专利名称：一种多步衍生法同步分析碱基、核苷、有机酸、脂肪酸、氨基酸及糖类代谢产物的方法
技术领域：
本发明属于生物基样品的多步 衍生法同步分析方法领域，具体涉及采用试管或滤纸片作为标本载体的多步衍生法同步分析生物基样品中碱基、核苷、有机酸、脂肪酸、氨基酸及糖类代谢产物的方法。
背景技术：
尿液含有碱基、核苷、有机酸、脂肪酸、氨基酸及糖类等许多内源性化合物的终末或中间代谢产物，这些小分子有机化合物大多数有相对较高的水溶性和肾廓清率，其浓度通常亦高于血清和其他组织体液，如血液、CSF(脑脊液)及组织液等，其中尿标本最易于收集，为非侵入性操作性技术，为国内外研究者所认同。二十世纪我国对遗传代谢性、营养性、线粒体性及药物性等代谢性疾病仅能进行初步检测，依赖欧日美等发达国家的检测技术且需将标本送至国外合作单位方可确诊；近十年来我国引进气相色谱-质谱联用(gas chromatography mass spectrometry, GC-MS)尿有机酸检测方法仅仅是检测有机酸类遗传代谢性疾病，而缺乏碱基、核苷、氨基酸及糖类等遗传代谢性疾病的筛查、监测和研究的样本预处理及同步分析方法，因而也严重影响我国各类代谢性疾病医学领域的整体研究水平。首先，无论是色谱柱离子交换法还是有机酸萃取法，都只能分析尿中有机酸类物质，并且数量少，鲜有超过200种物质的文献报道；采用的是通过化学方法富集尿中有机酸，从而达到检测尿中有机酸的目的；现有的传统分析方法，无论是分析样本中酸性、碱性及中性有机酸类物质的数量，还是分析样本中物质的种类，和样本中客观存在的实际小分子的数量和种类相比，都存在严重不足，更缺乏碱基、核苷、氨基酸及糖类等物质的提取和同步分析的方法。其次，脲素酶预处理法不经有机酸萃取直接进行GC-MS分析，用以鉴定有机酸和部分氨基酸及部分糖类代谢产物，虽然分析方法有很大的进展，但也易“漏检”酮类酸、醛类酸等有机酸，也对碱基、核苷、氨基酸及糖类等物质的全面同步分析的方法，仍显不足，不利于标本代谢物成分“高通量组学”全面分析；样本是在高温高压下进行的三甲基硅烷化衍生，部分物质易分解，从而再“漏检”芳香族氨基酸类、胺类、二肽类等物质。再其次，处于代谢组学研究世界前沿水平的Fiehn数据库中的物质，主要是针对人体、细菌及植物的生理状态下和其遭受剧烈内外环境干扰下小分子代谢物成分“高通量组学”全面分析；分析方法取得更大的进展，但也“缺乏”碱基、核苷、有机酸、氨基酸及糖类等物质的“遗传性代谢病”全面同步分析的方法和数据，如苯丙酮尿症患儿尿液中独特的病理产物苯乙酸、苯乳酸、苯丙酮酸、邻羟基苯乙酸及扁桃酸；甲基丙二酸尿症患儿尿液中甲基柠檬酸等应用Fiehn数据库及其方法分析时就会“漏检”;因而临床应用仍显不足，不利于标本对500余种小儿遗传性代谢病“独特”代谢物成分“高通量组学”全面分析；最后，面对分析生理、病理及遗传缺陷条件下的复杂样本客观需求，面对分析小分子物质数量巨大的难题和面对分析小分子物质种类众多且理化性质各异的难点等。开发样本预处理技术、建立代谢物标准数据库和样本分离及检测技术至关重要，也是制约该领域学科发展的瓶颈。而目前，气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)等仪器很好地解决了样本分离及检测技术难题，成为该应用技术领域的主流分析工具之一。也就是说，剩下的攻关技术主要是开发样本预处理技术及建立其代谢物标准数据库，提供一种同步分析碱基、核苷、有机酸、脂肪酸、氨基酸及糖类代谢产物的方法，是目前研究的热点。
发明内容
