专利名称：一个与弥漫大b型淋巴瘤易感性密切相关的多态位点及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一个与弥漫大B型淋巴瘤密切相关的易感基因位点以及基于该多态位点突变特性的筛选弥漫大B型淋巴瘤高危人群的方法。属于生物技术的基因领域。
背景技术：
恶性淋巴瘤(malignant lymphoma，ML)是原发于淋巴结或淋巴结外组织或器官的一种恶性肿瘤，是常见的十大肿瘤之一，世界总的排序位于第9位。根据临床和病理特点不同，ML分为两个大类，即霍奇金病(Hodgkin disease，HD)和非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma，NHL)。与西方国家不同，在我国NHL占ML的95.6％，而其中大部分(68.07％)又为弥漫大B型淋巴瘤(《恶性淋巴瘤病理诊断学》，朱梅刚，广东科技出版社)。因此确定弥漫大B型淋巴瘤的病因，建立有效的防治方法是迫切需要解决的问题。
化疗是肿瘤治疗的有效方法之一，而多药耐药(multidrug resistence，MDR)一直是化疗成功的最主要障碍。BCRP是目前研究最多的多药耐药蛋白之一，属于ABC转运蛋白ABCG基因亚科，位于染色体4q22，全长超过66kb，包含16个外显子。它在细胞膜上表达，以分子泵的形式将底物泵出细胞外。BCRP不仅在肿瘤耐药株中有表达，在胎盘，肝脏，脑，肾等正常组织中也有表达。其底物除了一些化疗药物以外还包括一些毒素，因此认为在正常组织中表达的BCRP具有防止毒素侵害的作用。
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)作为第三代遗传标记已得到飞速发展，是疾病易感性、外显性、抵抗性、以及药物反应性等生物学性状差别的重要基础，很多疾病与基因突变或基因多态有关。
目前已对90个不同种族的人群的BCRP基因进行系统的SNP筛选，在启动子区域、外显子和内含子中发现40多个同义和非同义SNP(Zamber et al.，2003)。两个非同义SNPG34A和C421A最近已被证实能改变转运功能，改变对部分抗癌药物的敏感性以及破坏蛋白质的表达(Mizuarai，Aozasa，& Kotani，2004)。最近研究表明底物的个体差异与BCRP的基因型有关(Sparreboom et al.，2004)。
经对现有技术的国内外文献和专利检索，至今未见有BCRP基因多态性位点与淋巴瘤相关性报道，也未见BCRP基因与疾病易感性的相关性研究。
本发明建立的二等位基因特异的多重PCR方法(Bialelic-ARMS)，与传统的等位基因特异的PCR(ARMS)相比，具有更简单快速的特点。因为传统的ARMS需要两次PCR反应才能检测出两个等位基因型，而Bialelic-ARMS在同一反应管中便可检测出两个等位基因型。
发明内容
本发明的目的之一是揭示与弥漫大B淋巴瘤易感性密切相关BCRP基因多态位点；目的之二是通过该易感基因位点遗传特性提出一种判定弥漫大B型淋巴瘤易感人群的方法，有利于指导弥漫大B型淋巴瘤的预防和治疗。
为实现这样的目的，本发明首先通过NCBI数据库获得BCRP基因的全序列和外显子信息，设计引物扩增出第二(BCRPE2)、五(BCRPE5)外显子.具体序列信息如下BCRPE2aa tctcatttat ctggactatc aacttactat39241 tgcttttctg tctgcagaaa gataaaaact ctccagatgt cttccagtaa tgtcgaagtt39301 tgtcacaagg aaacaccaat ggcttccccg cgacagcttc caatgacctg39361 aaggcattta ctgaaggagc tgtgttaagt tttcataaca tctgctatcg agtaaaactg39421 aagagtggct ttctaccttg tcgaaaacca gttgagaaag aaatattatc gaBCRPE5tcattat gtctcattaa aatgctattt gccttaagga48061 tgatgttgtg atgggcactc tgacggtgag agaaaactta cagctcttcg48121 gcttgcaaca actatgacga atcatgaaaa aaacgaacgg attaacaggg tcattcaaga48181 