专利名称：用于评估b细胞淋巴瘤对抗cd40抗体治疗的响应性的方法和组合物的制作方法
技术领域：
一般而言，本发明涉及预测、评估、帮助评估B细胞淋巴瘤对抗CD40抗体治疗的响 应性的领域。
背景技术：
CD40是肿瘤坏死受体超家族的I型跨膜蛋白质。CD40是涉及B细胞增殖和分化、 免疫球蛋白同种型转换、及细胞存活力的重要分子。受体信号传导由CD40结合CD40配体 (⑶40L或⑶154)来启动，⑶40配体主要在活化的⑶4+T细胞上表达。在正常细胞上，⑶40在具有高度增殖潜力的细胞上表达，包括造血祖细胞、上皮和 内皮细胞，及所有抗原呈递细胞(树突细胞、活化的B淋巴细胞、和活化的单核细胞)。CD40 在数种类型的B细胞血液学恶性肿瘤上高度表达，包括多发性骨髓瘤、非何杰金氏淋巴瘤 (NHL)、和慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。⑶40表达在B细胞恶性肿瘤上的高度流行使之成 为基于抗体的癌症疗法的诱人的潜在靶物。CD40还在大多数膀胱癌、显著比例的其它实体 瘤(包括头颈癌、肾细胞癌、卵巢和肺癌)上表达。抗⑶40抗体及其用于治疗B细胞血液学恶性肿瘤的用途已有记载。参见例 如美国专利 6，946，129 ；6，843，989 ；6，838，261 ；WO 2000/075348 ；US-2002-0197256 ；WO 2006/128103 ；和WO 2007/075326。已经显示了人源化抗CD40抗体经由直接信号转导在 血液学肿瘤细胞的一个子集中诱导⑶40阳性细胞的生长抑制和凋亡。WO 2006/128103 ； WO 2007/075326。另外，人源化抗⑶40抗体经免疫效应器功能杀死肿瘤细胞，包括抗体依 赖性细胞的细胞毒性(ADCC)和抗体依赖性细胞的吞噬(ADCP)。在体内，使用多发性骨髓 瘤(MM)和非何杰金氏淋巴瘤(NHL)的异种移植物模型，抗⑶40抗体在重度联合免疫缺陷 (SCID)小鼠中遏制肿瘤生长并改善存活。在数种模型中比较抗CD40抗体与利妥昔单抗 (Genentech, Inc.)揭示了抗⑶40抗体的抗肿瘤活性至少像利妥昔单抗一样有效。Seattle Genetics在2004年在具有复发性和顽固性多发性骨髓瘤(MM)的患者中 用人源化抗CD40抗体以单药多剂试验启动了 I期临床试验。随后，在具有复发性非何杰金 氏淋巴瘤(NHL)和慢性淋巴细胞性淋巴瘤(CLL)的患者中启动了 I期试验。来自这些I期 试验的结果显示了在病情稳定且M蛋白降低的骨髓瘤患者、具有部分和完全响应的NHL患 者、和病情稳定的CLL患者中的抗肿瘤活性的证据。与2006年12月在复发性弥漫性大B 细胞淋巴瘤(DLBCL)中启动了抗CD40抗体的II期试验。虽然已经显示了抗⑶40抗体能诱导⑶40阳性细胞的生长抑制和凋亡，而且在多 种类型的B细胞淋巴瘤患者中可具有抗肿瘤活性，但是并非所有B淋巴瘤细胞都对由抗 CD40抗体介导的细胞死亡敏感。仍然需要为B细胞淋巴瘤患者对抗CD40抗体疗法的响应性鉴定一种或多种预测标志物。通过述及完整收录本文中所引用的所有参考文献(包括专利申请和出版物)。发明概述本发明提供了用于预测、评估或帮助评估具有某种类型的B细胞淋巴瘤的受试者 对抗CD40抗体治疗的响应性的方法和组合物。一方面，本发明提供了用于评估或帮助评估具有B细胞淋巴瘤的受试者对抗CD40 抗体治疗的响应性的方法，包括与参照水平比较来自所述受试者的B细胞淋巴瘤样品中表 2-4、6、7和13中至少一种标志物基因的测量表达水平。另一方面，本发明提供了用于在具有B细胞淋巴瘤的受试者中预测抗CD40抗体治 疗的响应性或监测治疗/对抗CD40抗体治疗的响应性的方法，包括与参照水平比较来自所 述受试者的B细胞淋巴瘤样品中表2-4、6、7和13中至少一种标志物基因的测量表达水平。另一方面，本发明提供了用于预测、评估或帮助评估具有B细胞淋巴瘤的受试者 对抗CD40抗体治疗的响应性的方法，包括下述步骤(a)测量自所述受试者获得的包含B 淋巴瘤细胞的样品中选自下组的一种或多种标志物基因的表达水平IFITM1、⑶40、RGS13、 VNN2、LM02、CD79B、CD22、BTG2、IGF1R、CD44、CTSC、EPDRl、UAP1、和 PUS7 ； (b)基于来自步骤
(a)的一种或多种标志物基因的测量表达水平预测所述受试者是否有可能响应抗CD40抗 体治疗。在一些实施方案中，测量来自该组的至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至 少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种、至少i^一种、至少十二种、至少十三种、 或至少十四种标志物基因的表达水平并用于预测、评估、或帮助评估。在一些实施方案中， 所述预测、评估、或帮助评估是通过与参照水平比较一种或多种标志物基因的测量表达水 平来确定的。在一些实施方案中，参照水平是基于如下样品中相应标志物基因的测量表达 水平而确定的值或范围，所述样品包含B淋巴瘤细胞且来自在抗CD40抗体治疗后肿瘤体积 增大或缩小的受试者。另一方面，本发明提供了为具有B细胞淋巴瘤的受试者制备个性化基因型序型 (personalized genomics profile)的方法，包括下述步骤(a)测定自所述受试者获得的 包含B淋巴瘤细胞的样品中选自下组的一种或多种标志物基因的表达水平IFITM1、⑶40、 RGS13、VNN2、LM02、CD79B、CD22、BTG2、IGF1R、CD44、CTSC、EPDRU UAP1、PUS7、和 BCL6 ；并
(b)生成总结步骤(a)中获得的一种或多种标志物基因的表达水平的报告。在一些实施方 案中，测量来自该组的至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少 八种、至少九种、至少十种、至少十一种、至少十二种、至少十三种、至少十四种、或至少十五 种标志物基因的表达水平并用于生成个性化基因组序型的报告。在一些实施方案中，所述 报告包括对所述受试者推荐抗CD40抗体治疗。在一些实施方案中，所述推荐是通过与参照 水平比较标志物基因的测量表达水平而确定的。在一些实施方案中，参照水平是基于如下 样品中相应标志物基因的测量表达水平而确定的值或范围，所述样品来自在抗CD40抗体 治疗后肿瘤体积增大或缩小的受试者且包含B淋巴瘤细胞。另一方面，本发明提供了用于预测、评估或帮助评估具有B细胞淋巴瘤的受试者 对抗CD40抗体治疗的响应性的方法，包括下述步骤(a)测量自所述受试者获得的包含B 淋巴瘤细胞的样品中选自下组的至少两种标志物基因的表达水平IFITM1、⑶40、RGS13、 VNN2、LM02、CD79B、CD22、BTG2、IGF1R、CD44、CTSC、EPDRl、UAPUP PUS7 ； (b)基于步骤(a)中的标志物基因的测量表达水平通过下述方程计算敏感指数值(Si)
P X -LlSI = Jjj^L
片Vcr"其中测量表13所示至少一种具有正关联值的标志物基因的和至少一种具有负关 联值的标志物基因的表达水平；其中⑴β j是所测量的每一种标志物基因的系数值；(ii)p是所测量的标志物基 因的数目；GiiUi是对于来自要测量表达水平的受试者的样品所测量的每一种标志物的 经过换算、标准化的表达水平；而(iV) μ j和σ j是所测量的每一种标志物基因的均值和标 准偏差；其中β” μ ^和ο ^是自包含B淋巴瘤细胞的患者样品确定的。在一些实施方案 中，敏感指数的值等于或大于零指示所述受试者有可能响应抗CD40抗体治疗，或者敏感指 数的值小于零指示所述受试者不太可能响应抗CD40抗体治疗。在一些实施方案中，测量 至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种、至少 十一种、至少十二种、至少十三种、或至少十四种标志物基因的表达水平并用于计算敏感指 数。在一些实施方案中，测量 IFITMl、RGS13、CD79B、CD22、BTG2、CD44、EPDRUP UAPl 的表 达水平并用于计算敏感指数。另一方面，本发明提供了用于治疗具有B细胞淋巴瘤的受试者的方法，包括对所 述受试者施用有效量的抗CD40抗体，其中已经通过本文所述方法评估了所述受试者中的B 细胞淋巴瘤的响应性。另一方面，本发明提供了用于治疗具有B细胞淋巴瘤的受试者的方 法，包括a)通过与参照水平比较来自受试者的B细胞淋巴瘤样品中表2-4、6、7和13中至少 一种标志物基因的测量表达水平以评估所述受试者中的B细胞淋巴瘤是否适合于抗CD40 抗体治疗来为抗CD40抗体治疗选择受试者；并对所述受试者施用有效量的抗CD40抗体。在一些实施方案中，所述参照水平是来自所述受试者的B细胞淋巴瘤样品中表8 或表9中一种或多种参照基因的测量表达水平。在一些实施方案中，所述参照水平是不同B细胞淋巴瘤样品中标志物基因的测量 表达水平。在一些实施方案中，所述不同B细胞淋巴瘤样品包含对由抗⑶40抗体诱导的细 胞死亡有抗性的B淋巴瘤细胞。在一些实施方案中，标志物基因的测量表达水平和/或参照水平是标准化的。在一些实施方案中，与一种或多种参照水平比较来自受试者的B细胞淋巴瘤样品 中表2-4、6、7和13中至少两种、至少五种、至少十种、至少十五种、或至少二十种基因的测 量表达水平。在一些实施方案中，通过检测mRNA表达(例如实时定量逆转录PCR(qRT-PCR))和 /或检测蛋白质表达(例如免疫组织化学(IHC))来测量表达水平。在一些实施方案中，所测量的标志物基因包括一种或多种⑶40配体下调基因(例 如 VNN2、MEF2C、LTB、KCNN3、NCF1、BCL6、IGJ、ELTI1902、PN0C、CSF2RBJP P0U2AF1)。在一些 实施方案中，所测量的标志物基因包括B细胞受体信号传导途径中的一种或多种基因(例 如 CD22、RGS13JPMEF2B)。在一些实施方案中，与一种或多种参照水平比较来自受试者的B细胞淋巴瘤样品 中选自下组的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至 少八种、至少九种、至少十种、至少十一种、至少十二种、至少十三种、或至少十四种基因的
8表达水平VNN2、MEF2C、LTB、KCNN3、NCFl、BCL6、IGJ、ELTI1902、PNOC, CSF2RB、P0U2AF1、 CD22、RGS13、和 MEF2B。在一些实施方案中，比较B细胞淋巴瘤样品中选自下组的一个或多个基因对的表 达水平VNN2 和 EPDR1、RGS13 和 EPDR1、CD22 和 EPDR1、LRRC8A 和 PRPSAP2、CD40 和 IGF1R、 IFITMl和BTG2、SMNl和LM02、PRKCA和YIPF3。在一些实施方案中，比较B细胞淋巴瘤样 品中选自下组的一个或多个基因对的表达水平VNN2和EPDR1、RGS13和EPDR1、⑶22和 EPDRU LRRC8A 禾口 PRPSAP2、CD40 禾口 IGF1R、IFITMl 禾口 BTG2、SMNl 禾口 LM02、PRKCA 禾口 YIPF3， 并作为使用所述基因对的log2刻度表达(l0g2-SCale expression)的带正负号的t得分 (signed t-score)之和计算的敏感指数来评估B细胞淋巴瘤对抗⑶40抗体治疗的响应性。在一些实施方案中，所述B细胞淋巴瘤是非何杰金氏淋巴瘤(non-Hodgkin' s lymphoma) (NHL)，包括但不限于滤泡性淋巴瘤(fol 1 icuIarlymphoma)、复发性滤泡性 淋巴瘤(relapsed follicular lymphoma)、小淋巴细胞性淋巴瘤(small lymphocytic lymphoma)、套细胞性淋巴瘤(mantle cell lymphoma)、边缘区淋巴瘤(marginal zone lymphoma)、淋巴菜细胞性淋巴瘤(lymphoplasmacytic lymphoma)、章样肉芽月中病(mycosis fungoides) /塞扎里综合征(Sezary syndrome)、脾边缘区淋巴瘤(splenic marginal zone lymphoma)、和弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma)。在一些实施 方案中，所述B细胞淋巴瘤选自下组无痛性淋巴瘤(indolent lymphoma)、攻击性淋巴瘤 (aggressive lymphoma)、禾口高度攻击性淋巴瘤(highly aggressive lymphoma)。又一方面，本发明提供了试剂盒，包含用于测量表2_4、6、7和13中至少一种标志 物基因的表达水平的试剂。在一些实施方案中，所述试剂盒包含用于通过PCR扩增表2-4、 6、7和13中至少一种标志物基因的至少一对引物。例如，可使用表10所示正向和反向引 物。所述试剂盒可进一步包含用于扩增表8中参照基因的一对引物。所述试剂盒可进一步 包含附着有用于检测扩增基因产物的探针的表面，诸如微阵列，而且本发明涵盖和包括此 类表面。在一些实施方案中，所述试剂盒包含用于通过qRT-PCR检测表2_4、6、7和13中一 种标志物基因的表达水平的至少一对引物和至少一种探针。所述试剂盒可进一步包含用于 通过qRT-PCR检测表8中参照基因的表达水平的一对引物和一种探针。例如，可使用表10 所示引物和探针组来通过qRT-PCR检测基因表达水平。在一些实施方案中，所述试剂盒包 含特异性识别由标志物基因编码的一种或多种蛋白质的一种或多种抗体。所述试剂盒可进 一步包含用于实施本文所述任何方法的其它试剂和/或指令。应当理解，可以组合本文所述各个实施方案的一个、一些、或所有特征以形成本发 明的其它实施方案。本发明的这些和其它方面对于本领域技术人员会变得显而易见的。附图简述
