一组pcr引物对及以其鉴别天南星的方法
【专利摘要】本发明提供一组PCR引物对，其上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ?ID?NO.1和SEQ?ID?NO.2所示。本发明还提供以所述引物鉴别天南星的方法，包括包括如下步骤：1）提取待鉴定样品的DNA；2）以步骤1）提取的DNA为模板，使用上述引物对进行PCR扩增；3）对步骤2）的PCR扩增产物进行电泳，检测出条带的待测样品鉴定为天南星。本发明提供了通过分子生物学快速鉴别天南星的方法，操作简单，鉴定准确，可广泛推广。
【专利说明】—组PCR引物对及以其鉴别天南星的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子标记【技术领域】，特别是涉及一组PCR引物对及以其鉴别天南星的方法。
【背景技术】
[0002]植物天南星，为中药天南星的一个来源。2010版药典记载，其干燥块茎为天南星入药，具有散结消肿的功效，临床药理研究也表明天南星有抗肿瘤、抗惊厥、抗心律失常、抗菌抗炎、抗氧化、镇静镇痛等作用，于临床及中成药合成中应用广泛。半夏，天南星科植物，其块茎为中药半夏，有毒，2010版药典记载，有燥湿化痰，降逆止呕，消痞散结的功效，临床药理作用研究亦表明，半夏有镇咳、镇吐、催吐、镇静催眠、祛痰、抗溃疡、抗心律失常、抗凝、抗早孕、凝血、抑制腺体分泌等作用。
[0003]天南星和半夏，在形态学以及功效作用上都有相似之处，且天南星科植物资源丰富，品种繁多，传统形态学很难对其准确鉴别。
【发明内容】
[0004]为了解决传统形态学很难准确鉴别天南星和半夏的问题，本发明提供一组PCR引物对及以其鉴别天南星的方法。
[0005]发明人利用叶绿体matK序列对提取的天南星与半夏DNA进行PCR扩增及测序，并对序列进行拼接及比对、数据处理，建立了 Neighbor-Joining Tree (NJ树)。发明人通过观察NJ树鉴别开了天南星和半夏，并设计出能特异性鉴别天南星的PCR引物。
[0006]本发明提供的一组PCR引物对，其核苷酸序列为:
[0007]上游引物:5’-ACAATGATCCAATCATTGGAA-3’(核苷酸序列如 SEQ ID N0.1 所示)
[0008]下游引物:5’-TTATGTAGTTGAATGCGAATCC-3’(核苷酸序列如 SEQ ID N0.2 所示)。
[0009]本发明还提供以所述引物鉴别天南星的方法，包括如下步骤:
[0010]I)提取待鉴定样品的DNA ；
[0011]2)以步骤I)提取的DNA为模板，使用上述引物对进行PCR扩增；
[0012]3)对步骤2)的PCR扩增产物进行电泳，检测出条带的待测样品鉴定为天南星。
[0013]其中，步骤2)所述PCR的反应体系为25 μ I体系:
[0014]ddH208.5 μ I ；
[0015]Taq PCR Mix12.5μ I ；
[0016]引物1/1μ1;
[0017]模板DNA2 μ I。
[0018]其中，步骤2)所述 PCR 的反应条件为 94°C Imin ；94°C 30s,50°C 20s,72°C 50s, 35个循环；72°C 5min。
[0019]本发明还提供所述方法在天南星鉴别中的应用。
[0020]本发明提供了能特异性鉴别天南星的引物和以该引物鉴定天南星的方法。该方法简便易行，可以快速、准确的鉴别开天南星和半夏，适于广泛推广应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1所示为实施例1中matK-1QM3F/lR引物PCR扩增天南星和半夏的电泳检测图。
[0022]图2所示为实施例1中基于K2P距离法建立的天南星和半夏NJ树。
[0023]图3所示为实施例2基于K2P距离法建立市售10份天南星和半夏样品NJ树。
[0024]图4所示为实施例3使用特异性引物鉴别市售天南星样品电泳检测图。
[0025]其中，Tl-Tll为天南星，BX1-BX12为半夏，M为DNA Marker, CK为空白阴性对照。
【具体实施方式】
[0026]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0027]实施例1天南星与半夏NJ树建立