gttaggtctg gataaagtgg cagactccaa ggtaatgtgg aaaaactgaa agcatcatga48241 tcagcataag taggactttc cctgtgtgg用单链构像多态性(single-strand conformation polymorphism，SSCP)并结合测序的方法各检测出一个多态位点，分别为G34A(位于第二外显子，缬氨酸/蛋氨酸，rs2231137，BCRPE2所示序列第102位)，C421A(位于第五外显子，谷胺酰氨/赖氨酸，rs2231142，rs12721641，rs28365035，BCRPE5所示序列第78位)。-上面两段序列中用方框标出的即为多态所在位点。
针对以上两个位点，我们检测了354个正常人和152个弥漫大B型淋巴瘤患者的血液标本的基因型，用SPSS软件分析发现与正常对照组相比，C421A位淋巴瘤患者多为AA或CA基因型，差别具有统计学意义(P＝0.03，表1)。进一步的年龄、性别分组分析表明在≤40岁的男性组中其差别也具有统计学意义(P＝0.006，表2)，而在其他年龄性别分组中差别没有意义。这些结果表明BCRP基因C421A位点上携带A等位基因的个体为弥漫大B型淋巴瘤易感人群，特别是携带A等位基因的40岁以下的男性对弥漫大B型淋巴瘤更易感。A等位基因是产生弥漫大B型淋巴瘤的一个危险等位位点。等位基因比较也进一步证实这个结论(P＝0.045，0.024表3，4)。
表1淋巴瘤患者与正常对照组BCRP基因421位基因型分布比较
表2≤40岁男性组中淋巴瘤患者与正常对照BCRP基因421位基因型分布比较
表3淋巴瘤患者与正常对照BCRP基因421位等位基因分布比较
表4≤40岁男性组中淋巴瘤患者与正常对照BCRP基因421位等位基因分布比较
另外，本发明还根据C421A位点提供了一种判定弥漫大B型淋巴瘤易感人群的方法-二等位基因特异的多重PCR方法(Bialelic-ARMS)。其特征包括如下步骤
1)用常规酚氯仿方法从人的血液中提取DNA，浓度校正至25ng/ul，作为DNA模板；2)设计寡核苷酸引物序列，包括针对单核苷酸多态性位点的两条特异性反向引物以及一对外周扩增引物，反应原理如图1所示，在附图后面具体引物序列如表5所示。用聚合酶链式反应(PCR)扩增，所得的PCR产物跑琼脂糖凝胶电泳，根据条带大小不同可以判断该SNP位点的基因型(见图2)。
表5BCRP基因421位Bialelic-ARMS引物序列及PCR条件
本发明发现的弥漫大B型淋巴瘤易感位点可以引起其编码蛋白质氨基酸序列的变化，可能导致蛋白质产物结构与功能的缺损或改变，这对阐明弥漫大B型淋巴瘤遗传学机制，建立基因诊断方法，指导弥漫大B型淋巴瘤预防、开发新型治疗药物具有重要意义。本发明建立的Bialelic-ARMS方法，可以快速有效的筛选淋巴瘤高危人群，并指导临床上对抗癌药物种类及剂量的选择；该方法具有简单、高效、敏感及特意的特点，适用于自动化批量检测。本发明对基于遗传学背景的个体化药物治疗奠定了十分重要的基础，并将带来十分可观的社会与经济效益。
图1.二等位基因特异的多重PCR方法(Bialelic-ARMS)原理；图2.二等位基因特异的多重PCR方法(Bialelic-ARMS)结果示意图。
具体实施例方式
以下结合具体实例，进一步说明本发明。值得注意的是，以下实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
1.技术路线第一步 样品选取和DNA的抽提淋巴瘤患者血液标本由中山大学附属肿瘤医院提供，收集2003年8月至2005年4月入院的弥漫大B型淋巴瘤患者152例；正常对照样品由广州市中心血站和中山大学附属第五医院提供，共收集354例。年龄和性别分布在患者和正常对照两组标本中没有显著的差异(表6)，实验设计可靠。
表6病例-对照群体性别、年龄分布
用常规酚氯仿方法从人的血液中提取DNA，浓度校正至25ng/ul，作为DNA模板。
第二步 设计寡核苷酸引物序列，进行聚合酶链式反应(PCR)扩增引物如下(均为5’-3’方向)第二号外显子正向引物AATCTCATTTATCTGGACTATCAAC反向引物TCGATAATATTTCTTTCTCAACTG 退火温度54℃第五号外显子正向引物TCATTATGTCTCATTAAAATGCTAT反向引物GGACACAGGGAAAGTCCTAC 退火温度53℃PCR反应体系20ul，在PTC-100或PTC-200型PCR仪进行，具体反应成分如下(表7)表7BCRP基因第二、五、九外显子PCR反应体系