图1。BASS0_GERMINAL_CENTER_CD40_DN基因集内基因的富集图。上部的图代表来 自中等t检验(moderated t-test)分级基因(表T)间的富集得分分布。下部的图展示富 集关于称作signaUnoice (信噪比)的分级列表度量(ranked list metric)的分布。总 之，这些图清楚显示了该基因集在抗CD40 Ab. 1敏感性细胞中强烈富集。图2。VNN2 ( 一种⑶40L下调基因)在对抗⑶40 Ab. 1敏感的NHL细胞中过表达， 而且在敏感的和抗性的两类之间区分。棒图代表mRNA表达水平，线图代表IC25值。图3A至3C。RGS13、CD22、和MEF2B生发中心B标志物在对抗CD40Ab. 1敏感的和中间NHL细胞中过表达，而且能以合理的准确度在敏感的和抗性的两类之间区分。棒图代 表mRNA表达水平，线图代表IC25值。图4。NHL细胞系间的抗⑶40Ab. 1敏感指数评分。基于mRNA表达数据对每种细胞 系应用逐步线性建模和基因对评分。针对χ轴上的NHL细胞系绘图，第一 y轴展示抗CD40 Ab. 1敏感指数，而第二 y轴展示抗⑶40 Ab. 1 IC25值。抗⑶40 Ab. 1敏感指数高(大于_4) 代表细胞系是敏感性的概率升高。图5。⑶40签名基因与抗⑶40. Ab. 1敏感性的关联。图6-1至6-35。表7和表10所列基因的基因库序列。编码VNN2 (图6_1 =SEQID NO :258)、RGS13(图 6-2 :SEQ ID NO :259)、CD22 (图 6-3 和 6-4 :SEQ IDNO :260)、LRRC8A (图 6-5 =SEQ ID NO 261)、CD40 (图 6-6 :SEQ ID NO 262)、IFITMl (图 6-7 :SEQ ID NO 263)、 PRKCA (图 6-8 至6-10 SEQ ID NO :264)、BCL6 (图 6-11 和 6-12 :SEQ ID NO :265)、EPDR1 (图 6-13 =SEQ ID NO 266)、PRPSAP2 (图 6-14 :SEQ ID NO 267)、IGFlR (图 6-15 至 6-18 =SEQ ID NO 268)、BTG2 (图 6-19 和 6-20 :SEQ ID NO 269)、LM02 (图 6-21 :SEQ ID NO 270)、 YIPF3 (图 6-22 =SEQ ID NO :271)、SMNl (图 6-23 :SEQ ID NO 272)、CD79B (图 6-24 =SEQ ID NO 273)、CD44(图 6-25 和 6-26 :SEQ ID NO 274)、CTSC(图 6-27 :SEQ ID NO 275)、 UAPl (图 6-28 SEQ ID NO :276)、PUS7 (图 6-29 和 6-30 :SEQ ID NO 277)、RGS 13 (图 6-31: SEQ ID NO :278)、CD22(图 6-32和 6-33 :SEQ ID NO 279)、SMNl (图 6-34 SEQ ID NO :280)、 和 YIPF3(图 6-35 =SEQ ID NO 281)的 mRNA 的核酸序列。图7。多变量敏感指数和临床试验001中21名患者肿瘤直径乘积之和(SPD)测量 的百分比变化的关联。SPD百分比变化是通过与基线SPD比较最小基线后SPD来确定的。 正变化指示肿瘤体积增大，而负变化指示肿瘤体积缩小。用于计算敏感指数的重量(系数) 显示于表14。较大的多变量敏感指数值与基线后SPD降低有关(Sperman氏P = -0. 58 ； P = O. 006))。图8。BCL6表达和26名具有DLBCL的患者的SPD测量的百分比变化的关联。SPD 百分比变化是通过与基线SPD比较最小基线后SPD来确定的。正变化指示肿瘤体积增大， 而负变化指示肿瘤体积缩小。发明详述本发明基于如下的发现，即某些基因(表2_4、6、7、和13中所显示的基因)在对抗 CD40抗体诱导的细胞死亡敏感的B淋巴瘤细胞与对抗CD40诱导的细胞死亡有抗性的B淋 巴瘤细胞之间差异表达。来自实施例2中所描述的临床试验的数据指示表13中所显示的 14种基因的表达水平与对抗⑶40 Ab. 1治疗的响应性高度有关。一些在敏感性B淋巴瘤细 胞与抗性B淋巴瘤细胞之间差异表达的基因是CD40配体下调途径基因；而一些在B细胞受 体信号传导途径中。因而，这些差异表达基因中一种或多种的表达水平可用于评估或帮助 评估具有B细胞淋巴瘤的受试者对抗CD40抗体治疗的响应性，预测受试者对抗CD40抗体 治疗的响应性，及监测受试者中的治疗/响应性。A.通用技术除非另有说明，本发明的实施将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、 细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些都在本领域的技术范围内。这些技术在 文献中有充分解释，诸如 “Molecular Cloning =ALaboratory Manual”，第二版(Sambrook
10et al. ,1989) ；"OligonucleotideSynthesis" (M.J.Gait He,1984) ；"Animal Cell Culture，，(R. I. Freshney 编，1987) ；“Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.)； "Current Protocols inMolecular Biology" (F. M. Ausubel et al.编，1987，及其周期性 的更新)；“PCR:The Polymerase Chain Reaction”(Mullis et al.编，1994)。本发明中所使用的引物、寡核苷酸和多核苷酸可利用本领域已知的标准技术生 成。除非另有定义，本文中所使用的技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人 员通常的理解具有相同的含义。以下文献为本领域技术人员提供了本申请中所使用的许 多术语的一般性指导:Singleton et al. , Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology,第 二 版，J. Wiley&Sons(New York, N. Y. 1994)，禾口 March，Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms andStructure,第四版，John Wiley&Sons (New York, N. Y. 1992)。B.定义如本文中所使用的，术语“具有B细胞淋巴瘤的受试者”和“B细胞淋巴瘤患者”指 已经诊断为具有某类型的B细胞淋巴瘤或者已经给予某类型的B细胞淋巴瘤的可能诊断的 受试者。如本文中所使用的，术语“生物标志物”或“标志物” 一般指其在哺乳动物组织或 细胞中或上的表达或分泌可以通过已知方法(或本文中所公开的方法)来检测且预示或可 用于预测(或帮助预测)哺乳动物细胞或组织对基于抗CD40抗体的治疗方案的敏感性及 在一些实施方案中预测(或帮助预测)个体对基于抗CD40抗体的治疗方案的响应性的分 子，包括基因、蛋白质、碳水化合物结构、或糖脂。、术语“样品”在用于本文时指获得自或衍生自感兴趣的受试者的组合物，其包含有 待例如根据物理、生化、化学和/或生理特点来表征和/或鉴定的细胞和/或其它分子实 体。例如，短语“疾病样品”及其各种变化形式指得自感兴趣的受试者的任何样品，预计或 已知其包含待表征的细胞和/或分子实体。“组织或细胞样品”指从受试者或患者的组织得到的相似细胞的集合。组织或细 胞样品的来源可以是实体组织，像来自新鲜的、冷冻的和/或保存的器官或组织样品或活 检样品或穿刺样品；血液或任何血液组分；体液，诸如脑脊液、羊膜液(羊水)、腹膜液(腹 水)、或间隙液；来自受试者的妊娠或发育任何时间的细胞。组织样品还可以是原代的或培 养的细胞或细胞系。任选的是，组织或细胞样品是从疾病组织/器官得到的。组织样品可 能包含在自然界中天然不与组织混杂的化合物，诸如防腐剂、抗凝剂、缓冲剂、固定剂、营养 物、抗生素、等等。为本发明目的，组织样品的“切片”指一块或一片组织样品，例如从组织样品上切 下来的一薄片组织或细胞。应当了解，可以制作多片组织样品切片并依照本发明进行分析， 前提是应当了解，本发明包括将组织样品的同一切片用于形态学和分子两个水平的分析或 者针对蛋白质和核酸二者进行分析的方法。如本文中所使用的，“B细胞淋巴瘤样品”或“包含B淋巴瘤细胞的样品”指含有来 自已经诊断为具有某类型的B细胞淋巴瘤的受试者或患者的B淋巴瘤细胞的组织或细胞样
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如本文中所使用的，用于“帮助评估”的方法指帮助做出临床决策的方法(例 如B细胞淋巴瘤对抗⑶40抗体治疗的响应性)，而且对于确定性评估(definitive assessment)可以是或不是结论性的。“受试者”或“个体”指哺乳动物，更优选人。哺乳动物包括但不限于人、灵长类、家 畜、体育运动用动物、啮齿类、和宠物(例如犬和猫)。如本文中所使用的，“参照值”可以是绝对值；相对值；具有上限和/或下限的数 值；数值范围；平均值；中值；均值；或与特定对照或基线值比较的数值。术语“阵列”或“微阵列”在用于本文时指可杂交阵列元素，诸如多核苷酸探针(例 如寡核苷酸)和抗体在基片上的有序排列。基片可以是固体基片(诸如玻璃载玻片)或半 固体基片(诸如硝酸纤维素膜)。核苷酸序列可以是DNA、RNA、或其任意排列。“扩增”在用于本文时一般指生成多拷贝的所需序列的过程。“多拷贝”指至少2个 拷贝。“拷贝”不必指与模板序列有完美的序列互补性或同一性。例如，拷贝可包括诸如脱 氧肌苷的核苷酸类似物、故意引入的序列改变(诸如通过包含能与模板杂交但不互补的序 列的引物而引入的序列改变)、和/或在扩增过程中发生的序列错误。若基因或生物标志物在第一样品中的表达水平/量是该基因或生物标志物在第 二样品中的表达水平/量的至少约1. 5倍、1. 75倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9 倍或10倍，则该基因或生物标志物在第一样品中的表达水平/量的“大于”在第二样品中 的水平。表达水平/量可以基于本领域已知的任何合适标准来测定，包括但不限于mRNA、 cDNA、蛋白质、蛋白质片段和/或基因拷贝。表达水平/量可以定性和/或定量测定。“多核苷酸”或“核酸”在本文中可互换使用，指任何长度的核苷酸聚合物，包括DNA 和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经过修饰的核苷酸或碱基、和/或其类 似物，或者是可通过DNA或RNA聚合酶掺入聚合物的任何底物。多核苷酸可包含经过修饰 的核苷酸，诸如甲基化核苷酸及其类似物。如果有的话，对核苷酸结构的修饰可以在装配聚 合物之前或之后进行。核苷酸序列可以由非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在聚合后进一 步修饰，诸如通过与标记用组分偶联。其它类型的修饰包括例如“帽”，将一个或多个天然存 在的核苷酸用类似物替代，核苷酸间修饰诸如例如具有不带电荷连接(例如膦酸甲酯、磷 酸三酯、磷酰胺酯(phosphoamidate)、氨基甲酸酯等)和具有带电荷连接(例如硫代磷酸 酯、二硫代磷酸酯等)的修饰，含有悬垂模块(pendant moiety)诸如例如蛋白质(例如核 酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚L-赖氨酸等)的修饰、具有嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等) 的修饰、含有螯合剂(例如金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)的修饰、含有烷化剂的修 饰、具有经修饰连接(例如α端基异构核酸(anomeric nucleicacid)等)的修饰、以及未 修饰形式的多核苷酸。另外，通常存在于糖类中的任何羟基可以用例如膦酸(phosphonate) 基团、磷酸(phosphate)基团替换，用标准保护基团保护，或活化以制备与别的核苷酸的别 的连接，或者可偶联至固相支持物。5'和3'末端OH可磷酸化或者用胺或1-20个碳原子 的有机加帽基团模块取代。其它羟基也可衍生成标准保护基团。多核苷酸还可含有本领 域普遍知道的核糖或脱氧核糖糖类的类似物形式，包括例如2'-氧-甲基、2'-氧-烯 丙基、2' _氟-或2'-叠氮-核糖，碳环糖类似物，α-端基异构糖，差向异构糖诸如阿 拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖，无环类似物及脱碱基核苷类似物诸如 甲基核糖核苷。可用备选连接基团替换一个或多个磷酸二酯连接。这些备选连接基团包括但不限于以下实施方案，其中磷酸酯用P(0)S( “硫代酸酯”(thioate))、P(S) S( “二硫 代酸酯”(dithioate))、(O)NR2( “酰胺酯”(amidate))、P(0)R、P(O)OR'、CO 或 CH2( “甲 缩醛”(formacetal))替代，其中R或R'各自独立为H或者取代或未取代的烷基(1_20个 C)，任选含有醚(-0-)连接、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基(araldyl)。并非多核苷酸 中的所有连接都必需是相同的。