一种重组肠激酶的制备方法
【专利摘要】本发明一种重组肠激酶的制备方法属于生物【技术领域】。本发明提供了包含肠激酶基因的表达载体和工程菌，还提供了肠激酶的制备方法，包括培养工程菌、收获工程菌菌体、破碎得包涵体、洗涤和溶解包涵体、复性、酶原活化及纯化肠激酶的步骤。本发明的方法是重组肠激酶制备工艺成熟、质量稳定、纯度高、成本低，适合药用蛋白生产。
【专利说明】一种重组肠激酶的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，具体涉及一种重组肠激酶的制备方法。
【背景技术】
[0002]肠激酶(Enterokinase, EK)是存在于哺乳动物十二指肠内的一种异源二聚体丝氨酸蛋白酶(EC3.4.21.9)。天然肠激酶分子量为150kDa，由I条115kDa重链和I条35kD轻链组成，重链负责在消化道细胞膜上的锚定以及与肠激酶融合蛋白的结合，轻链具有催化活性，可以特异性识别Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列并在其羧基端切割,将肠激酶融合蛋白活化为肠激酶，从而启动消化道内各种酶原活化的级联反应。
[0003]由于肠激酶识别位点的特异性和切割后在目标蛋白N末端不留任何氨基酸残基，而且可以在pH 4.5~9.5、温度4~45°C范围内特异性水解蛋白底物，因此它已经成为基因工程制药领域融合蛋白切割的的首选工具酶，广泛应用于各种重组蛋白、多肽药物的加工成熟。天然的肠激酶来源有限，需从动物组织分离提取，因为从动物组织提取的肠激酶易残留其他的蛋白酶，对融合蛋白的产生降解；另外，来源于动物组织的肠激酶可能带有未知病毒等动物源性污染，为药物蛋白生产增加了额外的风险。通过基因工程的方法生产的肠激酶轻链，具有天然肠激酶的全酶活性和特异性，在融合蛋白切割中被广泛应用。已有报道的重组肠激酶轻链多为实验室级别，存在大量宿主蛋白残留、镍离子残留和其他杂质，而且作为原辅料进行药物蛋白生产时，其残留不能被有效检测和控制，对药用蛋白的生产中增加许多风险。
【发明内容】
[0004]本发明提供一种重组肠激酶的制备方法，以克服现有技术中重组肠激酶轻链多为实验室规模制备，存在大量宿主蛋白残留、镍离子残留和其他杂质的技术缺陷。
[0005]本发明的思路是这样的:通过合成N端带有肠激酶酶切位点的基因，连接到pET-32a(+)质粒中硫氧还蛋白后,在大肠杆菌宿主细胞内融合表达,表达的融合蛋白经外加少量肠激酶后，启动自切割，从而生产具有正确结构的重组肠激酶轻链，分子量约为35KD，含有活性重组肠激酶(35KD)的溶液经阴离子交换层析、阳离子交换层析和疏水层析和冷冻干燥后，可得高纯度、适合药用蛋白生产的重组肠激酶产品。
[0006]发明人经过大量创造性劳动或得了本发明。
[0007]本发明所要解决的技术问题之一是:提供一种包含肠激酶基因的表达载体。
[0008]本发明所要解决的技术问题之二是:提供一种包含肠激酶基因的工程菌。
[0009]本发明所要解决的技术问题之三是:提供一种重组肠激酶的制备方法。
[0010]因此，本发明的技术方案如下: [0011]1.一种包含肠激酶基因的表达载体，其特征在于肠激酶基因序列为Seq ID N0.1。
[0012]2.根据1的表达载体，其特征在于，肠激酶基因Seq ID N0.1插入质粒pET_32a (+)的BglII和XhoI酶切位点之间。[0013]3.一种包含肠激酶基因的工程菌，其包含I或2所述的表达载体。
[0014]4.一种包含肠激酶基因的工程菌，其特征在于，由将2所述的表达载体转化大肠杆菌BL21DE3而获得。
[0015]5.一种重组肠激酶的制备方法，包括如下步骤:
[0016](I)培养3所述的包含肠激酶基因的工程菌并诱导肠激酶基因表达；
[0017](2)收集菌体；
[0018](3)破碎菌体；
[0019](4)收集包涵体，洗涤包涵体；
[0020](5)包涵体复性；
[0021](6)肠激酶原活化；和，
