结束后，用平衡缓冲液冲洗2-4个柱体积，优选为3个柱体积；杂质洗脱缓冲液I为含有2M NaCl的磷酸缓冲液，洗脱过程为1-3个柱体积,优选为2个柱体积，洗脱流速为50-80cm/hr ;杂质洗脱缓冲液II为含有IM NaCl,25-35%乙二醇(优选30%乙二醇)的磷酸缓冲液，洗脱过程为1_3个柱体积，优选为2个柱体积，洗脱流速为50-80cm/hr ;IFN_ β -1a的蛋白洗脱缓冲液为含有2M NaCl,40-60%乙二醇(优选50%乙二醇)的缓冲液，洗脱过程为1.5-2.5个柱体积，优选为2个柱体积，洗脱流速为30-60ml/min。
[0084]在本发明中，样品经Blue Sepharose6Fast Flow纯化后,将含IFN-β-1a的洗脱组分用金属离子螯合色谱进行纯化。纯化过程主要包括:将含IFN-P-1a的洗脱组分混合后泵入层析柱中，洗去杂蛋白，然后用线性PH梯度洗脱目的蛋白。色谱柱的平衡缓冲液为含有0.5-1M NaCl (优选为IM NaCl)的磷酸缓冲液，pH范围为7.0-7.6，优选为7.4 ;上样结束后，用平衡缓冲液冲洗两个柱体积，然后用PH范围为5.8-6.2、含IM NaCl的醋酸缓冲液洗脱杂质蛋白，洗脱过程为1-3个柱体积，优选为2个柱体积；目的蛋白的洗脱液为含IM NaCl的醋酸缓冲液，以线性pH梯度对含IFN-β -1a的组分进行洗脱，pH梯度范围为
6.0-4.0，梯度长度为8-15个柱体积。
[0085]在本发明中，所用的金属离子螯合色谱的基质可为IMAC-HP (GE)，也可为Metal-Chelating Sepharose Fast Flow(GE),优选为 IMAC-HP。螯合过程中所用的金属离子可为 Cu2+、Me2+、Zn2+、Ni+、Fe3+，优选为 Zn2+。
[0086]在本发明中，经过金属离子螯合色谱纯化后收集的含IFN-β -1a的洗脱组分可经降低NaCl浓度，然后用于后续的阳离子色谱纯化。在此过程中可应用稀释、凝胶色谱换液、透析等方法以降低样品中NaCl的浓度。经过处理后的含IFN-P-1a的组分在常温下电导应低于25ms/cm,优选为低于20ms/cm。
[0087]在本发明中，应用阳离子色谱纯化经金属离子螯合色谱纯化后的含IFN-β -1a的洗脱组分。所用缓冲液为含有1-20%乙二醇的磷酸缓冲液，磷酸缓冲液浓度为5-20mM，pH范围为5.0-6.0，优选为5.5。A相缓冲液为不含有NaCl的磷酸缓冲液，B相缓冲液含有IMNaCl的磷酸缓冲液。用线性梯度对含IFN- β -1a的组分进行洗脱，线性梯度范围为0_70%Β，优选为10-60%Β，更优选为20-50%Β，最优选为20_50%Β。梯度长度为10-30个柱体积。
[0088]在本发明中，所用的强阳离子色谱为Sourcel5S、Source30S、SP Sepharose HP,优选为 Sourcel5S。
[0089]在本发明中，阳离子色谱纯化操作所在的环境温度应低于10°C，优选为4°C。
[0090]在一个实施方式中，所述表达重组人IFN-P-1a的哺乳动物细胞系是由本发明的构建表达重组人IFN-β -1a的稳定细胞系的方法获得的。
[0091]在一个实施方式中，其中所述表达重组人IFN-13_la的哺乳动物细胞系为CHO/DG44 (dhfr-)细胞系，所述细胞系转染了表达包含SEQ ID N0.1所示的核酸序列的表达质粒。
[0092]在一个实施方式中，所述质粒为X0GC。
[0093]在一个实施方式中，用于所述大规模生产重组人IFN-P-1a的方法中的所述表达人IFN-β -1a的稳定细胞系可以为任何表达重组人IFN-β -1a的哺乳动物细胞系。[0094]在一个实施方式中，所述表达重组人IFN-β -1a的稳定细胞系是表达重组人IFN-P-1a 的 CHO 克隆。
[0095]在一个实施方式中，所述方法还包括对重组人IFN-β-1a抗病毒活性的测定。所述测定方法可以是使用人肺癌细胞系(Α549)及脑心肌炎病毒(EMCV)，通过测定Α549细胞的增殖来检测干扰素抗EMCV病毒的活性。
[0096]在一个具体的实施方式中，本发明涉及:
[0097]I)构建一种XOGC-1fn β Ia的载体，该载体构建的流程如图1所示，主要包括:
[0098] 1-1)优化的适用于CHO细胞的重组人IFN-β -1a的编码基因(SEQ ID N0.1)；CH0细胞为中国仓鼠卵巢来源的细胞系，相对于来源于人的IFN-13_la的编码基因，经过优化的基因序列更加适合CHO细胞闻效的表达目的蛋白；
[0099]1-2)通过PCR的方法将上述基因扩增，并利用Hind III和EcoR I限制酶识别位点将重组人IFN-β -1a的编码基因连接到表达质粒XOGC中，得到表达质粒XOGC-1fn β la。
[0100]2)使用XOGC-1fn β Ia表达质粒转染CH0/DG44 (dhfr-)细胞，并使用G418筛选标记筛选稳定整合细胞，之后利用MTX作为基因扩增的筛选标记，基因扩增后目的蛋白表达量得到了有效的提高，人IFN-β -1a的表达水平提高了约200倍，目的基因的快速、有效扩增为表达量提高提供有力保障，也使得基因扩增所消耗的时间减少；最后通过单克隆化的过程得到稳定表达重组人IFN-β -1a的细胞系，细胞系表达水平最高为7mg/L。
[0101]3)将稳定细胞系使用无血清培养基进行悬浮适应培养，并使最初的贴壁细胞适应无血清悬浮生长，表达水平最高可达17mg/L，且倍增时间约20小时，倍增时间的缩短将有利于提闻生广效率。
[0102]4)在生物反应器中利于悬浮培养的方式进行重组人IFN-β -1a的生产，主要包含以下方面:
[0103]4-1)开创性的使用一种双层的滤筒，这样处理过的滤筒在灌注培养中的细胞截留率达到97%以上，显著的减少了活细胞的浪费，为生产期时长期维持高的活细胞密度提供了重要的基础；
[0104]4-2)使用无血清培养基，降低生产成本,减少终产品的血清残留；
[0105]4-3)分两个阶段进行生产，第一阶段为生长期，使用37°C培养条件；第二阶段为生产期，连续降温至30°C，并在生产培养基中加入0.3mM浓度的丁酸钠；
[0106]4-4)收获重组人IFN-β-1a的产量可达60mg/L，表达水平高，非常有利于大规模工业化的生产重组人IFN-β -la。
[0107]上述优点表明，使用XOGC-1fn β Ia的载体转染CH0/DG44细胞，经过筛选加压得到单克隆细胞株，在生物反应器中进行大规模生产，可以获得重组人IFN-β-1a的产量达到60.52mg/L，产量高于现有报道水平；比活性达到282，000MIU/mg,高于商品化产品Rebif(272，000MIU/mg)。因此，成功得到了可以高表达重组人IFN-β-1a的稳定细胞系，并应用于大规模生产。
[0108]进一步地，本发明提供了一种改进的重组人IFN-P-1a的纯化方法，在利用BlueSepharose FF对样品进行初步纯化以后,不需要进行透析换液,直接将Blue Sepharose FF的洗脱液利用金属螯合色谱进行纯化。这样不仅省去了透析换液的步骤，精简了工艺，提高了收率，而且在金属螯合色谱上样前后样品的PH没有变化，有利于保持IFN-P-1a的稳定性和活性。同时在本发明所提出的方法中，样品经过金属螯合色谱纯化以后，应用了阳离子色谱作为IFN-P-1a的精细纯化方法。在本发明中，从金属螯合色谱洗脱下来的样品，在酸性的PH环境中，不需要调整pH，即可用于阳离子色谱的纯化，从而最大程度地保证了IFN-β -1a样品的稳定性和活性。应用本发明提出的制备方法，所获得的IFN-β -1a经反相色谱和SDS-PAGE鉴定的纯度在97%以上，活性与市场化的IFN-β -1a相当，并且内毒素亦可满足药典的要求。因此本方法可用于规模制备重组人IFN-β -la。
[0109]通过以下实施例中更好地理解本发明，然而这些实施例仅为举例说明，而不应被认为是对本发明的限制。
[0110]如无特别说明，在以下实施例中所用原料均为市售产品。
[0111]实施例
[0112]以下通过实施例对本发明作进一步的说明，但本发明并不限于此。
[0113]实施例中所使用的试剂及仪器:
[0114]试剂:
[0115]1.PCR 扩增 IOXbuffer, New England Biolabs, M0273V ；
[0116]2.酶切 IOXEcoR buffer, New England Biolabs, ROlOlV ；
