专利名称：鉴别欧洲牛肝菌近缘种的分子特异性标记引物及方法
技术领域：
本发明涉及一种鉴别欧洲牛肝菌近缘种B.appendiculatus和B.subappendiculatus的分子特异性标记引物，以及ー种利用该引物对欧洲牛肝菌近缘种B.appendiculatus 和 B.subappendiculatus 进行快速辨别的方法。
(ニ)
背景技术：
隶属牛肝菌目Boletales 下 Boletus 属的 Appendiculati Konrad&Maubl.exLannoy&Estades 群包括 Jf B.appendiculatus Schaeff.:Fr.、B.subappendiculatus
Dermek,Lazebn.&J.Vcsclskv, B.fechtneri Velen.、B.pseudoregius(Huber)Estades 和
B.regius Krombh.五个Boletus种。这五个近缘种均起源于欧洲,其共同特征为子实体的菌柄上或多或少有网纹，全菌柄呈一致黄色，菌管和菌孔经常变蓝；菌肉变蓝或不变蓝，但ロ尝总具温和口感；许多种在菌柄基部呈现些许粉红色。对近缘种B.appendiculatus 与 B.subappendiculatus 标本辨别的典型特征是B.subappendiculatus不同于B.appendiculatus,其菌肉暴露在空气中不变蓝，或微弱变蓝，或有时部分变蓝；菌孔受伤不变蓝，反而变暗；菌盖米色、赭(黄)色；B.subappendiculatus的担孢子的平均长宽比大于3。此外，在生境上不同，B.subappendiculatus生长在针叶林下。宏观上的颜色差异和变色反应是辨别这ニ个近缘种的主要特征， 微观上的担孢子大小仅作为次级辨别特征。尽管颜色差异和变色反应是辨别这ニ个近缘种的主要手段，但由于易受生境、气候、土壌、子实体生长期、生理状况等的影响而常常导致主观判别上的偏差，而对于长期保藏的干标本，特别是古老标本、模式标本的重新鉴别研究，仅凭颜色、宏观形态特征更是难以准确鉴定。因此，在大型真菌分类研究上，分子技术已成为了对标本辅助鉴定的重要手段。真菌的核糖体基因rRNA的内转录间隔区(Internal Transcribed Spacer, ITS)区段的保守性基本上表现为种内相对一致，种间差异比较明显，这ー特点使得ITS区段不仅适合于属内物种间或种内差异较明显的菌群间的系统发育关系分析，而且非常适合于真菌物种的分子鉴定。对B.appendiculatus和B.subappendiculatus的ニ种的ITS测序数据显不，B.appendiculatus 和 B.subappendiculatus 的 ITS1-5.8S-1TS2 序列长度均为 600 700bp，很难利用通用引物对(如ITS1/ITS4或ITS5/ITS4)的PCR扩增、普通电泳来进行准确辨别。对ニ个种的ITS序列比对显示二者的局部序列存在较大差异，这为设计ITS特异引物，针对性地扩增ITS特异片段，以方便用于这ニ个近缘种的分子辅助鉴定提供了可能性。
发明内容
本发明目的是提供ー种可鉴别欧洲牛肝菌近缘种B.appendiculatus和B.subappendiculatus的分子特异性标记引物，以及ー种利用该引物对欧洲牛肝菌近缘种B.appendiculatus 和 B.subappendiculatus 进行快速辨别的方法。本发明采用的技术方案是:
一种鉴别欧洲牛肝菌近缘种B.appendiculatus和B.subappendiculatus的分子特异性标记引物，其核苷酸序列如下:上游引物:5'-AGAAAAGCTCAGCCCGCTCAAA-3'下游引物:5'-ACTGTCGCTGGCCCCTCCACTCTG-3'。该引物对是采用PCR技术，经过对欧洲牛肝菌标本B.appendiculatus和B.subappendiculatus的核糖体基因rRNA的ITS区序列的克隆测序，以得到的ITS序列进行碱基差异比对，并以此设计ITS特异性引物对。以该引物对对B.appendiculatus和B.subappendiculatus 进行 PCR 扩增，可从 B.subappendiculatus 中获得 630bp 大小的特异性片段，而B.appendiculatus则无法获得扩增产物。本发明还涉及所述的分子特异性标记引物在鉴别欧洲牛肝菌B.appendiculatus和 B.subappendiculatus 中的应用。本发明还涉及ー种利用所述分子特异性标记引物鉴别欧洲牛肝菌B.appendiculatus和B.subappendiculatus的方法，所述方法包括:提取待测牛肝菌标本基因组DNA作为模板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果出现630bp的DNA条带，则待测牛肝菌为B.subappendiculatus,若电泳结果未出现630bp的DNA条带，则待测牛肝菌为B.appendiculatus ；所述分子特异性标记引物序列为:上游引物:5'-AGAAAAGCTCAGCCCGCTCAAA-3'下游引物:5'-ACTGTCGCTGGCCCCTCCACTCTG-3'。所述方法关键在于扩增引物的选择、DNA提取、PCR反应体系及反应条件确定，以及电泳检测，均可按照本领域常规方法进行。