前述描述适用于本文中提及的所有多核苷酸，包括RNA和 DNA。“寡核苷酸”在用于本文时一般指短的多核苷酸，一般是单链，一般是合成的，长度 一般但不是必需小于约200个核苷酸。术语“寡核苷酸”与“多核苷酸”并不互相排斥。上 文关于多核苷酸的描述同样且完全适用于寡核苷酸。“引物”一般是短的单链多核苷酸，一般具有游离的3' -OH基团，其通过与靶序列 杂交而结合目的样品中潜在存在的靶，然后促进与靶互补的多核苷酸的聚合。“引物对”指 可用于扩增特定靶基因的一部分的5’引物和3’引物。术语“3'(端)” 一般指多核苷酸或寡核苷酸中位于同一多核苷酸或寡核苷酸中 某一区域或位置的3'端(下游)的另一区域或位置。术语“5'(端)”一般指多核苷酸 或寡核苷酸中位于同一多核苷酸或寡核苷酸中某一区域或位置的5'端(上游)的另一区 域或位置。短语“基因扩增”指通过它在特定细胞或细胞系中形成多个拷贝的基因或基因 片段的过程。所复制的区域(一段扩增的DNA)常常称为“扩增子”。通常，所生成的信使 RNA(mRNA)的量，即基因表达的水平，也按所表达特定基因生成的拷贝数的比例升高。“检测”包括任何检测手段，包括直接和间接检测。术语“预测”在本文中用于指患者会对药物或药物集有利地或不利地响应的可能 性。在一个实施方案中，预测涉及那些响应的程度。在一个实施方案中，预测涉及治疗(例 如用特定治疗剂进行的治疗)后患者是否会存活或改善且某段时间没有疾病复发和/或患 者会这样的概率。通过为任何特定患者选择最适合的治疗形态，本发明的预测方法可在临 床上用于作出治疗决策。本发明的预测方法在预测患者是否可能有利地响应治疗方案(诸 如给定的治疗方案，包括例如施用给定的治疗剂或组合、手术干预、类固醇治疗等)或患者 是否可能在治疗方案后长期存活中是有价值的工具。术语“长期”存活在用于本文时指治疗性处理后存活至少1年、5年、8年、或10年。“患者响应”可利用表明对患者有益处的任何终点来评估，包括但不限于(1) 一定 程度地抑制疾病进展，包括减缓和完全阻滞；(2)减少疾病事件和/或症状的数目；(3)缩 小损害尺寸；⑷抑制(即减轻、减缓或完全终止)疾病细胞浸润入临近周围器官和/或组 织；(5)抑制(即减轻、减缓或完全终止)疾病扩散；(6) 一定程度地减轻与病症有关的一种 或多种症状；(7)治疗后无疾病呈现的长度延长；和/或(8)治疗后给定时间点的死亡率降 低。术语“抗体”以最广义使用，明确覆盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多特异 性抗体(例如双特异性抗体)、及抗体片段，只要它们展现出期望的生物学活性或功能。“抗体片段”包含全长抗体的一部分，通常是抗体的抗原结合区或可变区。抗体片 段的例子包括Fab、Fab'、F(ab' )2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；及由抗 体片段形成的多特异性抗体。
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“Fv”是包含完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。此片段由紧密、非共价结 合的一个重链可变区和一个轻链可变区的二聚体组成。从这两个结构域的折叠中发出六个 高变环(重链和轻链各3个环)，贡献出抗原结合的氨基酸残基并赋予抗体以抗原结合特异 性。然而，即使是单个可变区(或只包含对抗原特异的三个CDR的半个Fv)也具有识别和 结合抗原的能力，尽管亲和力低于完整结合位点。术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成 群体的各个抗体相同和/或结合相同表位，除了生产单克隆抗体的过程中可能产生的可能 变体外，此类变体一般以极小量存在。此类单克隆抗体典型的包括包含结合靶物的多肽序 列的抗体，其中靶物结合多肽序列是通过包括从众多多肽序列中选择单一靶物结合多肽序 列在内的过程得到的。例如，选择过程可以是从众多克隆诸如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重 组DNA克隆的集合中选择独特克隆。应当理解，选定的靶物结合序列可进一步改变，例如为 了提高对靶物的亲和力、将靶物结合序列人源化、提高其在细胞培养物中的产量、降低其在 体内的免疫原性、创建多特异性抗体等，而且包含改变后的靶物结合序列的抗体也是本发 明的单克隆抗体。与典型的包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物 不同，单克隆抗体制备物的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。在它们的特异性之 外，单克隆抗体制备物的优势在于它们通常未受到其它免疫球蛋白的污染。修饰语“单克 隆”指明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来生 产抗体。例如，将依照本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来生成，包括例如杂交瘤法 (例如Kohler et al. ,Nature 256 495(1975) ；Harlow et al. ,Antibodies :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 第 2 Hjx, 1988 ；Hammer ling et al., 于Monoclonal Antibodies and T-CellHybridomas, 563-681, Elsevier, N. Y. , 1981) > 重组DNA法(参见例如美国专利No. 4，816，567)、噬菌体展示技术(参见例如Clackson et al.，Nature 352 :624_628 (1991) ；Marks et al.，J. Mol. Biol. 222 581-597 (1991)； Sidhu et al. , J. Mol. Biol. 338(2) :299_310 (2004) ；Lee et al. , J. Mol. Biol. 340(5) 1073-1093(2004) ；Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 101(34) 12467-12472 (2004)； Lee et al. , J. Immunol. Methods 284 (1-2) 119-132 (2004))、及用于在具有部分或整 个人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物中生成人或人样抗体 的技术(参见例如 WO 1998/24893 ；WO 1996/34096 ；WO 1996/33735 ；W01991/10741 ； Jakobovits et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551(1993) ；Jakobovits et al., Nature 362:255-258(1993) ；Bruggemann et al. , Year inlmmuno. 7 :33 (1993)；美国专 利 No. 5，545，806 ；5，569，825 ；5，591，669 (都属于 GenPharm) ；5，545，807 ；WO 1997/17852 ； 美国专利 No. 5，545，807 ;5，545，806 ;5，569，825 ;5，625，126 ;5，633，425 ;5，661，016 ； Marks et al. , Bio/Technology10 779-783 (1992) ；Lonberg et al. , Nature 368 856-859(1994) ；Morrison, Nature368 812-813 (1994) ；Fishwild et al. ， Nature Biotechnology 14:845-851(1996) ；Neuberger, Nature Biotechnology 14:826(1996); Lonberg and Huszar, Intern.Rev. Immunol. 13 :65_93(1995))。单克隆抗体在本文中明确包括“嵌合”抗体。“嵌合”抗体(免疫球蛋白)中重链 和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列 相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(美国专利 No. 4, 816, 567 ；Morrison et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855(1984))。本文 中所使用的人源化抗体是嵌合抗体的一个子集。非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的 序列的嵌合抗体。在极大程度上，人源化抗体指人免疫球蛋白(受体抗体)中的高变区残 基用具有期望特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵 长类动物的高变区残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的Fv框架区 (FR)残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没 有找到的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能诸如结合亲和力。一般而言， 人源化抗体将包含至少一个、通常两个基本上整个如下可变域，其中所有或基本上所有高 变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR， 尽管FR可包含一处或多处提高结合亲和力的氨基酸替代。FR中这些氨基酸替代的数目 通常在重链中不超过6处，在轻链中不超过3处。人源化抗体任选还将包含至少部分免疫 球蛋白恒定区(Fe)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见Jones et al. , Nature 321:522-525(1986) ；Riechmann et al. , Nature 332:323-329(1988)；和 Presta，Curr. Op. Struct. Biol. 2 :593_596(1992)。“人抗体”指拥有与由人生成的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列和/或使用用 于生成人抗体的任何已知技术生成的抗体。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合 残基的人源化抗体。“亲和力成熟的”抗体指在抗体的一个或多个CDR/HVR中具有一处或多处改变、 导致该抗体对抗原的亲和力与没有这些改变的亲本抗体相比有所改进的抗体。优选的亲 和力成熟的抗体具有纳摩尔或甚至皮摩尔量级的对靶抗原的亲和力。亲和力成熟的抗体 可通过本领域已知规程来生成。Marks etal.，Bio/Technology 10 :779_783 (1992)记载 了通过VH和VL结构域改组进行的亲和力成熟。以下文献记载了⑶R/HVR和/或框架残 基的随机诱变Barbas etal.，Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91 :3809_3813(1994) ；Schier et al.，Genel69 147-155(1995) ；Yelton et al.，J.Immunol. 155 1994-2004(1995)； Jackson etal. ， J. Immunol. 154(7) 3310-9 (1995) ；Hawkins et al. ， J. Mol. Biol. 226 889-896(1992)。术语“Fe区”用于定义免疫球蛋白重链的C-端区域，其可以通过用木瓜蛋白酶消 化完整抗体而产生。Fc区可以是天然序列Fc区或变异Fc区。虽然免疫球蛋白重链Fc区的 边界可以变化，但是人IgG重链Fc区通常定义为自Fc区的大约Cys226位置或大约Pro230 位置的氨基酸残基至羧基末端的区段。免疫球蛋白的Fc区一般包含两个恒定域，即CH2结 构域和CH3结构域，而且任选包含CH4结构域。“Fe区链”在本文中指Fc区的两条多肽链 之一。抗体“效应器功能”指那些可归于抗体Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体 Fc区)且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括Clq结合和补 体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细 胞表面受体(例如B细胞受体)下调；和B细胞活化。“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”指其中结合到某些细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)上的分泌型 Ig使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合携带抗原的靶细胞，随后用细胞毒素杀死靶 细胞的细胞毒性形式。