[0022](7)活性肠激酶的纯化。
[0023]6.一种重组肠激酶的制备方法，包括如下步骤:
[0024](I)培养4所述的包含肠激酶基因的工程菌并诱导肠激酶基因表达；
[0025](2)收集菌体；
[0026](3)破碎菌体；
[0027](4)收集包涵体，洗涤包涵体；
[0028](5)包涵体复性；
[0029](6)肠激酶原活化；和，
[0030](7)活性肠激酶的纯化。
[0031]7.根据5或6任一所述的重组肠激酶的制备方法，其特征在于:步骤(1)培养包含肠激酶基因的工程菌并诱导肠激酶基因表达，具体为:接种重组工程菌阳性克隆到LB培养基中，于25-37°C下摇床振荡培养过夜，按1-10%接种量接过夜菌于LB培养基中，37°C下摇床振荡培养到对数期，按1-10%接种量接种到装有发酵培养基的发酵罐中，调节搅拌转速与通气量以维持溶氧在35%以上，发酵培养基配方如下:酵母浸出粉30g/L，葡萄糖6g/L,十二水合磷酸氢二钠8g/L,磷酸二氢钾4g/L,硫酸铵6g/L,七水硫酸镁1.13g/L, 二水氯化钙0.073g/L，补料培养基:酵母浸出粉20g/L，葡萄糖30g/L，50%氨水和30%磷酸用于发酵过程中PH调控，当培养基中养分耗尽，溶氧迅速上升时开始补料，调节补料速度、转速、通气控制溶氧在30%以上，补料4h后，降温至23°C，调节pH至7.0,加入终浓度为
0.1-0.5mmol/L的IPTG进行有氧诱导，继续培养6h放罐。
[0032]8.根据5或6任一所述的重组肠激酶的制备方法，其特征在于:步骤(1)培养包含肠激酶基因的工程菌并诱导肠激酶基因表达，具体为:接种重组工程菌阳性克隆200 μ I到20ml的LB培养基中，于30°C下摇床振荡培养过夜，按4%接种量接过夜菌于500ml的LB培养基中，37°C下摇床振荡培养到对数期，接种到装有6L发酵培养基的发酵罐中，初始参数为:发酵温度37°C，搅拌速度200rpm，通气量15L/min，pH为6.7，调节搅拌转速与通气量以维持溶氧始终在35 %以上，发酵培养基如下:酵母浸出粉30g/L，葡萄糖6g/L，十二水合磷酸氢二钠8g/L，磷酸二氢钾4g/L，硫酸铵6g/L，七水硫酸镁1.13g/L，二水氯化钙0.073g/L，补料培养基:酵母浸出粉20g/L，葡萄糖30g/L，50%氨水和30%磷酸用于发酵过程中pH调控；当培养基中养分耗尽，溶氧迅速上升时开始补料，通过控制泵的转速合理控制补料速度，控制溶氧在30%以上，补料4h后，降温至23°C，调节pH至7.0，加入终浓度为0.3mmol/L的IPTG进行有氧诱导，控制溶氧不低于20 %，6h后出罐。
[0033]9.根据5或6任一所述的肠激酶的制备方法，其特征在于，步骤(3)破碎菌体的缓冲液为 25mmol/L Tris-HCl+5mmol/L EDTA, PH7.5。
[0034]10.根据5或6任一所述的肠激酶的制备方法，其特征在于，步骤⑷中洗涤包涵体的缓冲液为2mol/L尿素+1.5% Triton。
[0035]11.根据5或6任一所述的肠激酶的制备方法，其特征在于，步骤(5)包涵体复性的缓冲液为 0.2mol/L 尿素 +1OmmoI/LEDTA+25mmoI/L Tis-HCL, GSH: GSSG = ImmoI/L: 0.3mmol/L, PH10。
[0036]12.根据5或6任一所述的肠激酶的制备方法，其特征在于，步骤(6)肠激酶原活化的条件是经肠激酶在室温下酶解2-10小时，肠激酶/肠激酶原重量比为1/200。
[0037]13.根据5或6任一所述的肠激酶的制备方法，其特征在于，步骤(7)活性肠激酶的纯化依次包括阴离子层析纯化、阳离子层析纯化和疏水层析纯化步骤。
[0038]所述的“收集菌体”的方法包括但不限于离心包括连续离心、过滤等。[0039]所述的“破碎菌体”的方法，包括但不限于高压匀浆、渗透压冲击、冻融、超声波破碎等。
[0040]所述的“收集包涵体”的方法，包括但不限于离心。
