专利名称：一种从细菌中提取高分子量基因组的方法
技术领域：
本发明涉及一种细菌基因组提取方法，通过该方法达到提取高分子、大片段基因组以满足许多分子生物学分析的需要，属于微生物的分子生物学领域。
背景技术：
由于细菌生长速度快，结构简单，易于培养，种类繁多，分布广等优点，因此，许多重要生命活动的阐明，都是以细菌为研究对象而开展的，许多生产实践都是以细菌作为载体而实现的，细菌作为一类极为重要而广泛的微生物资源，在医药，化工，冶金，环保，资源等方面显示了无可替代的功能和价值。目前，对细菌的研究越来越深入到了分子水平。如分子克隆，RFLP分析，文库构建，这些方法和技术的发展，都对DNA片段大小提出了更高的要求。一般来说，构建基因组文库，初始DNA长度必须在40kb以上，否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。而进行RFLP和PCR分析，DNA长度可短至25kb，在该长度以上，可保证酶切后产生RFLP片段(20kb以下)，并可保证包含PCR所扩增的片段(一般2kb以下)。
目前，实验室提取细菌基因组DNA的方法主要有CTAB法、碱提取法。但这些方法往往只能适应革兰氏阳性或者革兰氏阴性细菌，缺乏通用性，而且要使提取的基因组DNA片段达到40kb以上比较困难。
发明内容
为了解决现有细菌提取方法中存在的不足，本发明提供一种从细菌中提取高分子量基因组的方法。
一种从细菌中提取高分子量基因组的方法，包括破壁、抽提(去蛋白，多糖等)、沉淀、洗涤干燥、溶解，具体工艺过程如下破壁破解细胞壁与细胞膜是获得基因组DNA的前提，由于革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的细菌壁的差异性，因而采用了针对两类细菌的不同破壁方法革兰氏阳性菌采用溶菌酶+蛋白酶+SDS，革兰氏阴性细菌采用蛋白酶+SDS。
革兰氏阳性菌用400-500ul的TE缓冲液悬浮细菌，加入45-50ul、20mg/ml的溶菌酶和40-60ul、20％的SDS，37℃温浴1h后加入6-7ul、20mg/ml的蛋白酶K，37℃温浴1h。
革兰氏阴性细菌用400-500ul的TE缓冲液悬浮细菌，加入40-60ul、20％的SDS，37℃温浴1h后加入6-7ul、20mg/ml的蛋白酶K，37℃温浴1h。
抽提对破壁后的细菌加入170-220ul的CTAB/NaCl溶液去多糖，采用等体积的氯仿/异戊醇，离心去除蛋白和多糖及其它复合物。
沉淀吸取上清至离心管中，向其中加入0.8-1.2倍体积的异丙醇，沉淀DNA。
洗涤干燥加入0.8-1.2倍体积的无水乙醇，混匀，充分凉干，以去除乙醇避免对后续操作的影响。
溶解加入30-50ul的无菌去离子水或TE溶解DNA。
所述TE缓冲液为1mol/L Tris·Cl，pH8.0，0.5mol/L EDTA，0.5mol/L柠檬酸，加水至1000ml；所述CTAB/NaCl溶液为4.1g NaCl溶解于80ml水，缓慢加入10g CTAB，加水至100ml；所述氯仿为异戊醇(24∶1)，异丙醇，70％乙醇，20％SDS，蛋白酶K(20mg/ml)，溶菌酶(20mg/ml)。
本发明从影响提取DNA片段大小的因素入手，分别为革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌，提取了较常规所提片段大的高分子DNA片段，提取的基因组DNA达到40kb以上，经吸光度检测，OD260/OD280比值在1.8-2.0之间，方法重复性好，操作简单，完全能满足上述分子操作。
本发明在Tris-HCl的缓冲系统中加入EDTA和柠檬酸双重螯合二价金属离子进而最大可能地抑制依赖于二价金属离子的DNA酶的活性，对DNA起到保护，防止和抑制DNase对DNA的降解；本发明将枪头剪成大口并避免用枪头来回的吹打，在DNA处于溶解状态时，尽量减弱溶液的涡旋，尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。