该抗体“武装”(arm)细胞毒性细胞，而且是此类杀伤作用绝对要求 的。介导ADCC的主要细胞，NK细胞，只表达Fc γ RIII，而单核细胞表达Fc y RI,Fc γ RII和 FcyRIII0 Ravetchand Kinet,Annu. Rev. Immunol. 9 :457_92 (1991)第 464 页表 3 总结了造 血细胞上的FcR表达。为了评估目的分子的ADCC活性，可进行体外ADCC测定法，诸如美国 专利No. 5，500，362或5，821，337或Presta美国专利No. 6，737，056中所记载的。可用于此 类测定法的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可 在体内评估目的分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如Clynes et al.，PNAS (USA) 95 652-656(1998)中所披露的。“处理”或“治疗”或“减轻”指治疗性处理，其中目标是若不能治愈则减缓(减轻) 所针对的病理学疾患或病症或者预防疾患的复发。如果在接受治疗量的CD40结合抗体后， 患者在特定疾病的一项或多项体征和症状中显示出可观察和/或可测量的降低或消失，那 么受试者成功“治疗” 了 B细胞恶性肿瘤。例如，显著的癌细胞数减少或癌细胞消失；肿瘤 体积缩小；肿瘤转移受到抑制(即一定程度的减缓，优选停止)；肿瘤生长受到一定程度的 抑制；消退期延长；和/或与特定癌症有关的一种或多种症状得到一定程度的减轻；发病率 和死亡率降低；及生命质量提高。疾病的体征或症状的减轻还可以由患者感受到。治疗可 实现完全响应，定义为癌症的所有体征消失，或者部分响应，其中肿瘤体积缩小，优选超过 50%，更优选75%。若患者的病情得到稳定，也认为患者得到治疗。在一项标准中，本发明 的抗体实现>95%的外周血B细胞消减且B细胞回到基线的25%。在一些实施方案中，抗 CD40抗体治疗有效导致癌症患者的癌症在治疗后3个月没有发展，优选治疗后6个月，更优 选1年，甚至更优选2年或更多年。用于评估疾病的成功治疗和改善的这些参数易于通过 本领域胜任的内科医师所熟悉的常规流程来测量。术语“非何杰金氏(Hodgkin)淋巴瘤”或“NHL”在用于本文时指何杰金氏淋巴瘤 以外的淋巴系统癌症。通常可通过何杰金氏淋巴瘤中存在里-施(Reed-Sternberg)细胞 而非何杰金氏淋巴瘤中不存在所述细胞将何杰金氏淋巴瘤与非何杰金氏淋巴瘤区分开来。“有效量”指在必需的剂量和时间上有效实现期望的治疗或预防效果的量。治疗剂 的“治疗有效量”可根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重及该抗体在个体中引发期 望应答的能力等因素而变化。治疗有效量还指该治疗剂的治疗有益效果胜过任何有毒或有 害后果的量。“预防有效量”指在必需的剂量和时间上有效实现期望的预防效果的量。通常 而非必然，由于预防剂量是在疾病发作之前或在疾病的早期用于受试者的，因此预防有效 量将低于治疗有效量。术语“持家基因”指所编码的蛋白质的活性对维持细胞功能来说是至关重要的一 组基因。这些基因通常在所有细胞类型中相似表达。“关联”或“联系”指以任何方式将第一分析或方案的性能和/或结果与第二分析 或方案的性能和/或结果进行比较。例如，可以将第一分析或方案的结果用于实施第二分 析或方案，和/或，可以使用第一分析或方案的结果来决定是否应当实施第二分析或方案。 就基因表达分析或方案的实施方案而言，可以使用基因表达分析或方案的结果来决定是否 应当实施特定治疗方案。
术语“标记物”在用于本文时指与试剂诸如核酸探针或抗体直接或间接偶联或融 合，以便于检测它所偶联或融合的试剂的化合物或组合物。标记物可以是自身可检测的 (例如放射性同位素标记物或荧光标记物)，或者在酶标记物的情况中，可催化可检测的底 物化合物或组合物的化学改变。如本文中所使用的，“一个”、“一种”、和“所述”、“该”可以指单数或复数(即可以 指一个/种或多个/种)，除非另有说明。C.本发明的方法本发明提供了用于评估或帮助评估具有B细胞淋巴瘤的受试者对抗CD40抗体治 疗的响应性的方法。本发明还提供了用于预测具有B细胞淋巴瘤的受试者中对抗CD40抗 体治疗的响应性或监测具有B细胞淋巴瘤的受试者中的抗CD40抗体治疗/对抗CD40抗体 治疗的响应性的方法。本发明提供了用于选择适合于接受抗CD40抗体治疗的具有B细胞 淋巴瘤的受试者及跟踪抗CD40抗体治疗的方法。在一些实施方案中，所述方法包括测量自 所述受试者获得的包含B淋巴瘤细胞的样品中表2-4、6、7、和13任一表中的一种或多种标 志物基因的表达水平；并基于所述一种或多种标志物基因的测量表达水平来预测、评估、或 帮助评估所述受试者对抗CD40抗体治疗的响应性。在一些实施方案中，所述方法包括将来 自所述受试者的B细胞淋巴瘤样品中表2-4、6、7、和13任一表中的至少一种标志物基因的 测量表达水平与参照水平比较各自的标志物基因。本发明的方法对于临床医师是有用的，即用来鉴定接受抗CD40抗体治疗的具有B 细胞淋巴瘤的患者，帮助抗CD40抗体疗法开发期间的患者选择，预测用特定治疗方案治疗 个别患者时成功的可能性，评估和监测疾病进展，监测治疗功效，及确定个别患者的预后。 任何这些实施方案包括在本发明内。在一些实施方案中，所述B细胞淋巴瘤是非何杰金氏淋巴瘤(NHL)，包括但不限于 滤泡性淋巴瘤、复发性滤泡性淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、套细胞性淋巴瘤、边缘区淋巴 瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、蕈样肉芽肿病/塞扎里综合征(Sezary Syndrome)、脾边缘区淋 巴瘤、和弥漫性大B细胞淋巴瘤。在一些实施方案中，所述B细胞淋巴瘤是无痛性的。在一些实施方案中，所述B细 胞淋巴瘤是攻击性的。在一些实施方案中，所述B细胞淋巴瘤是高度攻击性的。在一些实 施方案中，所述无痛性B细胞淋巴瘤是滤泡性淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、或小淋巴细胞性淋巴 瘤。在一些实施方案中，所述无痛性B细胞淋巴瘤是滤泡性淋巴瘤。标志物基因相对于参照水平，B细胞淋巴瘤样品中一种或多种标志物基因的表达水平可以在 本发明的方法中使用，诸如用于预测、评估或帮助评估B细胞淋巴瘤对抗CD40抗体治疗的 响应性。表2_4、6和7中显示了与抗性NHL细胞系相比在抗⑶40抗体敏感性NHL细胞系 中差异表达(统计学显著地升高或降低)的基因。“抗CD40抗体敏感性细胞”指如实施例 1所描述的那样测试，在抗CD40抗体对细胞存活力的降低中具有小于0. 4μ g/ml的IC25 值的细胞。“抗CD40抗性细胞”指如实施例1中所测试的，在细胞存活力的降低中具有大 于1 μ g/ml的IC25值的细胞。表2_4、6和7中的一些基因在⑶40配体下调途径中(例如 VNN2、MEF2C、LTB、KCNN3、NCFl、BCL6、IGJ、ELTI1902、PNOC、CSF2RB、和 P0U2AF1)；而这些表中的一些基因在B细胞受体信号传导途径中(例如⑶22、RGS13、和MEF2B)。另外，IFITM1、 CD40、RGS13、VNN2、LM02、CD79B、CD22、BTG2、IGF1R、CD44、CTSC、EPDRl、UAPl、和 PUS7 (表 13)的表达水平的关联得到了实施例2中所描述的临床试验的证实。在本发明的方法中使 用这些基因中一种或多种的表达水平。在一些实施方案中，在本发明的方法中使用至少两 种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种、至 少i^一种、至少十二种、至少十三种、至少十四种、至少十五种、至少二十种、至少二十五种 或至少三十种基因的表达水平。在一些实施方案中，测量和/或使用选自下组的一种或多种基因的表达水平 VNN2、MEF2C、LTB、KCNN3、NCF1、BCL6、IGJ、ELTI1902、PNOC、CSF2RB、P0U2AF1、CD22、RGS13、 和MEF2B。在一些实施方案中，测量和/或使用选自下组的一种或多种基因的表达水平 IFITMl、CD40、RGS13、VNN2、LM02、CD79B、CD22、BTG2、IGF1R、CD44、CTSC、EPDRl、UAPl、和 PUS7。在一些实施方案中，测量和/或使用这些基因中至少两种、至少三种、至少四种、至少 五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种、至少i^一种、至少十二种、至少 十三种、或十四种基因的表达水平。在一些实施方案中，测量和/或使用⑶22、⑶40、和BCL6 的表达水平。在一些实施方案中，测量和/或使用CD40、RGS13、CD22、BTG2、IGF1RJPCD44 的表达水平。在一些实施方案中，测量和/或使用IFITM1、⑶40、RGS13、VNN2、LM02、⑶79B、 CD22、BTG2、IGF1R、CD44、CTSC、EPDR1、UAP1、和PUS7的表达水平。在一些实施方案中，测量 和/或使用表7或表13中至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、 至少七种、至少八种、至少九种、至少十种、至少i^一种、至少十二种、至少十三种、至少十四 种、或十五种基因的表达水平。表2_4、6、7和13中所见到的基因(包括序列)是本领域已知的。例如，人类基 因的基因库登录号的例子有 VNN2 (NM_004665 ；NM_078488 ；AJ132100 ；D89974 ；BC064641 ； CR609799；BC126145 ；BC126147 ；和 AB026705) ;RGS13(NM_002927 ；NM_144766 ；BT006929 ； BC056866 ；AY562947 ；CR536532 ；CR610389 ；CR599001 ；BC016667 ；AF493935 ；BC036950 ； 禾口 AF030107) ；CD22(ΝΜ_001771 ；AK026467 ；BC109306 ；BC109307 ；AK225694 ；AK225625 ； X52785 ；和 X59350) ；LRRC8A(AY143166 ；BC051322；AK123611 ；AY358286 ；NM_019594 ； XM_026998 ；AK001199 ；AB037858 ；CR619692 ；CR619448 ；AK024649 ；BC000775 ；AK027495 ； 和 AK074723) ；CD40(NM_001250 ；NM_152854；BC064518 ；AY225405 ；CR619622 ；CR608994 ； CR605787 ；AB209660 ；AK222896 ；AJ300189 ；BT019901 ；和 BC012419) ； IFITMl (NM_003641 ； BC000897 ；BT007173 ；BT009859 ；CR456894 ；CR541874 ；CR604902 ；X57351 ；X84958 ； NM_006435 ；BC009696 ；X02490 ；禾口 J04164) ；SMNl(NM_000344 ；BC062723 ；CR611445 ； CR593735；BC000908 ；NM_022874 ；BC015308 ；和 U18423) ；PRKCA(NM_002737 ；AB209475 ； BC109274 ；BC109273 ；AF035594 ；BC053321 ；BX648954 ；AK125425 ；BC062759 ；BC071767 ； BC103691 ；BC101403 ；BC107592 ；AY633609 ；BC122530 ；BC015855 ；AF086287 ；AF035595 ； M22199 ；禾口 X52479) ；EPDRl(DQ914439 ；AY027862 ；NM_017549 ；AJ250475 ；AF202051 ； CR624676 ；CR596656 ；NM_016616 ；BC000686 ；BC018299 ；AF305596 ；禾P BC036816)； PRPSAP2(NM_002767 ；AB007851 ；BX648850 ；AK126398 ；CR457082 ；BC101672 ；BC101670 ； 和 BC106050) ； IGF1R(NM_000875 ；NM_015883 ；AY429545 ；CR624013 ；BC078157 ；BC088377 ； BC107089 ；BC111046 ；BC113610 ；BC113612 ；BC010607 ；X04434 M24599 ；禾口 U09023)；