[0028]I样品来源
[0029]本实施例采用的天南星与半夏分别收集自陕西、云南、湖南、北京等地。
[0030]2DNA 提取 [0031]每个样品分别取30mg，加入灭菌小钢珠，用DNA提取研磨仪(Retsch MM400,Germany)磨成粉末,利用试剂盒法提取DNA。试剂盒购自TianGen公司，型号为植物基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)200preps。
[0032]3PCR 扩增
[0033]PCR反应引物为:
[0034]matK-KIM3F: 5 ’-CGTACAGTACTTTTGTGTTTACGAG-3 ’(核苷酸序列如 SEQ ID N0.3 所示)
[0035]matK-KMlR:5’-ACCCAGTCCATCTGGAAATCTTGGTTC-3’(核苷酸序列如 SEQ ID N0.4
所示)。
[0036]PCR反应体系以25 μ I计为:
[0037]ddH208.5 μ I ;
[0038]Taq PCR Mix12.5 μ I ；
[0039]matK-1QM3F/lR 引物1/1 μ I ;
[0040]DNA 模板2 μ I。
[0041]其中，Taq PCR Mix采购自艾德莱2XTaq PCR Mix，引物为诺赛公司合成。
[0042]PCR 反应条件为:94°C Imin ；94°C 30s、52°C 20s、72°C 50s, 35 个循环；72°C 5min。
[0043]图1为天南星和半夏matK序列PCR扩增电泳检测图，显示DNA扩增成功，可以测序。
[0044]4 测序
[0045]运用ABI3730测序仪(ABI公司)对PCR产物进行直接测序。
[0046]5序列拼接、比对、处理
[0047]运用生物信息学软件CodonCode Aligener进行序列拼接，MEGA5.05进行序列比对、建立NJ树。
[0048]图2为基于K2P距离法建立的天南星和半夏matK序列NJ树，可明显看出天南星和半夏都分在不同的支上，可以明显的鉴别开。
[0049]实施例2运用matK序列鉴别市售天南星和半夏样品
[0050]I样品来源
[0051 ] 本实施例采用的天南星和半夏样品搜集自市场上销售的中药天南星和半夏。
[0052]2DNA 提取
[0053]每个样品分别取30mg，加入灭菌小钢珠，用DNA提取研磨仪(Retsch MM400,Germany)磨成粉末,利用试剂盒法提取DNA。试剂盒购自TianGen公司，型号为植物基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)200preps。
[0054]3PCR 扩增
[0055]PCR反应体系以25 μ I计为:
[0056]
【权利要求】
1.一组PCR引物对，其核苷酸序列为: 上游引物:5 ’ -ACAATGATCCAATCATTGGAA-3， 下游引物:5’ -TTATGTAGTTGAATGCGAATCC-3’。
2.以权利要求1所述引物鉴别天南星的方法，包括如下步骤: 1)提取待鉴定样品的DNA； 2)以步骤I)提取的DNA为模板，使用上述引物对进行PCR扩增； 3)对步骤2)的PCR扩增产物进行电泳，检测出条带的待测样品鉴定为天南星。
3.根据权利要求2所述鉴别天南星的方法，其特征在于，步骤2)所述PCR的反应体系为25 μ I体系: ddH208.5 μ I ; Taq PCR Mix12.5μ I ； 引物ι/?μL; 模板 DNA2 μ 1
4.根据权利要求2所述鉴别天南星的方法，其特征在于，步骤2)所述PCR的反应条件为 94°C Imin ；94°C 30s,50°C 20s,72°C 50s，35 个循环；72°C 5min。
5.权利要求2-4任一项所述鉴别天南星的方法在天南星鉴别中的应用。
【文档编号】C12N15/11GK103993009SQ201310051910
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2013年2月17日 优先权日:2013年2月17日
【发明者】黄林芳, 陈士林, 郑司浩 申请人:中国医学科学院药用植物研究所