[0117]3.连接 IOX Ligation buffer, New England Biolabs, M0202V ；
[0118]4.连接酶 Ligase, New England Biolabs, M0202V ；
[0119]5.Wizard plus SV Minipreps 质粒提取试剂盒，Promega;
[0120]6.Lipofectamine2000 转染试剂，Invitrogen, 11668019;
[0121]7.培养基 a-MEM, SAFC, 51451C;
[0122]8.10% 透析胎牛血清，Gibco, 30067-334;
[0123]9.G418, Cellgro, 61-234RG;
[0124]10.甲氨蝶呤 MTX，Sigma，M-8407;
[0125]11.培养基 SFM4-CH0，Hyclone, SH3O^8.04;
[0126]12.培养基 Excel 1-CH0，SAFC，63225C ;
[0127]13.培养基 Lonza2, Lonza, CD PR02 ；
[0128]14.培养基 1640，Gibco, 22400-089 ；
[0129]15.ELISA 试剂盒，Human IFN-beta ELISA 试剂盒，R&D，41410-2 ；
[0130]16.1FN- β -1a 蛋白 Rebif, Merck Serono 公司；
[0131]仪器:
[0132]1.5L 生物反应器，Sartorius, Bplus twin5L ；
[0133]2.微滤膜包系统，Sartorius ；
[0134]3.超滤系统，Sartorius, Cross flow Systerm ；
[0135]4.AKTA explorerlOO 型蛋白纯化系统，GE Healthcare, AKTA (C) 1480077 ；
[0136]5.亲和层析色谱柱，GE Healthcare, Blue Sepharose6Fast Flow (16mm 1.D.,30ml)；
[0137]6.金属离子螯合色谱柱，GE Healthcare, IMAC Sepharose High Performance(16mm 1.D., 30ml)；
[0138]7.阳离子色谱柱，GE Healthcare, Sourcel5S (10mm 1.D., 15ml);[0139]8.C02 培养箱，Thermo fisher，Heracell 150i。
[0140]实施例1.编码人IFN- β -1a的核苷酸序列的密码子优化
[0141]成熟的人IFN- β -1a多肽序列来源于NCBI蛋白质数据库参考序列(NCBIReference Sequence:NP_002167),具体序列如下:
[0142]mtnkcllqia lllcfsttal smsynllgfI qrssnfqcqk llwqlngrle yclkdrmnfdipeeikqlqq fqkedaalti yemlqnifai frqdssstgw netivenlla nvyhqinhlk tvleeklekedftrgklmss lhlkryygri lhylkakeys hcawtivrve ilrnfyfinr ltgylrn
[0143]优化后的编码序列如SEQ ID N0.1所示。
[0144] 实施例2.重组质粒XOGC-1fn β Ia的构建
[0145]重组质粒XOGC-1fn β Ia的构建流程如图1所示。
[0146]1.优化的人IFN-β-1a编码序列(SEQ ID N0.1)由南京金斯瑞公司合成，产物以pUC57-1fn β Ia质粒的形式交付。
[0147]以pUC57-1fn@Ia重组质粒为模板，用 ifnP la-F(SEQ ID N0.2)和 ifnP Ia-RCSEQID N0.3)为引物进行PCR扩增。反应体系为H2034.7 μ 1，10Xbuffer(New England Biolabs公司的 M0273V)6y l，lmM dNTP12 μ 1，10 μ M ifn β la_F3 μ 1，10 μ M ifn β la_F3 μ 1，TaqDNA聚合酶 0.3 μ l，pUC57-1fnP Ia质粒 I μ I。扩增条件为:94°C 2min ；94°C 30s, 50°C 30s,72°C 30s，共30个循环；94°C 5min。如图2所示，扩增产物大小为585bp，经琼脂糖凝胶回收后溶于30 μ I无菌水中，并储藏在-20°c备用。