针对现有色谱柱离子交換法、有机酸萃取法、脲素酶预处理法及Fiehn组学分析法等分析方法的缺陷，本发明的目的在于提供ー种多步衍生法同步分析碱基、核苷、有机酸、脂肪酸、氨基酸及糖类代谢产物的方法。该方法以生物基样本(尿液、血液、CSF(脑脊液)及组织液等)为检测对象，可以一次性多步衍生法同步分析上述多种物质的代谢中间和终末产物(包括酮类、醛类等物质)，可以利用多 步衍生法同步分析人体、细菌及植物等生理、病理及遗传缺陷条件下的复杂样本中1000多种物质。本发明的技术方案是ー种多步衍生法同步分析碱基、核苷、有机酸、脂肪酸、氨基酸及糖类代谢产物的方法(多步衍生法)，具体步骤包括I)取样收集生物基样本；2)定量待测样品对生物基样本进行物理洗脱并收集洗脱液；測定洗脱液中肌酐含量，确定肌酐浓度，取相当于2. 50 μ moL/ μ L肌酐浓度的洗脱液25 μ L-300 μ L作为待测样品，备用；3)肟化处理过程，即直接在上述待测样品中加入2. 5 μ 1-90 μ I肟化试剂，调PH值至7-14，密封样品并加热至45°C _70°C条件下，充分反应15min_90min，使待测样品完成肟化反应，得厢化反应后的样品；所述厢化试剂的浓度为O. 01 μ g/μ 1-50 μ g/μ IJ亏化试剂选自盐酸羟胺水溶液、甲氧基胺盐-吡啶溶液或こ氧基胺盐-吡啶溶液；4)预处理对肟化后的待测样品进行除磷及除硫、除服素、除蛋白、超声和离心处理后取离心液b，离心液b再经N-三甲基硅烷基咪唑或烷基氯甲酸脂在水中衍生反应，得样本溶液c，然后将样本溶液c干燥，得残留物，即为预处理后的样品；所述干燥是指氮气吹干或真空浓缩干燥或先氮气吹干再真空浓缩干燥；所述除磷及除硫是指在待测样品中加入O. 08mol/L-l. 2mol/L的钡剂水溶液10 μ L-200 μ L，震荡5-30分钟后离心，收集离心液a ；所述除脲素是指在上述离心液a中加入含脲素酶37 μ L-6V μ L的水溶液30 μ L_260 μ L，于25°C _42°C温度下水浴10-45分钟；所述除蛋白是指再加入相对于离心液a I. 5-6. 7倍体积的溶剂300 μ L-2000 μ L震荡5-30分钟，其中所述溶剂为甲醇、こ醇、丙酮酸、こ睛或吡啶；5) 二次三甲基硅烷化衍生反应在预处理后的样品中加入25yL-300yL的三甲基硅烷化衍生剂，置干燥加热器上先在:TC -60°C温度下衍生10min-120min，再在600C _200°C温度下衍生10min-90min，得硅烷化衍生反应后的检测样品；6)采用气质联用分析方法对检测样品中的碱基、核苷、有机酸、脂肪酸、氨基酸及糖类代谢产物进行同步检測。
步骤(I)中所述的生物基样本包括尿液、血液、脑脊液或组织液等。步骤(2)中所述物理洗脱收集洗脱液是指用0. 5mL-2. OmL去离子双蒸水或1%。盐酸-甲醇溶液分次洗脱，超声、离心、收集洗脱液。步骤(4)预处理过程中所述氮气吹干是利用氮吹仪在流量为0. 001-1. 5mL/秒的 99. 99%氮气下进行；所述真空浓缩干燥是在零下70°C至50°C的温度，并在IOPa以内真空度的条件下进行。步骤(4)所述钡剂水溶液包括Ba (Cl) 2或Ba (OH) 2或Ba (NO3) 2水溶液。步骤(5)所述三甲基硅烷化衍生剂选自N，0-双(三甲基硅烷基)-2，2，2-三氟乙酸胺、N-甲基-N-(二甲基娃烧基)二氣乙酸胺、二甲基氣娃烧、N, 0_双(二甲基娃烧基)-2, 2，2-三氟乙酰胺与三甲基氯硅烷按照体积比99 I组成的混合试剂或者N-甲基-N-(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺与三甲基氯硅烷按照体积比99 I组成的混合试剂等20余种三甲基娃烧化衍生剂之一。