[0041]所述的“洗涤包涵体”的方法，包括但不限于包涵体用纯化用书或者合适的缓冲液重悬、离心、再重悬离心等2~3个循环操作。
[0042]包涵体变性和复性的方法可以按照本领域的技术人员公知的方法进行。
[0043]本发明所说的肠激酶融合蛋白基因是指与牛肠激酶轻链基因序列的一致的cDNA序列，通过检索genebank数据库获得其序列，Seq ID N0.1,其中1-6位为BglII酶切位点，734-739位为XhoI酶切位点。
[0044]重组肠激酶轻链的氨基酸序列，Seq ID N0.2。，经肠激酶切除1_5位的DDDDK后，才变为有活性的肠激酶轻链。
[0045]本发明所述的肠激酶原和肠激酶融合蛋白有同样的含义，其需要进一步经过酶切活化后才有肠激酶活性。
[0046]优选地,本发明肠激酶原(肠激酶融合蛋白)为Seq ID N0.2序列和硫氧还蛋白融合蛋白。
[0047]本发明的重组肠激酶的制备方法可大规模生产的肠激酶轻链，制备的肠激酶具有天然肠激酶的全酶活性和特异性，可被广泛应用融合蛋白切割中。
【专利附图】
【附图说明】
[0048]图1重组质粒构建与酶切验证图。肠激酶(rEK)基因通过Bglll/Xhol酶切位点插入到质粒 pET-32a(+) ；line I 为 pET_32a(+)rEK ;line 2 为 pET_32a(+)rEK 的 BglII 和XhoI酶切片断；line 3为分子量标准(kb)。
[0049]图2重组肠激酶工程菌基因测序图谱。
[0050]图3重组肠激酶工程菌生长曲线图。
[0051]图4重组肠激酶工程菌表达，其中Linel为一级种子，Line2为二级种子，Line3为诱导前，Line4为出罐全菌。[0052]图5重组肠激酶工程菌破碎后电泳图，其中Linel为出罐全菌，Line2为破碎后上清，Line3为破碎后沉淀。
[0053]图6肠激酶融合蛋白酶切图，其中Linel为分子量标准，Line2为肠激酶原，Line3为肠激酶原酶切2Hr，Line4为肠激酶原酶切10Hr。
[0054]图7肠激酶Q-FF纯化洗脱峰。
[0055]图8肠激酶Q-FF纯化洗脱峰SDS-PAGE电泳，其中Linel为阴离子交换柱层析前，Line2为洗脱峰l，Line3为洗脱峰2，Line4为洗脱峰3，Line5为洗脱峰4，Line6为洗脱峰5。
[0056]图9肠激酶Generic-SP纯化洗脱图。
[0057]图10肠激酶Generic-SP纯化电泳图,其中其中Linel为阳离子交换柱层析前，Line2为洗脱峰l，Line3为洗脱峰2，Line4为洗脱峰3，Line5为洗脱峰4，Line6为洗脱峰5。
[0058]图11肠激酶Phenyl-FF纯化洗脱图。
[0059]图12肠激酶Phenyl-FF纯化后电泳图，其中其中Linel为疏水柱层析前，Line2为洗脱峰1，Line3为洗脱峰2，Line4为洗脱峰3。
[0060]图13重组牛肠激酶酶切反应，其中Linel为分子量标准，Line2为底物Thioredoxin-NP-27 融合蛋 白，Line3 为 0.0008 单位 EK 反应后，Line4 为 0.0015 单位 EK反应后，Line5为0.003单位EK反应后，Line6为0.008单位EK反应后，Line7为0.015单位EK反应后，Line8为0.03单位EK反应后。
【具体实施方式】
[0061]以下结合具体实施例详细说明本发明，这些具体实施例均为说明性的，不以任何方式限制本发明的保护范围。
[0062]在以下具体实施例中，除有特别说明的之外，按照本领域技术人员熟知的技术手册的教导或者试剂、设备提供商的说明书进行之。本领域的技术人员按照这些教导并结合本发明的公开的内容可以实现本发明。
[0063]实例I工程菌构建
[0064]通过合成得到以上序列cDNA，通过Bglll/Xhol酶切位点插入到质粒pET_32a(+)(购自invitrogen)相应酶切位点中，构建成的重组质粒构建图与酶切后电泳图如图1所示。插入肠激酶轻链基因的重组质粒pET-32rEK通过化学转化法转化到宿主大肠杆菌BL2KDE3)中，构建重组肠激酶工程菌。经测序(图2)，工程菌中的序列与设计一致。