18BTG2 (NM_006763 ；CR606002 ；CR604962 ；CR595352 ；CR591042 ；BC105948 ；BC105949 ； U72649 ；禾P Y09943) ；LM02(BC042426 ；NM_005574 ；BC073973 ；AK127915 ；CR625714 ； CR614368 ；CR604507 ；AF257211 ；BC034041 ；BC035607 ；禾口 X61118) ；YIPF3(AL050274 ； AK000946 ；CR533541 ；CR623137 ；CR622890 ；CR622532 ；CR621993 ；CR619816 ；CR619437 ； CR619054 ；CR618212 ；CR616987 ；CR616384 ；CR615623 ；CR615153 ；CR615118 ；CR612415 ； CR611748 ；CR611260 ；CR610983 ；CR610470 ；CR607768 ；CR606024 ；CR603408 ；CR603202 ； CR602267；CR601987；CR599615；CR598162；CR597677；CR596581 ；CR596249 ；CR595236 ； CR592266 ；CR590752 ；CR590349 ；NM_015388 ；AK021433 ；AK021655 ；AK022757 ；BC019297 ； 和 AF162672)；和 BCL6 (ΝΜ_001706 ；NM_138931 ；BX649185 ；UOOl 15 ；BC142705 ；BC146796 ； BC150184 ；AL713713 ；AK090890 ；AL832990 ；和 Z21943)。图6(6-1至6-35)中显示了表2_4、6、7和13中所提到的一些基因的核酸序列。参照水平将B细胞淋巴瘤中一种或多种标志物基因的测量表达水平与参照水平比较。在 一些实施方案中，所述参照水平是其表达水平在不同类型的B细胞淋巴瘤间(例如在对抗 CD40抗体敏感的B细胞淋巴瘤与对抗CD40抗体有抗性的B细胞淋巴瘤之间)不变化(不 显著变化)的基因的表达水平。在一些实施方案中，使用表8中所显示的一种或多种持家 基因的表达水平作为参照水平。在一些实施方案中，使用表9中所显示的一种或多种持家 基因的表达水平作为参照水平。在一些实施方案中，使用参照水平将标志物基因的测量表达水平标准化。在一些 实施方案中，分别在原比例尺或对数比例尺上，作为标志物基因与参照表达水平之间的比 或差异来计算标志物基因的标准化表达水平。选择表8和表9中的参照基因作为表4中标志物基因的特定标准化对应物。参照 基因选择在B细胞淋巴瘤样品中具有高均值表达和低方差。另外，参照基因选择相对于生 物学不同细胞系的表达测量间的方差，在各细胞系的复制表达测量间具有相似的方差。另 外，参照基因选择与表4中的一种或多种标志物具有低统计关联。在一些实施方案中，参照水平是不同B细胞淋巴瘤样品中标志物基因的测量表达 水平。在一些实施方案中，所述不同B细胞淋巴瘤样品包含对抗CD40抗体诱导的细胞死亡 有抗性的B淋巴瘤细胞。在一些实施方案中，参照水平是基于如下样品中相应标志物基因的表达水平而确 定的，所述样品来自在抗CD40抗体治疗后肿瘤体积增大和/或在抗CD40抗体治疗后肿瘤 体积缩小的受试者且包含B淋巴瘤细胞。在一些实施方案中，所述来自用于确定参照水平 的受试者的样品与所述来自要预测或评估对抗CD40抗体治疗的响应性的受试者的样品包 含相同类型的B淋巴瘤细胞。在一些实施方案中，使用相同的方法(例如qRT-PCR)和/或 试剂(例如引物和探针)来测量样品中标志物基因的表达水平和测量参照样品中相应标志 物基因的表达水平。
19 测量表达水平本文中所公开的方法提供了相对于参照水平，检查淋巴瘤样品(例如B细胞淋巴 瘤样品)中这些标志物基因中一种或多种的表达水平的方法。所述方法和测定法包括那些 检查标志物基因(诸如表2-4、6、7和13任一所列那些中的一种或多种)的表达的。可以 在mRNA水平和/或蛋白质水平测量表达水平。本发明提供了用于测量来自哺乳动物组织或细胞样品(诸如与B细胞淋巴瘤有关 的细胞和/或组织)的表达水平的方法。例如，为了获得患者样品，进行H&E染色并用作组织宏观解剖(macrodissection)的指导来富集肿瘤含量。可以通过本领域已知的多种规程 来获得样品，包括但不限于手术切除、抽吸或活检。样品可以是新鲜的或冷冻的。在一些实 施方案中，样品是固定和包埋在石蜡或类似物中的。在所述方法中，获取哺乳动物组织或细 胞样品，并检验一种或多种生物标志物的表达。所述方法可以以多种测定法格式进行，包括 检测mRNA表达的测定法、检测酶活性存在的酶测定法、和免疫组织化学测定法。在所述组 织或细胞中测出此类生物标志物的表达则预示该组织或细胞将会对抗CD40抗体治疗敏感 /有响应。如下所述，可以通过许多方法学来分析样品中多种生物标志物的表达，这些方法 许多是本领域已知的且本领域技术人员理解的，包括但不限于微阵列(基因和/或组织阵 列分析)、原位杂交、Northern分析、PCR分析(mRNA)、免疫组织化学和/或Western分析、 基于血液的定量测定法(例如血清ELISA)(用以检验例如蛋白质表达水平)、和/或生化 酶活性测定法。用于评估基因和基因产物状态的典型方案可见于例如Ausubel等编，1995， ((CurrentProtocols In Molecular Biology〉〉，单元 2 (Northern E口迹)、4 (Southern E口迹)、 15 (免疫印迹)和18 (PCR分析)。下文出于例示目的提供了关于检测样品中特定生物标志 物(诸如表2-4、6、7和13所列的那些)的方案。在一些实施方案中，本发明的方法进一步包括检验组织或细胞样品中mRNA (诸如 表2-4、6、7和13任一所列基因的mRNA)的存在和/或表达的方案。在一些实施方案中， 可通过检验或检测组织或细胞样品中mRNA(诸如表2-4、6、7和13任一中的mRNA)的微阵 列技术来分析样品中各种生物标志物的表达。使用核酸微阵列，将来自测试和对照组织样 品的测试和对照mRNA样品逆转录和标记以生成cDNA探针。然后将所述探针杂交至在固 体支持物上固定化的核酸阵列。所述该阵列配置成阵列的每个成员的序列和位置是已知 的。例如，可以将有可能在某些疾病状态中表达的基因选集在固体支持物上形成阵列。经 标记探针与特定阵列成员的杂交指示衍生该探针的样品表达该基因。疾病组织的差异基 因表达分析可提供有价值的信息。微阵列技术利用核酸杂交技术和计算技术在单一实验 中评估数以千计基因的mRNA表达序型(expression profile)(参见例如2001年10月 11日公布的W001/75166 ；还可参见例如美国专利5，700，637 ；5，445，934 ；和5,807, 522 ； Lockart, Nature Biotechnology,14 1675-1680(1996) ；Cheung, V.G.et al. , Nature Genetics21 (Suppl) :15_19 (1999)，关于阵列制作的讨论)。DNA微阵列是包含基因片段的 微型阵列，所述基因片段或是在玻璃或其它基质上直接合成或是点到玻璃或其它基质上。 单一阵列中通常呈现数以千计的基因。一个典型的微阵列实验牵涉以下步骤1)自分离自 样品的RNA制备荧光标记的靶物；2)将经标记的靶物杂交至微阵列；3)清洗，染色，和扫描 阵列；4)分析扫描图像；并5)生成基因表达序型。当前使用两种主要类型的DNA微阵列 包含自cDNA制备的PCR产物的基因表达阵列和寡核苷酸(通常25-70聚物)阵列。在形 成阵列时，寡核苷酸可以是预制并点到表面上的，或者是直接在表面上合成的(原位)。Affymetrix GeneChip 系统是包含通过在玻璃表面上直接合成寡核苷酸而制作 的阵列的商品化微阵列系统。探针/基因阵列寡核苷酸(通常25聚物)通过组合基于 半导体的光刻和固相化学合成技术直接合成到玻璃晶片上。每个阵列包含多至400，000种 不同寡聚物，每种寡聚物以数以百万计拷贝存在。因为寡核苷酸探针是在阵列上已知位置 合成的，所以杂交样式和信号强度可以通过Affymetrix Microarray Suite软件解读成基因身份和相对表达水平。每种基因通过一系列不同寡核苷酸探针呈现在阵列上。每个探针 对由完全匹配寡核苷酸和错配寡核苷酸组成。完全匹配探针具有与特定基因精确互补的序 列，因而测量该基因的表达。错配探针因中央碱基位置的单一碱基替代而不同于完全匹配 探针，从而扰乱了靶基因转录物的结合。这有助于测定有助于对完全匹配寡聚物测得的信 号的背景和非特异性杂交。Microarray Suite软件将错配探针的杂交强度从完全匹配探 针的杂交强度中扣除，以确定每个探针集的绝对或特异强度。探针的选择基于GenBank和 其它核苷酸库的当前信息。认为其序列识别基因3’末端的独特区域。使用基因芯片杂交 炉(“电转烤炉”)来进行多至64个阵列的同时杂交。射流站实施探针阵列的清洗和染色。 它是完全自动化的，包括四个模块，每个模块持有一个探针阵列。每个模块经由Microarray Suite软件使用预编程射流方案独立控制。扫描仪是共焦激光荧光扫描仪，其测量由结合至 探针阵列的经标记cRNA发射的荧光强度。安装有Microarray Suite软件的计算机工作站 控制射流站和扫描仪。Microarray Suite软件可以控制多至八个射流站，使用探针阵列的 预编程的杂交、清洗、和染色方案。该软件还获取杂交强度数据并使用适宜的算法将其转变 成每种基因的有/无呼叫(presence/absence call)。最后，该软件通过比较分析来检测各 实验间基因表达的变化，并将输出格式化为.txt文件，其可以与其它软件程序一起用于进 一步的数据分析。在一些实施方案中，样品中各种生物标志物的表达还可以通过检验基因删除或基 因扩增来评估。基因删除或扩增可以通过本领域已知的任一种或多种方案来测量，例如常 规 Southern 印迹、Northern 印迹(用以量化 mRNA 转录)(Thomas，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77 :5201-5205(1980))、点印迹(DNA分析)、或原位杂交(例如FISH)，其中使用适当标 记的探针、细胞发生法(cytogenetic method)或比较性基因组杂交(CGH)，其中使用适当 标记的探针。例如，这些方法可用于检测表2-4、6、7和13任一所列基因的删除或扩增。在一些实施方案中，可以通过使用互补DNA探针的杂交测定法(诸如使用经标记 核酸探针的原位杂交、Northern印迹和相关技术)和各种核酸扩增测定法(诸如使用互补 引物(诸如对表2-4、6、7和13任一所列一种或多种基因特异性的引物)的RT-PCR，及其它 扩增型检测方法，诸如例如分支DNA、SISBA、TMA等等)。来评估样品中各种生物标志物的 表达。例如可以使用Northern、点印迹或PCR分析对来自哺乳动物的组织或细胞样品 方便地测定表2-4、6、7和13任一所列基因的mRNA。在一些实施方案中，可以通过RT-PCR 来测定一种或多种生物标志物的表达。在一些实施方案中，所述RT-PCR可以是定量 RT-PCR(qRT-PCR)。在一些实施方案中，所述RT-PCR是实时RT-PCR。在一些实施方案中， 所述RT-PCR是定量实时RT-PCR。RT-PCR测定法诸如定量PCR测定法是本领域公知的。在 本发明的一个例示性实施方案中，用于检测生物学样品中的mRNA的方法包括使用至少一 种引物通过逆转录自样品生成cDNA ；使用多核苷酸作为有义和反义引物扩增如此生成的 cDNA以扩增其中的cDNA ；并检测所扩增感兴趣cDNA的存在。在一些实施方案中，所述实时 RT-PCR可以是定量RT-PCR。在一些实施方案中，所述实时RT-PCR可以使用TaqMan 化学 (Applied Biosystems)来实施。在一些实施方案中，所述实时RT-PCR可以使用TaqMan 化学(AppliedBiosystems)和ABI Prism 700序列检测系统(Applied Biosystems)来实 施。实时RT-PCR组合了下述原理，Taq聚合酶具有5' -3'外切核酸酶活性，及双重标记的荧光寡核苷酸产生了只在切割时发射荧光信号的问题(基于荧光共振能量转移的原理)。 参见例如 Overbergh，L. et al.，J Biomolecular Techniques 14(1) :33_43 (2003)。另夕卜， 此类方法可以包括一个或多个如下步骤，其容许测定生物学样品中mRNA(诸如表2-4、6、7 和13任一所列基因的mRNA)的水平(例如通过同时检验“持家”基因诸如肌动蛋白家族成 员和/或表8或表9中所列举的一种或多种基因的比较性对照mRNA序列的水平)。表10 中提供了可用于进行qRT-PCR的引物和探针的例子。在一些实施方案中，使用免疫组织化学和染色方案来检验样品中由表2_4、6、7和 13任一所列基因编码的蛋白质的表达。组织切片的免疫组织化学染色已经显示为评估或检 测样品中蛋白质存在的可靠方法。免疫组织化学(“IHC”)技术利用抗体来原位探查和显 现细胞抗原，一般通过显色或荧光方法。对于样品制备，可以使用来自哺乳动物(典型的是人类患者)的组织或细胞样品。 样品的例子包括但不限于组织活检、血液、肺吸出物、痰或唾液、淋巴液等。可以通过本领域 已知的多种规程来获得样品，包括但不限于手术切除、抽吸或活检。组织可以是新鲜的或冷 冻的。在一些实施方案中，样品是固定和包埋在石蜡或类似物中的。可以通过常规方法来固定(即保存)组织样品(参见例如“Manual ofHistological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology,，，第3 片反(1960)Lee G. Luna, HT(ASCP) H，The Blakston Division McGraw-HillBook Company, New York ；The Armed Forces Institute of Pathology AdvancedLaboratory Methods in Histology and Pathology(1994)Ulreka V. Mikel 编，Armed Forces Institute of Pathology, American Registry of Pathology，Washington，D· C·)。本领域技术人员>|#领 会，固定剂的选择由样品是用于组织学染色还是其它分析的目的来决定。本领域技术人员 还将领会，固定时长取决于组织样品的大小和所使用的固定剂。例如，可以使用中性缓冲的 福尔马林、Bouin氏液或低聚甲醛来固定样品。一般而言，将样品首先固定，然后通过酒精递增系列脱水，用石蜡或其它切片介 质渗透和包埋使得该组织样品可以切片。或者，可以将组织进行切片并将所得切片固 定。例如，可以通过常规方法学将组织样品在石蜡中包埋和加工(参见例如“Manual of Histological Staining Method of the Armed ForcesInstitute of Pathology“,见 上文)。可以使用的石蜡的例子包括但不限于Paraplast、Broloid、和Tissuemay。一旦 将组织样品包埋，就可以用切片机等等将样品切片(参见例如“Manual of Histological Staining Method of the ArmedForces Institute of Pathology”，)。)(寸夫JS 程，例如，切片的厚度范围可以是约3微米至约5微米。一旦切片，就可以通过数种标准方 法将切片附着至载玻片。载玻片粘合剂的例子包括但不限于硅烷、明胶、聚L-赖氨酸等等。 例如，可以将石蜡包埋的切片附着于带正电荷的载玻片和/或聚L-赖氨酸包被的载玻片。若使用石蜡作为包埋材料，则一般将组织切片脱石蜡和复水。可以通过数种常 规标准方法学将组织切片脱石蜡。例如，可以使用二甲苯和酒精逐渐递减系列(参见例 如 “Manual of Histological Staining Method of the ArmedForces Institute of Pathology”，见上文)。或者，可以使用商品化的脱石蜡用非有机试剂，诸如Hem0-De7 (CMS， Houston, Texas) 0在一些实施方案中，在样品制备后，可以使用IHC来分析组织切片。IHC可以联合