步骤(6)所述采用气质联用分析方法对检测样品进行检测的条件为以正十七烷酸或二十四烷酸或托品酸作为内标物质，采用分流式进样，其中氦气与检测样品的体积比为10-50 I ;进样口温度设定为190°C _250°C，以氦气为载气，流速为0. 5-3. OmL/min，界面温度为260°C -300°C ;质谱检测采用电子离解模式总离子扫描方式，质荷比范围m/z为 30-750，扫描周期0. IS-O. 5S，色谱柱采用程序升温，从40°C _70°C开始，以3°C /min_7°C / min的升温速率升温至200°C后停留2min_10min，然后以4°C /mi_12°C /min的升温速率升温至280°C后停留2min-10min，再以4°C /min_12°C /min的升温速率升温至320°C，样本分析时间为8min_60min。下面对本发明做进一步解释和说明本发明的原理是I)碱基、核苷、有机酸、脂肪酸、氨基酸及糖类等代谢产物，虽然数量巨大，物理化学性质各异，但均具有羟基(-0H)、羧基(-COOH)、硫醇基(-SH)、氨基(-NH2 ;_NHR)、酰胺基 (-C0NH2)、羟胺基(-ONH)、磺(硫)酸基(-SOH)、硼酸基(-BOH)及磷(膦)酸基(-POH)等化学功能团，理论上都可以用一种或多种衍生化试剂，使其在合适的条件下同步变成易挥发、对热稳定、分子极性小等特点的衍生物(如三甲基硅烷化衍生物等)，得衍生反应后的检测样品；充分满足气相色谱-质谱联用仪对检测样品的苛刻需求。2)大量的研究数据资料证明酮类、醛类等化学物质，未经肟化处理而直接进行硅烷化衍生，得硅烷化反应后的样品，再采用气相色谱-质谱联用仪对检测样品进行检测分析，发现酮类、醛类等大多数衍生后的化学物质对热稳定性极差，易分解，质谱图上相关物质检测峰“消失”而检测不出。而经肟化处理的酮类、醛类等化学物质的羰基(-CO)衍生成肟基(-CNOH)后，对热稳定性极好，也易二次硅烷化衍生。使其在合适的条件下同步变成易挥发、对热稳定、分子极性小等特点的衍生物，得衍生反应后的检测样品；也可充分满足气相色谱-质谱联用仪对检测样品的苛刻需求。 3)生物基样本(尿液、血液、CSF (脑脊液)及组织液等)中的碱基、核苷、有机酸、 脂肪酸、氨基酸及糖类等小分子代谢产物的含量极低(ng级-pg级不等)。直接分析样本实践上难度极大，因而传统上仅仅采用离子交换法或有机酸萃取法对样本进行预处理(在性环境下进行，用乙酸乙酯和乙醚进行萃取，用无水硫酸钠震荡离心去除水份等)，仅仅多局限于有机酸类物质的分析；脲素酶预处理法不经离子交換法或有机酸萃取直接进行GC-MS分析，也仅仅鉴定有机酸和部分氨基酸及部分糖类代谢产物。Fiehn数据库及其方法主要是针对人体、细菌及植物的生理状态下和其遭受剧烈内外环境干扰下小分子代谢物成分“高通量组学”全面分析，但也“缺乏”碱基、核苷、有机酸、氨基酸及糖类等代谢物质全面同步分析的方法和数据，如苯丙酮尿症患儿尿液中独特的病理产物苯こ酸、苯乳酸、苯丙酮酸、邻羟基苯こ酸及扁桃酸；甲基丙ニ酸尿症患儿尿液中甲基柠檬酸等应用Fiehn数据库及其方法分析时就会“漏检”;但本发明证明，经过一系列的超声、离心、除服素、除磷、除硫、除蛋白、氮吹、真空浓缩干燥等理化方法技术处理生物基样本(尿液、血液、CSF(脑脊液)及组织液等)后，也就可以直接更广泛更全面地 直接同步分析样本。