[0065]实例2:工程菌高密度发酵
[0066]重组工程菌发酵，接种重组工程菌阳性克隆200 μ I到20ml的LB培养基中，于30°C下摇床振荡培养过夜，按4%接种量接过夜菌于500ml的LB培养基中，37°C下摇床振荡培养到对数期，接种到装有6L培养基的发酵罐中，初始参数为:发酵温度37°C，搅拌速度200rpm,通气量15L/min，pH为6.7，不断提高搅拌转速与通气量(转速最大900rpm，通气量最大30L/min)以维持溶氧始终在35%以上，培养基配方如下:
[0067]发酵培养基:酵母浸出粉30g/L，葡萄糖6g/L，十二水合磷酸氢二钠8g/L，磷酸二氢钾4g/L，硫酸铵6g/L，七水硫酸镁1.13g/L，二水氯化钙0.073g/L,补料培养基:酵母浸出粉20g/L，葡萄糖30g/L，50%氨水和30%磷酸用于发酵过程中pH调控。
[0068]发酵数小时后，当培养基中养分耗尽，溶氧迅速上升时开始补料，通过控制泵的转速合理控制补料速度，同时在补料速度、转速、通气三者的合理控制下，保证控制溶氧在30%以上。补料4h后，降温至23°C，调节pH至7.0，加入终浓度为0.3mmol/L的IPTG进行有氧诱导(即保证溶氧不低于20% )6h后出罐。
[0069] 出罐后离心得菌体湿重160g/L，发酵过程中菌体生长曲线及相关取样点电泳如图
3、图4所示。
[0070]实例3肠激酶纯化
[0071] 发酵结束离心收集的菌体按重量体积比1: 10加入破碎缓冲液(25mmol/LTris-HCl+5mmol/LEDTA, PH7.5)，高压均质机800bar破碎后收集沉淀和上清电泳如图5。
[0072]将沉淀按重量体积比1: 10加入洗涤缓冲液(2mol/L尿素+1.5% Triton)，室温磁力搅拌I小时，离心收集的沉淀用洗涤缓冲液洗涤两次。再用包涵体溶解缓冲液(8mol/L尿素+10mmol/LEDTA+25mmol/L Tis-HCL, PH7.5)按重量体积比1: 10溶解过夜。溶解后的包涵体经离心、超滤去除杂质后，稀释到蛋白浓度0.2mg/ml，在复性缓冲液(0.2mol/L尿素+10mmol/LEDTA+25mmol/L Tis-HCL, GSH: GSSG= lmmol/L: 0.3mmol/L，PH10)中，4°C复性过夜，复性后的肠激酶融合蛋白经肠激酶(I: 200)在室温下酶解2小时后即可得到具有活性的粗酶液(如图4所示)。粗酶液分别经阴离子层析(Q-FF)纯化、阳离子层析(Generic-SP)纯化、疏水层析(Phenyl-FF)纯化和冷冻干燥后，可获得高纯度重组肠激酶，分别见图6、图7、图8、图9、图10、图11和图12所示。
[0073]实例3肠激酶活力测定方法
[0074]重组肠激酶的活力测定按每个反应含有15 μ g的Thioredoxin_NP-27和不同活力单位的肠激酶。在25°C经过16小时的反应后用SDS-PAGE胶检测酶切效果，如图13所示。
[0075]活性单位定义:
[0076]在25°C，8小时内将0.5毫克的Thioredoxin-NP-2795%降解为NP-27所需要的酶量定义为I个活性单位。
【权利要求】
1.一种包含肠激酶基因的表达载体，其特征在于肠激酶基因序列为Seq ID N0.1。
2.根据权利要求1的表达载体，其特征在于，肠激酶基因SeqID N0.1插入质粒pET-32a(+)的BglII和XhoI酶切位点之间。
3.一种包含肠激酶基因的工程菌，其包含权利要求1或2所述的表达载体。
4.一种包含肠激酶基因的工程菌，其特征在于，由将权利要求2所述的表达载体转化大肠杆菌BL21DE3而获得。
5.一种重组肠激酶的制备方法，包括如下步骤: (1)培养权利要求3所述的包含肠激酶基因的工程菌并诱导肠激酶基因表达； (2)收集菌体； (3)破碎菌体； (4)收集包涵体，洗涤包涵体； (5)包涵体复性； (6)肠激酶原活化；和， (7)活性肠激酶的纯化。