PCR反应条件(1)94℃ for 4min，1 cycle(2)94℃ for 1min，annealing temp.for 30sec，70℃ for 45see，35 cycles，(3)70℃ for 6min，1 cycle扩增后得到BCRP基因外显子区域的DNA序列。
第三步 SSCP跑胶并测序将第二步所得的PCR产物取2ul，加入甲酰胺加样缓冲液10ul，95℃变性8min。在arc∶bis为37.5∶1的PAGE胶上5W跑8h，每个样品加样4ul，跑出不同带型样品各取其一，纯化测序，找出SNP位点。
2.数据统计和分析BCRP基因多态性位点在病人和正常人的频率分布信息见表8表8BCRP基因的SNP及基因型频率分布
建立SPSS SNP基因分型数据库，应用卡方检验，并进行年龄性别分层分析，发现含有等位基因A的基因型(CA和AA)的个体比带CC纯合型个体更易感染弥漫大B型淋巴瘤(表1)，特别40岁以下的男性个体这种易感性表现更显著(表2)，提示A等位基因是弥漫大B型淋巴瘤的危险等位基因。对等位基因频率进行卡方分析，也得出同样的结论，即A等位基因是弥漫大B型淋巴瘤的易感等位基因(表3，4)3.基于Bialelic-ARMS方法的检测试剂盒制备检测弥漫大B型淋巴瘤患者易感性的试剂盒，其中包括表4所示的两对引物，PCR反应所需试剂(10*buffer，Mgcl2，dNTP，Taq酶)，PCR反应之后只要跑一个琼脂糖凝胶就可以轻易检测出C421A位基因型。
本发明具有实用性的例证1)所建立的方法可以简便快速地检测位于4q22区域BCRP基因上单核苷酸多态性位点C421A的基因型，通过A等位基因的有无来辅助诊断弥漫大B型淋巴瘤患者并对个体是否具有弥漫大B型淋巴瘤的易感性进行评判，从而有利于疾病的预防、早期诊断和治疗。
2)可以利用本发明所介绍的方法以及上述1)所述，把C421A的A等位位点作为药物设计靶点来进行药物筛选，促进新的抗弥漫大B型淋巴瘤药物的出现。
3)采用本发明提供的弥漫大B型淋巴瘤相关基因及多态位点的核酸序列，构建对弥漫大B进行遗传学诊断的试剂盒。
4)采用本发明提供的引物序列可以特异、高效地检测出G34A和C421A位点的基因型。
5)本发明公布的G34A位点在汉族人群中未显示与弥漫大B型淋巴瘤相关，但它可能引起其他疾病的发生，是潜在的药物设计靶点。
此外，C421A是一个错义突变的单核苷酸位点，它的变化会造成氨基酸序列由谷胺酰氨(中性氨基酸)到赖氨酸(碱性氨基酸)的改变，使得乳腺癌抗性蛋白的结构和功能发生变化。
权利要求
1.一种检测BCRP基因第五外显子的单核苷酸多态性的方法，其特征在于其包括步骤(a)确定在人BCRP基因第五外显子的BCRPE5所示序列的第78位的核苷酸；(b)检测在所述位置是否存在单核苷酸多态性。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的单核苷酸多态性是在第78位存在A。
3.一种分离的核酸，其特征在于它具有BCRPE5所示序列，且第78位是A。
4.BCRPE5所示序列的等位基因特异性的核酸引物，其特征在于该核酸引物包括BCRPF、BCRPR、BCRPAF、BCRPCR所示核苷酸序列。
5.一种弥漫大B淋巴瘤的诊断试剂盒，其特征在于其包括(a)权利要求4所述的核酸引物；(b)PCR反应所需要的试剂。
全文摘要
本发明公开了一个与弥漫大B型淋巴瘤易感性密切相关单核苷酸多态性(SNP)位点C421A(位于第五外显子，谷胺酰氨/赖氨酸，rs rs2231142，rs12721641，rs28365035)。此位点上携带A等位基因的个体为弥漫大B型淋巴瘤易感人群，特别是携带A等位基因的40岁以下的男性对弥漫大B型淋巴瘤更易感。此多态位点及其编码的蛋白对阐明弥漫大B型淋巴瘤遗传学机制，建立基因诊断方法，指导弥漫大B型淋巴瘤预防、开发新型治疗药物具有重要意义。本发明还基于临床有意义的SNPs位点，建立二等位基因特异的多重PCR方法(Bialelic－ARMS)，以便快速有效的筛选淋巴瘤高危人群，并指导临床上对抗癌药物种类及剂量的选择。
文档编号C12Q1/68GK1896277SQ20061003260
公开日2007年1月17日 申请日期2006年1月9日 优先权日2006年1月9日
发明者庄诗美, 胡丽莉, 程家森, 杨金娥, 张宴 申请人:中山大学