利用本发明的检测结论可以根据所检测的物质建立碱基、核苷、有机酸、脂肪酸、氨基酸及糖类代谢产物质谱图谱库。与现有离子交換法或有机酸萃取法或脲素酶预处理法或Fiehn数据库及其组学分析方法等技术相比，本发明的优势在于I、该方法能对生物基质样本(如尿液、血液、CSF(脑脊液)及组织液等)进行程序化处理,一次性检测五大类物质1000余种关键代谢产物。2、有肟化处理程序，利于酮酸类、醛酸类等物质检出，不致漏诊重要的酮酸及醛酸类等代谢产物。3、不应用こ酸こ酯和こ醚有机萃取法，而是直接除服素、肟化、除磷、除硫、除蛋白、氮吹、真空浓缩干燥等处理程序进行样本预处理，并按肌酐、次黄嘌呤核苷或内标含量定量分析。各种代谢产物回收率高，重复性好；不至污染色谱毛细管柱和质谱离子源，不需要空气洁净拒，不污染工作环境。4、所选定色谱-质谱的肌酐、次黄嘌呤核苷或内标定性/定量分析条件稳定，样本色谱峰分离效果良好，质谱图信息完整，易于计算机谱库检索和鉴定。样本分析时间较短，适合大尺度、高通量样本分析，如根据羊水、血液、尿液及组织液等样本的检测物质，可以分析遗传性、线粒体性、营养性等相关代谢组学进行研究分析。
图I是实施例I用本发明的多步衍生法同步分析方法检测的高乳酸尿症的GC-MS分析质谱图。图2是实施例2用本发明的多步衍生法同步分析方法检测的月桂树芽组织液的GC-MS分析质谱图。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做进ー步的解释和说明实施例I :I)取样采用试管或滤纸片收集尿液采用普通试管或国产3号滤纸，切成
3.0cmX8. Ocm大小。晨尿或任意次尿浸透滤晾干后置专用滤纸干燥袋内备用。2)收集检测样品干燥滤纸生物基质样本，用I. OmL去离子双蒸水分次洗脱，对生物基样本经过超声、离心等物理方法技术处理后，收集洗脱液；測定洗脱液中肌酐含量，确定肌酐浓度，取相当于2. 50 u moL/ u I肌酐浓度的洗脱液200 u I作为检测样品备用；3)肟化处理在200 U I检测样品中加入50 U I盐酸羟胺水溶液(内含盐酸羟胺为25 ii g/ ill)，用6当量浓度NaOH溶液调节上述检测样品的PH值为10，使检测样品完成酮类酸、醛类酸等物质的肟化反应，得肟化反应后的样品；与现有方法不同，不加入常规试剂如10. 25M硫酸、20%氢氧化钠、饱和氯化铵等。4)预处理对待测 样品进行除磷酸根离子及除硫酸根离子处理(采用在待测样品中加入0. lmol/L的钡剂300ii L，震荡30分钟后离心，收集离心液a)、除脲素(在离心液a中加入含脲素酶5u/ u L的水溶液120 ii L，于35°C _40°C温度下水浴30-35分钟)、除蛋白(加入相对于离心液a 4倍体积的甲醇溶液1200 iiL，震荡15分钟)、再次超声和离心处理后得离心液b、水中衍生反应是指离心液b再经N-三甲基硅烷基咪唑或烷基氯甲酸脂衍生反应，得样本溶液c ;真空浓缩干燥是在零下40°C的温度( 零下70°C -50°C都是可行的，根绝实际操作改变)，并在IOPa以内真空度的条件下进行除水除溶剂，并浓缩样品至150-2001! L，转移浓缩样品至微量样品制备瓶，用氮气小心吹干除水，完全脱水后的残留物，得预处理后的样品；5) 二次三甲基硅烷化衍生在预处理后的样品中加入300 y L的三甲基硅烷化衍生剂，即N，0-双(三甲基硅烷基)-2，2，2-三氟乙酰胺与三甲基氯硅烷按照体积比99 I 组成的混合试剂，置干燥加热器上在40°C温度及常温常压下衍生SOmin及在160°C温度及高温高压下衍生60min，得硅烷化衍生反应后的检测样品；可用正己烷定容至500i! L，得检测样品。