需要说明的是，本发明分子特异性标记引物和检测方法仅适用于欧洲牛肝菌B.appendiculatus和B.subappendiculatus的鉴别，即待测标本是限定为欧洲牛肝菌标本B.appendiculatus和B.subappendiculatus的范围内的，本领域普通技术人员可根据子实体形态和颜色先进行初步的判断，再将判断可能为B.appendiculatus或B.subappendiculatus的牛肝菌标本采用本发明方法进行鉴别。B.appendiculatus 和 B.subappendiculatus 是同属于 Boletus 属内Appendiculati类群的ニ个近缘种，同起源于欧洲，有着该类群内ー些共同的形态特征。对B.appendiculatus与B.subappendiculatus的辨别主要通过二者的菌肉和菌孔在变蓝反应上的差异和菌盖颜色上的差异，但对变色反应程度和顔色差异的判别具有很强的主观性，而且对于干标本，特别是古老标本已很难通过变蓝反应来准确鉴定，有文献记载了这ニ个近缘种被混淆鉴定的情况。采用本发明方法，可对B.appendiculatus和B.subappendiculatus进行快速的分子鉴定，方法简单、快捷、准确，是形态特征辨别的有效辅助。所述PCR扩增反应体系组成如下(总体积25 ii L):
PCR Buffer终浓度为I x
dNTPs0.8 mM
MgCI:2.0 mM
Taq DNA 酶I 2 U
上、下游引物各0.4 p M
模板 DNA5CM Wng
余量为ddH20;PCR反应条件如下:94°C预变性 6min 后；94°C变性 40s，60°C退火 40s，72°C延伸 2min，共 30 个循环；最后于72°C补平7min，終止温度为4°C。具体的，所述方法如下:(I)取待测牛肝菌标本子实体0.2 g，加液氮彻底磨碎，以SDS-CTAB法提取待测牛肝菌的基因组DNA ；(2)以步骤(I)提取的基因组DNA为模板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增:PCR反应体系每25 ii L组成如下:
10 PCR Buffer2.5 m L
IOmM dNTPs2pL
25 mM MgCl22pL
5U/pLTaq DNA H 0.3 p L IOpM上、下游引物各丨JliL 17ng/pL 模板 DNA3pL
(WH2O 补足至 25 p L;PCR反应条件如下:94°C预变性 6min 后；94°C变性 40s，60°C退火 40s，72°C延伸 2min，共 30 个循环；最后于72°C补平7min，終止温度为4°C ；(3)取步骤(2)扩增产物5 ii L，与I ii L 0.25%溴酚兰缓冲液混勻，点样于1.5%的琼脂糖凝胶上，于IXTAE缓冲液中、5V/cm电压下电泳，电泳结束后EB染色，于自动凝胶图像分析仪上照相，若电泳结果出现630 bp的DNA条带，则待测牛肝菌为B.subappendiculatus,若电泳结果未出现630 bp的DNA条带，则待测牛肝菌为B.appendiculatus。PCR Buffer终浓度为IX，是指PCR Buffer中各组分在反应体系中的浓度与IXPCR Buffer相同，通常选用体积为反应体系体积1/10的10XPCR Buffer。10XPCRBuffer成分为:100mM Tris-HCl (pH8.5)、500mMKCl、25mM MgCl2和 1.0%Triton-X_100，溶剂为 ddH20。本发明的有益效果主要体现在:本发明分子特异性标记引物可对近缘种
B.appendiculatus和B.subappendiculatus进行快速的分子鉴定，方法简单、快捷、准确，是形态特征辨别牛肝菌B.appendiculatus和B.subappendiculatus的有效辅助。
图1 为对 B.appendiculatus 和 B.subappendiculatus 进行 PCR 扩增的结果；M:Marker,即 DNA 分子量标准；C:阴性对照；Ba:B.appendiculatus ；Bsu:B.subappendiculatus ;图1所指为编号为Ba的B.appendiculatus标本未扩增出分子量为630bp的特殊DNA条带,而编号为Bsu的B.subappendiculatus标本扩增出了该条带。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此:实施例1:(I)牛肝菌标本基因组DNA的提取:取待测牛肝菌标本子实体0.2g，加液氮彻底磨碎，基因组DNA的提取采用SDS-CTAB法，经多次抽提，来提取获得标本的基因组DNA粗提物。DNA粗提物再经Magabio核酸纯化试剂盒进行纯化(博日Bioer,杭州，中国)后,通过
1.5%的琼脂糖凝胶电泳和DNA/RNA紫外分光光度计(GeneQuant Pro,GEHealthcare)来检测完整性、纯度及浓度。0D26(i/0D28(i>1.8的DNA样品用于后续PCR扩增。DNA提取物干-20°C冰箱贮藏备用。(2)设计特异PCR扩增引物，引物对的序列为上游引物5 ' -AGAAAAGCTCAGCCCGCTCAAA-3 '和下游引物 5 ' -ACTGTCGCTGGCCCCTCCACTCTG-3 '，由上海生物工程技术有限公司合成。(3) ITS特异引物的PCR扩增:PCR反应体系:10XPCR Buffer2.5 U L, 10mmol /T, dNTPs2 U L, 25mmol/L MgCl2 2 U L, 5U/ U L TaqDNA g|0.3uL, IOu mol/L 上下游特异引物各 I U L, 17ng/ u L 模板 DNA3 u L, ddH2014.2 u L,反应总体积为25 u L0扩增反应在杭州博日公司的TC-XP型扩增仪上进行，反应条件:94°C预变性6min后；94°C变性40s，退火40s，72°C延伸2min，共30个循环；最后于72°C补平7min，终止温度为 4 0C o