[0148]2.人IFN-β -1a编码序列的酶切、连接和转化大肠杆菌
[0149]上述PCR扩增所用引物带有Hind III和EcoR I限制酶识别位点，将扩增回收的产物进行酶切反应，反应体系为:Η20 6 μ I, IOXEcoR buffer (New England Biolabs公司的R0101V) 2μ 1，Hind III I μ 1，EcoR I I μ 1，由上述制备的扩增产物10 μ I。反应条件为:37°C3hr。用同样的体系和条件酶切2yg XOGC表达载体。反应结束后用琼脂糖电泳胶回收经酶切的基因片段和表达载体，分别溶于30 μ I无菌水。
[0150]将表达载体和基因片段进行连接，反应体系为:Η204μ 1，IOXLigation buffer(New England Biolabs公司的M0202V)2 μ 1，酶切回收的基因片段10 μ 1，酶切回收的XOGC表达载体 3 μ I,Ligase (New England Biolabs 公司的 M0202V) I μ I。室温放置 2hrs。将连接产物电转化大肠杆菌感受态细胞ToplO，涂布于含有氨苄青霉素50 μ g/ml的LB平板，37 °C倒置培养过夜。
[0151]3.重组质粒XOGC-1fn β Ia的鉴定
[0152]挑取在含有氨苄青霉素50 μ g/ml的LB上生长的阳性菌落至含有氨苄青霉素50μg/ml的5ml LB液体培养基，37°C、180rpm振荡培养过夜。按照Wizard plus SVMinipreps质粒提取试剂盒(Promega)操作说明提取质粒,并进行PCR和酶切鉴定,反应体系和条件与上述扩增和酶切人IFN-P-1a编码序列的条件相同，结果如图3所示。将鉴定结果正确的克隆进一步进行DNA测序。测序结果无误的质粒用于哺乳动物细胞的转染。
[0153]实施例3.CH0/DG44(dhfr-)细胞的培养、转染及筛选、加压
[0154]1.CH0/DG44 (dhfr-)细胞培养
[0155]CH0/DG44 (dhfr-)细胞为 DHFR 缺陷型的 CHO 细胞(以下简称为 CH0/DG44 (dhfr-)或CH0/DG44)，细胞复苏之后传2-3代，当其存活率达到95%时，可以用于转染实验。[0156]2.细胞转染
[0157]利用Lipofectamine2000 转染试剂(Invitrogen, 11668019)按照说明书进行 CHO/DG44细胞的转染。具体地，将质粒5ug和a -MEM培养基3mL在一个离心管中混合，同时在另一个离心管里混合转染剂20uL和a -MEM培养基3mL。在洁净工作台里室温静置5分钟后将上述稀释的质粒和转染剂混合，继续静置30分钟。然后轻柔的将6mL混合物加入75cm2的细胞培养方瓶(含汇合度为70-80%的CH0/DG44细胞)中，然后将方瓶置于37°C、5%C02的细胞培养箱里培养。培养过夜之后，移去转染试剂混合物，加入新鲜培养基α-ΜΕΜ(SAFC, Cat.N0.51451C)，并添加 10% 透析胎牛血清(Gibco, Cat.N0.30067-334)。然后将方瓶置于37°C、5%C02的细胞培养箱里培养f 2天。之后将新鲜培养基中加入lmg/mL G418(Cellgro, Cat.N0.61-234RG)，以此培养基对细胞进行培养，持续2周时间。
[0158]3.扩增目的基因拷贝数以提高蛋白表达水平
[0159]使用含甲氨蝶呤(MTX，Sigma, Cat.N0.M-8407)的选择培养基来培养细胞。一般以IOnM MTX为起始浓度。传代5次之后检测目的蛋白的表达水平。在此过程中，监控细胞生长状态，包括细胞数、活率、倍增时间、细胞直径等。细胞生长状态恢复正常之后进行20nMMTX的加压。当目的蛋白表达水平不再提高之后，不再继续提高MTX的加压浓度。
[0160]在此过程中，使用ELISA的方法检测人IFN- β -1a的表达量，并且使用抗病毒增殖的方法检测(可参见实施例10的方法)人IFN- β -1a的活性，结果如表1所示。