(衍生温度和时间根据不同的样品和三甲基硅烷化衍生剂而变化)6)取0. 5 y L样品进样，采用气质联用分析方法对检测样品中的碱基、核苷、有机酸、脂肪酸、氨基酸及糖类代谢产物进行同步检测。气相色谱仪-质谱仪联合分析应用Agilent :7890/5975C型GC-MS进行样本分析，配备7673型自动进样器，DB-5毛细管色谱柱，柱长60或30M ;直径0. 25mm,膜厚
0.25 u m。气相色谱仪-质谱仪联合分析条件如下采用分流式进样(30 1，氦气样品的体积比)，进样口温度设定为210°C，氦气(He :含量为99.999% )为载气，流速为LOmL/ min，界面温度为280°C ;质谱检测采用电子离解模式总离子扫描方式，质荷比范围m/z 35-750，扫描周期0. 1S，色谱柱箱程序升温从60°C开始，5°C /min升温至150 °C后停留 8min，然后以8°C /min升温至280°C后停留lOmin，然后以12°C /min升温至320°C，样本分析时间为60min。计算机系统记录色谱和质谱图形，应用质谱图谱库参比鉴定和各色谱峰的峰度进行定性和定量分析。气质联用分析方法对检测样品进行检测质谱图见图I。图I中各色谱峰在不同标本中可以依次鉴定的具体数据如表I所示，其中n. d产物仅在遗传缺陷情形下可检出，化合物后面的数字代表tms (三甲基硅烷基)的个数。表I图I中各色谱峰依次鉴定结果
权利要求
1.一种多步衍生法同步分析碱基、核苷、有机酸、脂肪酸、氨基酸及糖类代谢产物的方法，其特征是，具体步骤包括1)取样收集生物基样本；2)定量待测样品对生物基样本进行物理洗脱并收集洗脱液；测定洗脱液中肌酐含量，确定肌酐浓度，取相当于2. 50 u moL/ u L肌酐浓度的洗脱液25 u L-300 u L作为待测样品 备用;3)肟化处理过程，即直接在上述待测样品中加入2.5ia-90ia肟化试剂，调PH值至 7-14，密封样品并加热至45°C -70°C条件下，充分反应15min-90min，使待测样品完成肟化反应,得厢化反应后的样品；所述厢化试剂的浓度为0. 01 u g/u 1-50 u g/u IJ亏化试剂选自盐酸羟胺水溶液、甲氧基胺盐-吡啶溶液或乙氧基胺盐-吡啶溶液；4)预处理对肟化后的待测样品进行除磷及除硫、除脲素、除蛋白、超声和离心处理后取离心液b，离心液b再经N-三甲基硅烷基咪唑或烷基氯甲酸脂在水中衍生反应，得样本溶液c，然后将样本溶液c干燥，得残留物，即为预处理后的样品；所述干燥是指氮气吹干或真空浓缩干燥或先氮气吹干再真空浓缩干燥；所述除磷及除硫是指在待测样品中加入0.08mol/L-l. 2mol/L的钡剂水溶液10 u L-200 u L，震荡5-30分钟后离心，收集离心液a ； 所述除脲素是指在上述离心液a中加入含脲素酶3U/ u L-6U/ u L的水溶液30 u L-260 u L， 于25°C _42°C温度下水浴10-45分钟；所述除蛋白是指再加入相对于离心液a I. 5-6. 7倍体积的溶剂300 u L-2000 y L震荡5_30分钟，其中所述溶剂为甲醇、乙醇、丙酮酸、乙晴或吡啶；5)二次三甲基硅烷化衍生反应在预处理后的样品中加入25ii L-300ii L的三甲基硅烷化衍生剂，置干燥加热器上先在3°C _60°C温度下衍生10min-120min，再在60°C -200°C温度下衍生10min-90min，得硅烷化衍生反应后的检测样品；6)采用气质联用分析方法对检测样品中的碱基、核苷、有机酸、脂肪酸、氨基酸及糖类代谢产物进行同步检测。