32别的技术进行，诸如形态学染色和/或荧光原位杂交。可利用IHC的两种常用方法，即直接 和间接测定法。依照第一种测定法，直接测定抗体对靶抗原(例如由表1_4、6和7中所列举 的一种或多种基因编码的蛋白质或其片段)的结合。此直接测定法使用经过标记的试剂， 诸如荧光标签或酶标记的一抗，其可以在没有进一步抗体相互作用的情况下显现。在一种 典型的间接测定法中，未偶联的一抗结合至抗原，然后经过标记的二抗结合至一抗。若二抗 偶联有酶标记物，则添加显色或荧光底物以提供抗原显现。因为数个二抗可以与一抗上的 不同表位起反应，所以发生了信号放大。用于免疫组织化学的一抗和/或二抗通常用可检测模块标记。可利用许多标记 物，一般可分成以下几类(a)放射性同位素，诸如 35S、14C、125I、3H和 1311。例如，可使用 CurrentProtocols in Immunology,卷 1 禾口 2, Coligen 等编，Wiley-Interscience, New York, New York, Pubs. 1991 中记载的技术用放射性同位素标记抗体，并可使用闪烁计数来测量放射性。(b)胶体金颗粒。(c)荧光标记物，包括但不限于稀士螯合物(铕螯合物)、德州红、若丹明、荧光 素、丹酰、丽丝胺、伞形酮、藻红蛋白、藻蓝蛋白、或商品化荧光团诸如SPECTRUM 0RANGE7和 SPECTRUM GREEN7和/或上述任一种或多种的衍生物。例如，可使用Current Protocols in Immunology，见上文中披露的技术使荧光标记物与抗体偶联。可使用荧光计对荧光进行定量。(d)可利用各种酶_底物标记物且美国专利第4，275，149号中提供了有关它们中 的一些的综述。酶一般催化可使用多种技术测量的显色底物的化学改变。例如，酶可以催 化可通过分光光度法测量的底物颜色改变。或者，酶可以改变底物的荧光或化学发光。上 文描述了用于对荧光改变进行定量的技术。化学发光底物通过化学反应变成电子激发态， 然后可发射可测量(例如使用化学发光计)或给荧光受体提供能量的光。酶标记物的例子 包括萤光素酶(例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶；美国专利No. 4，737，456)、萤光素、 2,3- 二氢酞嗪二酮类、苹果酸脱氢酶、尿素酶、过氧化物酶诸如辣根过氧化物酶(HRPO)、碱 性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧 化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物 酶、微过氧化物酶等。用于使酶与抗体偶联的技术描述于0' Sullivan等，Methods for the Preparation ofEnzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, 于:Methods inEnzym. , J. Langone 禾口 H. Van Vunakis 编，Academic Press, New York,73 147-166(1981)。酶-底物组合的例子包括例如(i)辣根过氧化物酶(HRPO)与作为底物的过氧化氢，其中过氧化氢氧化染料前体 (例如邻苯二胺(OPD)或3，3' ,5,5' _四甲基联苯胺盐酸盐(TMB))；(ii)碱性磷酸酶(AP)与作为显色底物的对硝基苯基磷酸酯；和(iii) β -D-半乳糖苷酶(β -D-Gal)与显色底物(例如对硝基苯基_β _D_半乳糖 苷)或荧光底物(例如4-甲基伞形基-β -D-半乳糖苷)。本领域技术人员可利用许多其它酶-底物组合。有关它们的一般性综述参见美国 专利No. 4，275，149和4，318，980。有时，将标记物与抗体间接偶联。熟练技术人员了解实现这一目的的多种技术。例如，可将抗体与生物素偶联，而且可以将上述四大类标记物中的 任一种与亲合素偶联，或反之亦然。生物素选择性结合亲合素，由此标记物可与抗体以这种 间接方式偶联。或者，为了实现标记物与抗体的间接偶联，将抗体与小型半抗原偶联，并将 上述不同类型的标记物之一与抗半抗原抗体偶联。由此，可实现标记物与抗体的间接偶联。在上文讨论的样品制备规程外，可能还需要在IHC之前、期间或之后对组织切片 进行进一步的处理。例如，可以实施表位修复法，诸如在柠檬酸盐缓冲液中对组织样品进行 加热(参见例如 Leong 等，Appl. Immunohistochem. 4 (3) 201 (1996))。在任选的封闭步骤后，将组织切片在合适条件下暴露于第一抗体足够时间，使得 第一抗体结合至组织样品中的靶蛋白抗原。实现这一目的的适宜条件可以通过常规实验 来确定。抗体与样品的结合程度通过使用上文讨论的任一种可检测标记物来测定。优选 的是，标记物是酶标记物(例如HRP0)，其催化显色底物诸如3，3' - 二氨基联苯胺色原体 (chromogen)的化学变化。优选的是，将酶标记物偶联至特异性结合第一抗体的抗体(例如 第一抗体是家兔多克隆抗体，第二抗体是山羊抗家兔抗体)。在一些实施方案中，IHC分析中用于检测一种或多种生物标志物表达的抗体是用 以主要结合一种或多种感兴趣生物标志物(诸如一种或多种由表2-4、6和7任一中所列举 的基因编码的蛋白质)而生成的抗体。在一些实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。抗体 在本领域易于获得，包括各种商业来源，而且也可以使用本领域已知的常规技术生成。可以将如此制备的标本放置好并盖上盖玻片。然后进行载玻片评估，例如利用显 微镜，并且可以采用本领域常规使用的染色强度标准。例如，染色强度标准可以如下评估表 A 在备选方法中，可以在足以使抗体_生物标志物复合物形成的条件下使样品接触 对所述生物标志物特异性的抗体，然后检测所述复合物。可以以多种方式来检测生物标志 物的存在，诸如通过Western印迹和ELISA规程，其用于测定极其广泛的组织和样品，包括 血浆或血清。可利用多种使用此类测定法的免疫测定技术，参见例如美国专利第4，016，043 号；第4，424，279号和第4，018，653号。这些包括非竞争性类型的单位点和双位点或“三 明治/夹心式”测定法，以及传统的竞争性结合测定法。这些测定法也包括经标记抗体对靶 生物标志物的直接结合。三明治测定法是最有用且常用的测定法之一。三明治测定技术有许多变化形式， 本发明意图涵盖所有这些变化形式。简言之，在一种典型的正向测定法(forward assay)
34中，将未标记的抗体固定化在固体基片上，使待测试的样品接触所结合的分子。温育足以容 许抗体-抗原复合物形成的合适长度的一段时间后，添加对抗原特异性的、用能够生成可 检测信号的报道分子标记的第二抗体并温育足以使另一复合物即抗体-抗原-经标记抗体 形成的一段时间。洗去任何未反应的物质，并通过由报道分子生成的信号的观察结果来测 定抗原的存在。结果可以是定性的，即通过可见信号的简单观察，或者可以量化，即通过与 包含已知量的生物标志物的对照样品比较。正向测定法的变化形式包括同时测定法，其中将样品和经标记抗体二者同时添加 至所结合的抗体。这些技术是本领域技术人员所熟知的，包括任何显而易见的微小变化。 在一种典型的正向三明治测定法中，将具有针对生物标志物的特异性的第一抗体或是共价 的或是被动的结合至固体表面。所述固体表面典型地是玻璃或聚合物，最常用的聚合物是 纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙稀或聚丙烯。所述固体支持物可以是管、珠、微 孔板的盘、或适于实施免疫测定法的任何其它表面的形式。结合过程是本领域众所周知的， 一般由交联、共价结合或物理吸附组成，清洗聚合物_抗体复合物，为测试样品做好准备。 将待测样品的等分试样添加至固相复合物，并在合适条件(例如室温至40°C，诸如25°C和 32°C之间，含两端值)下温育足够时间(例如2-40分钟或过夜，如果更方便的话)以容许 抗体中存在的任何亚基结合。温育期后，将抗体亚基固相清洗并干燥并与对生物标志物的 一部分特异性的第二抗体一起温育。所述第二抗体连接有用于指示第二抗体对分子标志物 结合的报道分子。在一些实施方案中，所述方法牵涉将样品中的靶生物标志物固定化，然后将固定 化的靶物暴露于未标记的或用报道分子标记的特异性抗体。根据靶物的量和报道分子信号 的强度，所结合的靶物可以是通过用抗体直接标记而可检测的。或者，将经标记的、对第一 抗体特异性的第二抗体暴露于靶物_第一抗体复合物以形成靶物_第一抗体_第二抗体三 元复合物。该复合物通过报道分子发射的信号来检测。“报道分子”在用于本说明书时指通 过其化学本质提供分析上可鉴定的信号从而容许检测抗原所结合抗体的分子。这类测定法 中最常用的报道分子是酶、荧光团或含放射性核素的分子(即放射性同位素)和化学发光 分子。在酶免疫测定法的情况中，有酶偶联至第二抗体，一般通过戊二醛或高碘酸盐或 酯的手段。然而，正如易于领会的，有极其多种不同偶联技术可供技术人员使用。常用的酶 包括辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、半乳糖苷酶和碱性磷酸酶等等。与特定酶一起使用的 底物一般根据在被相应的酶水解后生成可检测的颜色变化来选择。合适的酶的例子包括碱 性磷酸酶和过氧化物酶。也有可能采用荧光底物，其生成荧光产物而非上文所述显色底物。 在所有情况中，将酶标记的抗体添加至第一抗体_分子标志物复合物，容许结合，然后洗去 过量的试剂。然后将含有适宜底物的溶液添加至抗体-抗原-抗体复合物。底物与第二抗 体所连接的酶起反应，给出定性可视信号，其可以进一步量化，通常通过分光光度法，以给 出样品中存在的生物标志物量的指示。或者，可以将荧光化合物(诸如荧光素和罗丹明)化 学偶联至抗体而不改变其结合能力。在被特定波长的光照射而激活后，荧光团标记的抗体 吸收光能，在分子中诱导激发状态，接着以光学显微镜在视觉上可检测的特征性颜色发光。 在EIA中，容许荧光标记的抗体结合至第一抗体_分子标志物复合物。洗去未结合的试剂 后，将剩余的三元复合物然后暴露于适宜波长的光，所观察到的荧光指示存在感兴趣的分子标志物。免疫荧光和EIA技术都是本领域已完善建立的。然而，也可以采用其它报道分 子，诸如放射性同位素、化学发光或生物发光分子。在一些实施方案中，组织或细胞样品中选定的生物标志物的表达还可以通过基于 功能或活性的测定法来检验。例如，若生物标志物是酶，则可以实施本领域已知测定法来测 定或检测组织或细胞样品中给定酶活性的存在。在评估一种或多种生物标志物的表达水平的任何上述方法中，包含靶分子的样品 可通过本领域公知的方法获得，而且它们适于特定类型和位置的感兴趣疾病。组织活检通 常用于获得有代表性的疾病组织片。或者，可以已知或认为包含感兴趣疾病细胞的组织/ 流体的形式间接获取细胞。例如，疾病损伤的样品可通过切除术、支气管镜检、细针抽吸、支 气管刷检、或从痰/唾液、胸膜液或血液中获得。可从疾病组织或从其它身体样品诸如尿、 痰或血清中检测出基因或基因产物。上述用于检测疾病样品中靶基因或基因产物的同样技 术可用于其它身体样品。通过筛选这些身体样品，可实现对于这些疾病的简单早期诊断。另 外，通过对这些身体样品测试靶基因或基因产物，可更容易地监测治疗的进程。对组织制备物富集疾病细胞的手段是本领域已知的。例如，可以从石蜡或低温保 存的切片中分离组织。感兴趣细胞也可通过流式细胞术或激光捕捉显微解剖而与正常细胞 分开。这些以及其它从正常细胞中分离疾病细胞的技术是本领域公知的。如果疾病组织被 正常细胞高度污染，那么检测签名基因表达序型可能更为困难，然而最小化污染和/或假 阳/阴性结果的技术是已知的，其中一些在下文有描述。例如，也可以对样品评估生物标志 物(包括突变)的存在情况，所述标志物已知与感兴趣的疾病细胞有关而与相应的正常细 胞无关，反之亦然。