(4)电泳检测:取步骤(3) PCR扩增产物5ul，与Iul0.25%溴酚兰缓冲液混匀，点样于1.5%的琼脂糖凝胶上，于IXTAE缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，在含
0.5 u g/mlEB的水溶液中染色30分钟，然后在上海培清JS-380A自动凝胶图像分析仪上照相。按照上述方法，分别对 B.appendiculatus 和 B.subappendiculatus 标本(B.appendiculatus 标本来自于比利时国家植物园 National Botanical Garden ofBelgium, B.subappendiculatus标本来自于维也纳大学植物研究所Institute ofBotany, University of Vienna)进行检测，以无菌水为阴性对照，电泳结果见图1。其中编号为1、2、3、4、5、 6、7的B.appendiculatus标本未扩增出分子量为630bp的特殊DNA条带，而编号为8、9、10的B.subappendiculatus标本扩增出了该条带。
权利要求
1.一种鉴别欧洲牛肝菌B.appendiculatus和B.subappendiculatus的分子特异性标记引物，其核苷酸序列如下: 上游引物:5' -AGAAAAGCTCAGCCCGCTCAAA-3' 下游引物:5' -ACTGTCGCTGGCCCCTCCACTCTG-3'。
2.如权利要求1所述的分子特异性标记引物在鉴别欧洲牛肝菌B.appendiculatus和B.subappendiculatus 中的应用。
3.ー种利用权利要求1所述分子特异性标记引物鉴别欧洲牛肝菌B.appendiculatus和B.subappendiculatus的方法,所述方法包括:提取待测牛肝菌标本基因组DNA作为模板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果出现630bp的DNA条带,则待测牛肝菌为B.subappendiculatus,若电泳结果未出现630bp的DNA条带,则待测牛肝菌为B.appendiculatus ;所述分子特异性标记引物序列为: 上游引物:5' -AGAAAAGCTCAGCCCGCTCAAA-3' 下游引物:5' -ACTGTCGCTGGCCCCTCCACTCTG-3'。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述PCR扩增条件如下:94°C预变性6min后；94°C变性40s，60°C退火40s，72°C延伸2min，共30个循环；最后于72°C补平7min，终止温度为4°C。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于方法如下: (1)取待测牛肝菌标本子实体，加液氮彻底磨碎，以SDS-CTAB法提取待测牛肝菌的基因组DNA ； (2)以步骤(I)提取的基因组DNA为模板，以所述分子特异性标记 引物作为扩增引物，进行PCR扩增: PCR反应体系每25 ii L组成如下: 10X PCR Buffer2.5 m L IOmMdNTPs 2pL 25 mM MgCl2 2pL 5 U/p LTaq DNAiH OJpL IOpM上、下游引物各〗pL 11Hg/ p L 模板 DNA3 M L ddH20 补足至 25 p L; PCR反应条件如下:94°C预变性6min后；94°C变性40s，60°C退火40s，72°C延伸2min，共30个循环；最后于72°C补平7min，终止温度为4°C ； (3)取步骤(2)扩增产物5ii L，与I ii L 0.25%溴酚兰缓冲液混匀，点样于1.5%的琼脂糖凝胶上，于I XTAE缓冲液中、5V/cm电压下电泳，电泳结束后EB染色，于自动凝胶图像分析仪上照相，若电泳结果出现630bp的DNA条带,则待测牛肝菌为B.subappendiculatus,若电泳结果未出现630 bp的DNA条带,则待测牛肝菌为B.appendiculatus。
全文摘要
本发明提供了一种可鉴别欧洲牛肝菌近缘种B.appendiculatus和B.subappendiculatus的分子特异性标记引物，以及一种利用该引物对欧洲牛肝菌近缘种B.appendiculatus和B.subappendiculatus进行快速辨别的方法。所述分子特异性标记引物核苷酸序列如下上游引物5′-AGAAAAGCTCAGCCCGCTCAAA-3′下游引物5′-ACTGTCGCTGGCCCCTCCACTCTG-3′。本发明的有益效果主要体现在本发明分子特异性标记引物可对近缘种B.appendiculatus和B.subappendiculatus进行快速的分子鉴定，方法简单、快捷、准确，是形态特征辨别牛肝菌二种的有效辅助。
文档编号C12Q1/04GK103114149SQ201310070420
公开日2013年5月22日 申请日期2013年3月5日 优先权日2012年12月13日
发明者魏海龙, 李海波, 胡传久, 王丽玲, 付立忠 申请人:浙江省林业科学研究院