2.根据权利要求I所述一种多步衍生法同步分析碱基、核苷、有机酸、脂肪酸、氨基酸及糖类代谢产物的方法，其特征是，步骤(I)中所述的生物基样本包括尿液、血液、脑脊液或组织液。
3.根据权利要求I所述一种多步衍生法同步分析碱基、核苷、有机酸、脂肪酸、氨基酸及糖类代谢产物的方法，其特征是，步骤(2)中所述物理洗脱收集洗脱液是指用0.5mL-2. OmL去离子双蒸水、1%。盐酸-甲醇溶液分次洗脱，超声、离心、收集洗脱液。
4.根据权利要求I所述一种多步衍生法同步分析碱基、核苷、有机酸、脂肪酸、氨基酸及糖类代谢产物的方法，其特征是，步骤(4)预处理过程中所述氮气吹干是利用氮吹仪在流量为0. 001-1. 5mL/秒的99. 99%氮气下进行；所述真空浓缩干燥是在零下70°C至50°C 的温度，并在IOPa以内真空度的条件下进行。
5.根据权利要求I所述一种多步衍生法同步分析碱基、核苷、有机酸、脂肪酸、氨基酸及糖类代谢产物的方法，其特征是，步骤(4)所述钡剂水溶液包括Ba(Cl)2或Ba(OH)2或 Ba (NO3)2水溶液。
6.根据权利要求I所述一种多步衍生法同步分析碱基、核苷、有机酸、脂肪酸、氨基酸及糖类代谢产物的方法，其特征是，步骤(5)所述三甲基硅烷化衍生剂选自N，0-双(三甲基娃烧基)-2,2,2- ニ氣こ酸胺、N-甲基-N- ( ニ甲基娃烧基)ニ氣こ酸胺、ニ甲基氣娃烧、N，O-双(三甲基硅烷基)-2，2，2_三氟こ酰胺与三甲基氯硅烷按照体积比99 I组成的混合试剂或者N-甲基-N-(三甲基硅烷基)三氟こ酰胺与三甲基氯硅烷按照体积比99 I组成的混合试剂。
7.根据权利要求I所述ー种多步衍生法同步分析碱基、核苷、有机酸、脂肪酸、氨基酸及糖类代谢产物的方法，其特征是，步骤(6)所述采用气质联用分析方法对检测样品进行检测的条件为以正十七烷酸或二十四烷酸或托品酸作为内标物质，采用分流式进样，其中氦气与检测样品的体积比为10-50 I ;进样ロ温度设定为190°C _250°C，以氦气为载气，流速为O. 5-3. OmL/min，界面温度为260°C -300°C ;质谱检测采用电子离解模式总离子扫描方式，质荷比范围m/z :30-750,扫 描周期O. 1S-0. 5S，色谱柱采用程序升温，从40°C -70°C开始，以3°C /min-7 °C /min的升温速率升温至200°C后停留2min_10min，然后以4 °C /mi-12°C /min的升温速率升温至280°C后停留2min-10min,再以4°C /min_12°C /min的升温速率升温至320°C，样本分析时间为8min-60min。
全文摘要
本发明公开了一种多步衍生法同步分析碱基、核苷、有机酸、脂肪酸、氨基酸及糖类代谢产物的方法。该方法是将生物基质样本(如尿液、血液、脑脊液)及组织液等)经过一系列超声、离心、肟化，除脲素、除磷、除硫、除蛋白、氮吹、真空干燥及多步三甲基硅烷化衍生等理化方法技术处理后，再采用气相色谱仪-质谱联合技术对生物基质样本进行检测。该方法能同时对生物基质样本进行程序化处理，一次性检测五大类以上物质1000余种代谢中间和终末产物。
文档编号G01N30/02GK102621249SQ20121011449
公开日2012年8月1日 申请日期2012年4月18日 优先权日2012年4月18日
发明者王益超 申请人:王益超