在确定组织或细胞样品表达一种或多种指示该组织或细胞样品会对抗⑶40抗体 治疗敏感的生物标志物之后，可以对哺乳动物(诸如人)施用有效量的抗CD40抗体以治疗 侵扰该哺乳动物的病症(诸如B细胞淋巴瘤)。哺乳动物(诸如人)中本文所述各种病理 疾患的诊断可以由熟练从业人员做出。比较表达水平和预测、评估或帮助评估B细胞淋巴瘤对抗CD40抗体治疗的响应性本文所述方法包含比较标志物基因的测量表达水平与参照水平的过程。所述参照 水平可以是与标志物基因不同的参照基因的测量表达水平或不同样品中同一标志物基因 的测量表达水平。在一些实施方案中，将来自受试者的B细胞淋巴瘤样品中标志物基因的测量表达 水平与该样品中参照基因的测量表达水平比较。在一些实施方案中，参照基因的表达水平 在各种类型的B淋巴瘤细胞(包括抗CD40抗体敏感性和抗性细胞)间基本上不变化，例如 表8或表9中的基因。在一些实施方案中，计算标志物基因的测量表达水平对参照的测量表 达水平的比，而且该比值可用于评估或帮助评估B细胞淋巴瘤对抗CD抗体治疗的响应性。在一些实施方案中，将来自受试者的B细胞淋巴瘤样品中标志物基因的测量表达 水平与参照样品中标志物基因的测量表达水平比较。在一些实施方案中，参照样品包含对 抗CD40抗体有抗性或不响应的B淋巴瘤细胞。例如，实施比较来确定来自受试者的样品中 与参照样品中标志物基因的测量表达水平的差异程度(例如比较来自受试者的样品与参 照样品中标志物基因的表达水平间的倍数或百分比差异)。与包含对抗CD40抗体有抗性或 不响应的B淋巴瘤细胞的参照样品中标志物基因的表达相比，来自受试者的样品中标志物基因的表达升高或降低提示或指示B细胞淋巴瘤对抗CD40抗体治疗的响应性。与抗性细 胞相比在抗CD40抗体敏感性细胞中的表达升高和降低的标志物基因参见表4。例如，与抗 性细胞相比，抗CD40抗体敏感性细胞中一般过表达VNN2、MEF2C、LTB、KCNN3、NCFU BCL6、 IGJ、ELTI1902、PN0C、CSF2RB、P0U2AF1、CD22、RGS13、和 MEF2B。在一些实施方案中，来自受 试者的样品的表达水平的升高倍数可以是参照样品的表达水平的至少约1. 5倍、1. 75倍、2 倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、或10倍。在一些实施方案中，来自受试者的样品的 表达水平的降低倍数可以是参照样品的表达水平的不到约0. 01,0. 05,0. 1,0. 2,0. 3,0. 4、 0. 5、0· 6、0· 7 或 0. 8。在一些实施方案中，将选自下组的一种或多种标志物基因的表达水平与参照水平 比较IFITM1、CD40、RGS13、VNN2、LM02、CD79B、CD22、BTG2、IGF1R、CD44、CTSC、EPDR1、UAP1、 禾口 PUS7。在一些实施方案中，与参照水平相比IFITMl、CD79B、IGF1R、CD44、CTSC、EPDRl、 和PUS7中一种或多种的表达水平升高指示所述受试者不太可能响应激动性抗CD40抗体治 疗。在一些实施方案中，参照水平是通过如下样品中相应标志物基因的表达水平而确定的 值或范围，所述样品包含来自在激动性抗CD40抗体治疗后肿瘤体积增大的受试者的B淋巴 瘤细胞。在一些实施方案中，与参照水平相比CD40、RGS13、VNN2、LM02、CD22、BTG2、和UAP1 中一种或多种的表达升高指示所述受试者有可能响应激动性抗CD40抗体治疗。在一些实 施方案中，参照水平是通过如下样品中相应标志物基因的表达水平而确定的值或范围，所 述样品包含来自在激动性抗CD40抗体治疗后肿瘤体积缩小的受试者的B淋巴瘤细胞。在一些实施方案中，测量BCL6的表达水平并与参照水平比较。使用BCL6的表达水 平来预测、评估、或帮助评估受试者对抗CD40抗体治疗的响应性。如实施例2中所显示的， BCL6表达趋向于在那些肿瘤在激动性抗⑶40抗体治疗后增大的受试者中较低。在一些实 施方案中，与通过来自肿瘤体积在激动性抗CD40抗体治疗后缩小的受试者的样品中BCL6 的表达水平确定的参照水平相比BCL6表达升高可指示该受试者有可能响应激动性抗CD40 抗体治疗。在一些实施方案中，测量表7中的标志物基因的表达水平，并确定作为表7中基 因对1-8的log2刻度表达的带正负号的t值之和计算的敏感指数，其中敏感指数大于_4 提示或指示B细胞淋巴瘤响应抗CD40抗体治疗。在一些实施方案中，敏感指数大于_3、大 于-2、大于-1、或大于0。在一些实施方案中，敏感指数介于_4和20之间。在一些实施方 案中，敏感指数介于0和20之间。在一些实施方案中，测量IFITM1、CD40、RGS13、VNN2、LM02、CD79B、CD22、BTG2、 IGF1R、CD44、CTSC、EPDRl、UAPl、和PUS7中一种或多种的表达水平，并基于标志物基因的测 量表达水平计算敏感指数。例如，可以使用下述方程来确定敏感指数(Si) 其中测量表13所示至少一种具有正关联值的标志物基因的和至少一种具有负关 联值的标志物基因的表达水平；其中(i) β j是所测量的每一种标志物基因的系数值；( ) P是所测量的标志物基因的数目；(iii)Xi是对于来自要测量表达水平的受试者的样品所测
xJ-Mj量的每一种标志物的经过换算、标准化的表达水平；而(iv) μ j和ο」是所测量的每一种标 志物基因的均值和标准偏差；其中β” μ」和％.是自来自临床试验的包含Β淋巴瘤细胞 的患者样品确定的。在一些实施方案中，等于或大于零的敏感指数值指示受试者有可能响 应抗CD40抗体治疗，或其中小于零的敏感指数值指示受试者不太可能响应抗CD40抗体治 疗。实施例2详细记载了如何为参照样品和新样品分析和测定参数。在一些实施方案中， 测量 IFITMl、RGS13、CD79B、CD22、BTG2、CD44、EPDRl JPUAPl 的表达水平，并用于敏感指数 计算。在一些实施方案中，测量相等数目的正关联标志物基因和负关联标志物基因，并用于 敏感指数计算。用于确定敏感指数的方法是本领域已知的。参见Zhou H. and Hastie Τ. (2005) Regularization and variable selection via the elastic net ；J. R. Statist. Soc. B. 67 (2).pp. 301-320 ；Friedman J. , Hastie T.and Tibshirani R. 2008.Regularization Paths for Generalized Linear Models via Coordinate Descent. Technical Report, Department of Statistics, Stanford University(World ffideffeb-stat. Stanford, edu/ ~hastie/Papers/glmnet. pdf) R package glmnet ；RDevelopment Core Team(2008). R :A language and environment for statisticalcomputing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. ISBN3-900051-07-0, URL World Wide Web at R-project. org。可以以对所讨论基因标志物的测量值和参照值的类型适宜的任何便利方式进行 比较。比较过程可以是手工的，或者它可以是自动的。在一些实施方案中，测量表达水平是 标准化值。例如，可以基于实施例2中所描述的“经过换算、标准化的测定值”下的方程将 表达水平标准化。对本领域技术人员显而易见的是，可以为标志物基因和/或参照基因的 表达水平采取重复测量。在一些实施方案中，为测量值考虑重复测量。可以通过使用测量 值的均值或中值作为“测量值”来考虑重复测量。可以使用本领域已知的统计分析来证实 所比较的两个值间差异的显著性。抗CD40抗体治疗本发明中所鉴定的标志物基因可用于预测、评估、或帮助评估B细胞淋巴瘤对用 一种或多种抗CD40抗体进行的治疗的响应性。所述抗CD40抗体可以是一种或多种激动性 抗体(即结合并刺激CD40)。刺激性抗体可以是不同类型的，诸如(1)那些经由CD40递送 刺激性信号但不提高⑶40和⑶40L之间相互作用(例如抗体G28-5和自G28-5衍生的抗 体，记载于美国专利No. 5，182，368 ；和PCT WO 96/18413)或降低CD40和CD40L之间相互 作用(例如抗体HuCD40-M2和HuCD40-M3和人源化抗体，记载于美国专利No. 5，674，492) 的；和⑵那些经由⑶40递送刺激性信号且能提高⑶40和⑶40L之间相互作用的，例如 S2C6 (Francisco et al.，2000，Cancer Res. 60 :3225_31)和自 S2C6 衍生的抗体。激动性 抗体还记载于美国专利No. 7，288，251。所述抗⑶40抗体可以是一种或多种拮抗性抗体 (即结合CD40并抑制由CD40L诱导的活性)。拮抗性抗CD40抗体的例子包括美国公开文 本No. 2007/0110754中记载的人抗体CHIR-12. 12和WO 97/31025中记载的抗CD40抗体。本发明的方法可进一步包括给具有B细胞淋巴瘤的受试者施用有效量的抗CD40 抗体，这在基于本文所述测定法/方法将所述受试者鉴定为接受治疗的候选人之后进行。 可以施用一种或多种抗CD40抗体。在一些实施方案中，所述抗CD40抗体是与一种或多种下列治疗剂联合施用的rituXimab、gemzar、和ICE。例如，可以与下列各项联合地给患者 施用抗 CD40 抗体:rituximab 疗法；rituximal 加 gemzar ；rituximal 加 ICE (异环磷酰胺 (ifosfamide)、卡怕(carboplatin)、依托泊昔(etoposide)) (R—ICE)；或 rituximab 力口化疗。如本文中所使用的，“联合”施用包括同时施用和/或不同时间的施用。联合施用 还涵盖共配制剂(即同一组合物中存在不同药物)的施用或不同组合物的施用、不同剂量 给药频率或间隔的施用、和使用相同路径或不同路径的施用。抗CD40抗体或其功能性片段可用于治疗对使用以下任一药物的治疗没有 响应或响应不足或在用这些药物治疗后复发的NHL患者rituXimab (Genentech)； ocrelizumab(Genentech, Inc.) ；ibritumomab tiuxetan(Zevalin (TM), Biogen Idee)； tositumomab(Bexxar , GlaxoSmithKline) ；HuMAX_CD20 (GenMab) ；IMMU-106( 一种人 源化抗 CD20，也称作 hA20 或 90Y-hLL2，Immunomedics) ；AME-133 (Applied Molecular Evolution/Eli Lilly) ；gentuzumab ozogamicin(Mylotarg , 一禾中人源化抗 CD33 抗体， ffyeth/PDL) ；alemtuzumab (Campath , 一 禾中抗 CD52 抗体，Schering Plough/Genzyme)； epratuzumab (IMMU-103 , 一种人源化抗 CD22 抗体，Immunomedics)。下列参考文献记载了淋巴瘤和CLL、它们的诊断、治疗和用于测量治疗有效性的标 准医学规禾呈Canellos GP, Lister, ΤΑ, Sklar JL :The Lymphomas. W. B. Saunders Company, Philadelphia，1998 ；van Besien K and Cabanillas，F :Clinical Manifestations， Staging and Treatment of Non-Hodgkinr s Lymphoma，《Hematology，Basic Principles and Practice》第 3 版第 70 章第 1293-1338 页，Hoffman et al.(编)Churchill Livingstone, Philadelphia，2000 ； 及 Rai, K andPatel，D :Chronic Lymphocytic Leukemia，《Hematology，Basic Principles andPractice》第 3 片反第 72 章第 1350-1362 页， Hoffman et al.(编)ChurchillLivingstone，Philadelphia，2000。在治疗中使用的抗CD40抗体包括嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。可以在治 疗中使用本文中所描述的或本领域已知的任何激动性或拮抗性抗体。例如，可以使用WO 2006/128103中记载的人源化抗⑶40抗体来进行抗⑶40抗体治疗，而且通过述及将这些 抗体及其氨基酸序列收入本文。在一些实施方案中，供本文所述治疗中使用的抗CD40抗体 结合B淋巴瘤细胞上表达的⑶40 (诸如人⑶40)并诱导B淋巴瘤细胞凋亡。所述抗⑶40 抗体还可具有在体内经免疫效应器功能诸如ADCC、⑶C、和/或ADCP来杀死B淋巴瘤细胞 的特征。在一些实施方案中，所述抗⑶40抗体以不高于约1χ10_8或不高于1χ10_9的Kd值 结合⑶40。在一些实施方案中，所述抗⑶40抗体结合⑶40并刺激⑶40 (即激动性抗体)。 在一些实施方案中，所述抗⑶40抗体将⑶40配体对⑶40的结合提高例如至少45%、至少 50%、至少60%、或至少75%。测定⑶40配体对⑶40的结合增加的一种方法记载于美国 专利No. 6，838，261 (通过述及将其公开内容收入本文)。在一些实施方案中，所述抗⑶40 是自WO 00/75348中记载的鼠单克隆抗体S2C6衍生的人源化抗体(包括W000/75348表3 和4中提供的抗体)。在一些实施方案中，所述抗⑶40抗体包含SEQ ID NO :1所示重链氨 基酸序列和SEQ ID NO 2所示轻链氨基酸序列，例如抗⑶40 Ab. 1。D.试剂盒为了在上文所描述或提议的应用中使用，本发明还提供了试剂盒或制品。此类试