图1A.为用常规CTAB法提取的氧化亚铁硫杆菌(革兰氏阴性)基因组DNA；B.为本方法所提的氧化亚铁硫杆菌基因组DNA，Marker为λDNA cuttedby HindIII；图2A.为用本方法提取的枯草杆菌(革兰氏阳性)基因组DNA；B.为用常规CTAB法提取的枯草杆菌基因组DNA，Marker为λDNA cutted by HindIII。
具体实施例方式
实施例1收集湿重约1g的新鲜菌体，用TE悬浮，10000rpm离心2min；去上清，并向沉淀中加入480ulTE，悬浮细菌；向悬浮液中加入0.05ml溶菌酶，颠倒混匀，37℃温浴1h。(适合革兰氏阳性菌，革兰氏阴性菌直接进入步骤4)；加入40ul的20％SDS和5ul蛋白酶K，颠倒混匀，37℃温浴1h；加入CTAB/NaCl溶液200ul，柔和颠倒混匀，65℃温浴10min；加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)柔和颠倒混匀，12000rpm离心5min；将上清液用剪成大口的枪头小心吸取转移到一新离心管中；加入等体积的异丙醇柔和颠倒混匀，用消毒牙签挑出絮状物转移到一新离心管；用70％乙醇洗涤两次，凉干；将附着有DNA的牙签转移到一新离心管中，加入50ul无菌水过夜溶解。溶解液即为所提的DNA。
权利要求
1.一种从革兰氏阳性菌中提取高分子量基因组的方法，其特征在于包括破壁、抽提、沉淀、洗涤干燥、溶解，具体工艺过程如下破壁用400-500ul的TE缓冲液悬浮细菌，加入45-50ul、20mg/ml的溶菌酶和40-60ul、20％的SDS，37℃温浴1h后加入6-7ul、20mg/ml的蛋白酶K，37℃温浴1h；抽提对破壁后的细菌加入170-220ul的CTAB/NaCl溶液去多糖，采用等体积的氯仿/异戊醇，离心去除蛋白和多糖及其它复合物；沉淀吸取上清至离心管中，向其中加入0.8-1.2倍体积的异丙醇，沉淀DNA；洗涤干燥加入0.8-1.2倍体积的无水乙醇，混匀，充分凉干，；溶解加入30-50ul的无菌去离子水或TE溶解DNA；所述TE缓冲液为1mol/L Tris·Cl，pH8.0，0.5mol/L EDTA，0.5 mol/L柠檬酸，加水至1000ml；所述CTAB/NaCl溶液为4.1g NaCl溶解于80ml水，缓慢加入10g CTAB，加水至100ml；所述氯仿为∶异戊醇(24∶1)，异丙醇，70％乙醇，20％SDS，蛋白酶K(20mg/ml)，溶菌酶(20mg/ml)。
2.一种从革兰氏阴性菌中提取高分子量基因组的方法，其特征在于包括破壁、抽提、沉淀、洗涤干燥、溶解，具体工艺过程如下破壁用400-500ul的TE缓冲液悬浮细菌，加入40-60ul、20％的SDS，37℃温浴1h后加入6-7ul、20mg/ml的蛋白酶K，37℃温浴1h；抽提对破壁后的细菌加入170-220ul的CTAB/NaCl溶液去多糖，采用等体积的氯仿/异戊醇，离心去除蛋白和多糖及其它复合物；沉淀吸取上清至离心管中，向其中加入0.8-1.2倍体积的异丙醇，沉淀DNA；洗涤干燥；加入0.8-1.2倍体积的无水乙醇，混匀，充分凉干，；溶解加入30-50ul的无菌去离子水或TE溶解DNA；所述TE缓冲液为1mol/L Tris·Cl，pH8.0，0.5mol/L EDTA，0.5 mol/L柠檬酸，加水至1000ml；所述CTAB/NaCl溶液为4.1g NaCl溶解于80ml水，缓慢加入10g CTAB，加水至100ml；所述氯仿为∶异戊醇(24∶1)，异丙醇，70％乙醇，20％ SDS，蛋白酶K(20mg/ml)，溶菌酶(20mg/ml)。
全文摘要
一种从细菌中提取高分子量基因组的方法，包括采用溶菌酶+蛋白酶+SDS或采用蛋白酶+SDS破壁、TE缓冲液抽提(去蛋白，多糖等)、经沉淀、洗涤干燥、溶解。本发明从影响提取DNA片段大小的因素入手，提取了较常规所提片段大的高分子DNA片段，提取的基因组DNA达到40kb以上，经吸光度检测，OD260/OD280比值在1.8－2.0之间。方法重复性好，操作简单，完全能满足上述分子操作。
文档编号C12N15/31GK1952150SQ200610032560
公开日2007年4月25日 申请日期2006年11月10日 优先权日2006年11月10日
发明者柳建设, 夏乐先, 邱冠周, 高健, 闫颖, 曾嘉 申请人:中南大学