[0161]表1.不同的混合细胞库中人IFN-β -1a的表达量及活性
[0162]
【权利要求】
1.核酸，其编码人IFN-β-1a且包含SEQ ID N0.1所示的核酸序列。
2.表达质粒,其中包含权利要求1所述的核酸。
3.如权利要求2所述的表达质粒，其包括pcMV、pEGFP、pcDNA、pUB6、pVAX、XOGC,优选为 XOGC。
4.用权利要求2或3所述的表达质粒转染的哺乳动物细胞系。
5.如权利要求4所述的细胞系，其中，所述细胞系选自3T3细胞、COS细胞、人骨肉瘤细胞、MRC-5细胞、BHK细胞、VERO细胞、包括CH0/DG44 (dhfr_)的中国仓鼠卵巢细胞(CH0)、CHO-S细胞、HEK293细胞、常人纤维母细胞、基质细胞、肝细胞和PER.C6细胞中的一种，优选为中国仓鼠卵巢细胞(CH0)，更优选为CH0/DG44 (dhfr_)细胞系。
6.—种构建表达重组人IFN-P-1a的稳定哺乳动物细胞系的方法，所述方法包括； 使用G418硫酸盐进行筛选并选择甲氨蝶呤(MTX)加压扩增系统，其中MTX的浓度为10-?000ηΜ，优选为 10~20ηΜ，例如 ΙΟηΜ、15ηΜ 或 20ηΜ ； 其中，所述重组人IFN-P-1a由权利要求1所述的核酸编码。
7.如权利要求6所述的方法，其中使用XOGC作为表达质粒，使用CH0/DG44(dhfr_)细胞系作为宿主细胞系。
8.大规模生产重组人IFN-P-1a的方法，其中所述方法使用表达重组人IFN-β-1a的稳定哺乳动物细胞系，且所述方法包括: 使用具有双层滤网的过滤器的生物反应器，通过双层滤网截留细胞，收获发酵液，其中所述滤网的孔径为5 μ m-10 μ m,例如5 μ m、8 μ m或10 μ m,优选使用5 μ m和10 μ m组成的双层滤网。
9.如权利要求8所述的方法，其中，所述方法还包括: 在大规模生产前将表达重组人IFN-β -1a的稳定哺乳动物细胞系进行无血清悬浮适应培养，并使最初的贴壁细胞适应无血清悬浮生长。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述悬浮适应培养可以通过直接加入无血清培养液或者逐步降低血清的方法而进行。
11.如权利要求8至10中任一项所述的方法，其中在大规模生产重组人IFN-0-la的过程中使用的培养液为无血清培养液。
12.如权利要求8至11中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括: 采用灌注培养的方式，每天灌注体积为广10倍罐体积，优选广1.5倍罐体积； 生产的过程包括两个阶段，第一阶段为生长期，在37°C温度下进行，第二阶段为生产期，温度低于37°C，优选在30°C温度下进行。
13.如权利要求8-12中任一项所述的方法，其中所述表达重组人IFN-P-1a的稳定细胞系为权利要求4或5所述的细胞系或由权利要求6或7所述的方法获得的细胞系。
14.纯化哺乳动物细胞表达的重组人IFN-β-1a的方法，其包括依次使用亲和层析色谱、金属离子螯合色谱和阳离子交换色谱对重组人IFN- β -1a进行纯化。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述纯化还包括: 将金属离子螯合色谱的洗脱液进行稀释。
16.如权利要求14或15所述的方法，其中，在亲和层析色谱和金属离子螯合色谱之间不需要置换缓冲液和调整pH。
17.如权利要求14-16中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞系为权利要求6或7所述的方法获得的或为权利要求4或5所述的细胞系。
18.如权利要求8-13所述的方法，其还包括一个纯化步骤，所述纯化步骤是按照权利要求14-17中任一 项所述的方法进行的。
【文档编号】C12R1/91GK103898123SQ201210587363
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2012年12月28日 优先权日:2012年12月28日
【发明者】宋楠萌, 涂祁鹏, 杜伯雨, 张磊, 薛剑峰, 刘家望, 赵娟, 金孟燮 申请人:北京韩美药品有限公司