6.一种重组肠激酶的制备方法，包括如下步骤: (1)培养权利要求4所述的包含肠激酶基因的工程菌并诱导肠激酶基因表达； (2)收集菌体； (3)破碎菌体； (4)收集包涵体，洗涤包涵体； (5)包涵体复性； (6)肠激酶原活化；和， (7)活性肠激酶的纯化。
7.根据权利要求5或6任一所述的重组肠激酶的制备方法，其特征在于:步骤(1)培养包含肠激酶基因的工程菌并诱导肠激酶基因表达，具体为:接种重组工程菌阳性克隆到LB培养基中，于25-37°C下摇床振荡培养过夜，按1-10%接种量接过夜菌于LB培养基中，.37°C下摇床振荡培养到对数期，按1-10%接种量接种到装有发酵培养基的发酵罐中，调节搅拌转速与通气量以维持溶氧在35%以上，发酵培养基配方如下:酵母浸出粉30g/L，葡萄糖6g/L，十二水合磷酸氢二钠8g/L，磷酸二氢钾4g/L，硫酸铵6g/L，七水硫酸镁1.13g/L，二水氯化钙0.073g/L，补料培养基:酵母浸出粉20g/L，葡萄糖30g/L，50%氨水和30%磷酸用于发酵过程中PH调控，当培养基中养分耗尽，溶氧迅速上升时开始补料，调节补料速度、转速、通气控制溶氧在30%以上，补料4h后，降温至23°C，调节pH至7.0，加入终浓度为 .0.1-0.5mmol/L的IPTG进行有氧诱导，继续培养6h放罐。
8.根据权利要求5或6任一所述的重组肠激酶的制备方法，其特征在于:步骤(1)培养包含肠激酶基因的工程菌并诱导肠激酶基因表达，具体为:接种重组工程菌阳性克隆 .200 μ I到20ml的LB培养基中，于30°C下摇床振荡培养过夜，按4%接种量接过夜菌于 .500ml的LB培养基中，37°C下摇床振荡培养到对数期，接种到装有6L发酵培养基的发酵罐中，初始参数为:发酵温度37°C，搅拌速度200rpm，通气量15L/min，pH为6.7，调节搅拌转速与通气量以维持溶氧始终在35%以上，发酵培养基如下:酵母浸出粉30g/L，葡萄糖6g/L，十二水合磷酸氢二钠8g/L，磷酸二氢钾4g/L，硫酸铵6g/L，七水硫酸镁1.13g/L，二水氯化钙0.073g/L，补料培养基:酵母浸出粉20g/L，葡萄糖30g/L，50%氨水和30%磷酸用于发酵过程中PH调控；当培养基中养分耗尽，溶氧迅速上升时开始补料，通过控制泵的转速合理控制补料速度，控制溶氧在30%以上，补料4h后，降温至23°C，调节pH至7.0，加入终浓度为0.3mmol/L的IPTG进行有氧诱导，控制溶氧不低于20%，6h后出罐。
9.根据权利要求5或6任一所述的肠激酶的制备方法，其特征在于，步骤(3)破碎菌体的缓冲液为 25mmol/L Tris-HCl+5mmol/L EDTA, PH7.5。
10.根据权利要求5或6任一所述的肠激酶的制备方法，其特征在于，步骤(4)中洗涤包涵体的缓冲液为2mol/L尿素+1.5% Triton。
11.根据权利要求5或6任一所述的肠激酶的制备方法，其特征在于，步骤(5)包涵体复性的缓冲液为 0.2mol/L 尿素+10mmol/LEDTA+25mmol/L Tis-HCL, GSH: GSSG=Immol/L: 0.3mmol/L, PH10。
12.根据权利要求5或6任一所述的肠激酶的制备方法，其特征在于，步骤(6)肠激酶原活化的条件是经肠激酶在室温下酶解2-10小时，肠激酶/肠激酶原重量比为1/200。
13.根据权利要求5或6任一所述的肠激酶的制备方法，其特征在于，步骤(7)活性肠激酶的纯化依次 包括阴离子层析纯化、阳离子层析纯化和疏水层析纯化步骤。
【文档编号】C12N15/57GK103898145SQ201210585576
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2012年12月31日 优先权日:2012年12月31日
【发明者】文良柱, 梅丽, 朱亮 申请人:江苏万邦生化医药股份有限公司, 上海复星医药（集团）股份有限公司