39剂盒可包含至少一种对于检测本文中所描述的标志物基因的表达水平特异性的试剂，而且 可进一步包括关于进行本文中所描述的方法的指令。在一些实施方案中，本发明提供了包含引物和引物对及探针的组合物和试剂盒， 所述引物和引物对容许特异性扩增本发明的多核苷酸或其任何特定部分，而所述探针选择 性或特异性杂交本发明的核酸分子或其任何部分。探针可以用可检测标记物标记，诸如例 如放射性同位素、荧光化合物、生物发光化合物、化学发光化合物、金属螯合剂或酶。此类探 针和引物可用于检测样品中多核苷酸(诸如与表1_4、6、7和13中所列举的基因对应的多 核苷酸)的存在，及用作检测表达如下蛋白质的细胞的手段，所述蛋白质由与表1_4、6、7和 13中所列举的基因对应的多核苷酸编码。正如本领域技术人员会理解的，可以基于本文中 所提供的序列制备多种不同引物和探针并有效用于扩增、克隆和/或测定mRNA的存在和/ 或水平。在一些实施方案中，所述试剂盒包含用于检测至少两种、至少三种、至少四种、至 少五种、至少十种、至少十五种、至少二十种标志物基因的表达水平的试剂。试剂盒还可以 包含对于生成参照值有用的参照样品。所述标志物基因包括但不限于VNN2、MEF2C、LTB、 KCNN3、NCFl、BCL6、IGJ、ELTI1902、PNOC, CSF2RB、P0U2AF1、CD22、RGS13、MEF2B、LRRC8A、 CD40、IFITMl、SMNl、PRRCA、EPDRl、PRPSAP2、IGF1R、BTG2, LM02、YIPF3、CD79B、CD44、CTSC、 UAPljP PUS7。用于检测标志物基因的mRNA表达水平的试剂可包含对于扩增一种标志物基 因的mRNA产物特异性的至少一个引物对。在一些实施方案中，所述引物对可靶向所述mRNA 序列的3'末端(例如靶向3' UTR处的mRNA，其通常是所有转录物变体共同分享的)。在 一些实施方案中，所述试剂盒可进一步包含用于捕捉探针的表面或基片(诸如微阵列)，所 述探针用于检测扩增的核酸。在一些实施方案中，所述试剂盒包含对于使用qRT-PCR检测一种标志物基因表达 水平特异性的至少一个引物对和探针。表10中显示了可以在qRT-PCR中使用的引物和探 针集的例子。对于检测IFITM1，可以使用SEQ IDNO :27、28、和29、SEQ ID NO :60、61、和62、 及SEQ ID N0:93、94、和95所示引物和探针集。对于检测CD40，可以使用SEQ ID NO :24、 25、和26、SEQ ID NO :57、58、和59、SEQ ID NO :90、91、和92所示引物和探针集。对于检测 RGS13，可以使用 SEQ ID NO :114、115、和 116、及 SEQ ID NO 126、127、和 128 所示引物和探 针集。对于检测 VNN2，SEQ ID NO :30、31、和 32、SEQ ID NO :63、64、和 65、及 SEQ ID NO :96、 97、和 98 所示引物和探针集。对于检测 LM02，SEQ ID NO :12、13、禾口 14,SEQ ID NQ :45、46、 和47、及SEQ ID NO :78、79、和80所示引物和探针集。对于检测CD79B，SEQ ID NO :141、 142、和 143、SEQ ID NO :150、151、和 152、及SEQ ID NO :159、160、和 161 所示引物和探针集。 对于检测 CD22，SEQ ID NO :15、16、和 17、SEQID NO :48、49、和 50、及 SEQ ID NO :81、82、和 83 所示引物和探针集。对于检测 BTG2, SEQ ID NO :9、10、禾口 11、SEQ ID NO :42、43、禾口 44、 及SEQID NO :75、76、和77所示引物和探针集。对于检测IGF1R，SEQ ID NO :6、7、和8、SEQ ID NO :39、40、和41、及SEQ ID NO :72、73、和74所示引物和探针集。对于检测CD44，SEQ ID NO :174、175、和 176、SEQ ID NO :180、181、和 182、及 SEQ ID NO 186、187、和 188 所示 引物和探针集。对于检测 CTSC，SEQ ID NO 165、166、和 167、SEQ ID NO 168、169、和 170、 及SEQ ID NO :171、172、和173所示引物和探针集。对于检测EPDR1，SEQ IDNO :21、22、禾口 23,SEQ ID NO :54、55、和 56、SEQ ID NO :87、88、和 89、SEQ ID NO 129、130、禾口 13USEQ IDNO 132、133、和 134、SEQ ID NO 135、136、和 137 所示引物和探针集。对于检测 UAPl，SEQ ID NO :138、139、和 140、SEQ ID NO :147、148、禾口 149、及 SEQ ID NO 156、157、禾P 158 所示 引物和探针集。对于检测 PUS7，SEQ ID NO 177、178、和 179、SEQ ID NO 183、184、和 185、 及SEQ ID NO :189、190、和191所示引物和探针集。对于检测BCL6，SEQ ID N0:102、103、 和104、及SEQ ID NO :108、109、和110所示引物和探针集。用于检测标志物基因的蛋白质表达水平的试剂可包含特异性结合由标志物基因 编码的蛋白质的抗体。所述试剂盒可进一步包含载体手段，其被隔室化以紧密约束方式容纳一个或多个 容器，诸如管形瓶、管等，每个容器装有要在所述方法中使用的分开成分之一。例如，所述容 器之一可以装有可检测标记或能可检测标记的探针。此类探针可以是对标志物基因特异性 的抗体或多核苷酸。若试剂盒利用核酸杂交来检测靶核酸，则所述试剂盒还可以具有装有 用于扩增所述靶核酸序列的核苷酸的容器和/或装有与报告分子(诸如酶标记物、荧光标 记物、或放射性同位素标记物)结合的报告分子(诸如生物素结合蛋白，诸如亲合素或链霉 亲合素)的容器。典型地，本发明的试剂盒包含上文所描述的容器和一个或多个其它容器，其中装 有从商业和使用者观点看需要的材料，包括缓冲剂、稀释剂、滤器、针头、注射器、和印有使 用说明书的包装插页。容器上可以存在标签以指出所述组合物用于特定疗法或非治疗性应 用，而且还可以指出体内或体外使用的用法，诸如那些上文所描述的。所述试剂盒可进一步包含用于制备组织或细胞样品及自样品制备核酸(诸如 mRNA)的一套指令和材料。本发明提供了多种适用于实施本发明方法的组合物，其可以在试剂盒中使用。例 如，本发明提供了可用于这些方法中的表面，诸如阵列。在一个实施方案中，本发明的阵列 包含可用于检测本发明突变的核酸分子个体或集合。例如，本发明的阵列可包含一系列分 开放置的核酸寡核苷酸个体或核酸寡核苷酸组合集，它们能与包含靶核酸的样品杂交，由 此此类杂交表明存在或缺少本发明的突变。将核酸吸附至固相基片(诸如玻璃载玻片)的数种技术是本领域公知的。一个方 法是将修饰的碱基或类似物掺入合成的核酸分子，所述修饰的碱基或类似物包含能够附着 于固体基片的模块(moiety)，诸如氨基、氨基衍生物或带正电荷的其它基团。然后将合成产 物与固相基片(诸如玻璃载玻片)接触，所述固相基片包被有醛或会与扩增产物上的反应 性基团形成共价连接的其它反应性基团，并变成共价附着于玻璃载玻片。其它方法(诸如 使用氨丙基硅烷表面化学的那些)也是本领域已知的，其公开于万维网cmt. corning, com 禾口 cmgm. Stanford, edu/pbrownl。用本领域已知方法也可能将基团附着于寡核苷酸，然后可转化为反应性基团。寡 核苷酸中核苷酸的任何附着物都将成为寡核苷酸的部分，然后其能附着于微阵列的固相表 面。如所使用的技术要求和/或允许的，可进一步修饰扩增的核酸，诸如在附着于固相基片 之前或之后，通过裂解成片段或通过附着可检测标记物来进行。以下内容是本发明方法和组合物的实施例。理解的是，鉴于上文所提供的一般性 说明，可以实施各种其它实施方案。实施例实施例1 :NHL患者对抗CD40抗体治疗的响应性的预测性遗传标志物的鉴定材料 和方法细胞存活力测定法在384孔板中在50ul补充有2% FBS的RPMI 1640中以1500-5000个细胞/孔接 种NHL细胞，并用系列浓度的交联抗⑶40 Ab. 1或对照抗体(抗gD 5B6)处理。为了交联， 在添加至细胞之前，以1 4的比例将抗⑶40 Ab. 1或抗gD与山羊抗人IgG Fc γ片段特 异性抗体的 F(ab' )2 片段(Jackson ImmunoResearch, West Grove，PA) —起在培养基中于 室温温育30分钟。温育96小时后，使用CellTiter-Glo发光细胞存活力测定法(Promega， Madison, WI)依照制造商的指令评估细胞存活力。每个数据点以一式四份实施。使用XLfit来计算IC50、IC25和最大抑制。数据表述成三项独立实验的平均值。 基于IC25和IC50值将对抗CD40 Ab. 1的敏感性分成三个范畴敏感的，中间的，和抗性的。抗体抗⑶40 Ab. 1是一种针对⑶40的人源化IgGl单抗。它是由经遗传工程改造的中 国仓鼠卵巢(CHO)细胞系生成和分泌的。实施例中所使用的、称作抗⑶40 Ab. 1的抗⑶40 Ab. 1具有如下氨基酸序列重链(SEQ ID NO :1)。斜体、下划线显示的ASN 294残基标示碳水化合物模块的位置。EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYSFT GYYIHWVRQA PGKGLEffVARVIPNAGGTSY NQKFKGRFTL SVDNSKNTAY LQMNSLRAED TAVYYCAREGIYffffGQGTLV TVSSASTKGP SVFPLAPSSK STSGGTAALG CLVKDYFPEPVTVSffNSGAL TSGVHTFPAV LQSSGLYSLS SVVTVPSSSL GTQTYICNVNHKPSNTKVDK KVEPKSCDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDff LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPPSREEMTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEffES NGQPENNYKT TPPVLDSDGSFFLYSKLTVD KSRffQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPG轻链(SEQID NO :2)。DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRSSQSLV HSNGNTFLHW YQQKPGKAPKLLIYTVSNRF SGVPSRFSGS GSGTDFTLTI SSLQPEDFAT YFCSQTTHVPWTFGQGTKVE IKRTVAAPSV FIFPPSDEQL KSGTASVVCL LNNFYPREAKVQffKVDNALQ SGNSQESVTE QDSKDSTYSL SSTLTLSKAD YEKHKVYACEVTHQGLSSPV TKSFNRGEC基因表达序型的生成和分析用mirVana miRNA 分离试剂盒(Ambion，Austin, TX)提取总 RNA,并使用 Affymetrix HGU 133P2全基因组表达微阵列来测定。使用AfTymetrix扫描仪提取原始数 据，并使用 R Bioconductor Package (www. bioconductor. org)中的 gcRMA 以缺省力口工所得 CEL文件。使用抗CD40 Ab. 1敏感性和存活力类别间差异的中等t检验鉴定显著差异表达的 基因。使用LIMA包评估其它参数，并为每种基因计算t-统计学、ρ值、调整ρ值、和B-统计
50 100 150 200 250 300 350 400 443
50 100 150 200 219
42学。将探针定位至每种基因，并选择1 1探针对基因定位，用于使用与敏感性测量最强烈 关联的探针进行的下游分析。为了归类入敏感组或中间组或抗性组，将定量逐步线性建模 与靶途径的定量分析组合以鉴定要包括在测定法中的基因的节约集(parsimonious set)。 其它细节和结果在结果部分中提供(表7)。利用Gene Pattern (www. genepattern. org)内的GSEA模块来确定基因集富集 分析。当它们的成员在表型间以一致的方式显著差异表达时，将富集得分授予指定前 (pre-specified)的基因类别。通过获得富集得分并根据基因集内基因的数目调整来计算 标准化富集得分。如下确定名义P值，即排列(permutating)敏感性和抗性标记物，并重新 计算标准化富集得分以给出无效分布(nulldistribution)。使用逐步线性建模鉴定的抗⑶40 Ab. 1敏感指数显示了每种靶基因及其相应的逆向关联的(反_关联的)配对基因(表7)，次序 为选择靶基因包括在指数中的步骤。头3种主要基因(表7中的VNN2、RGS13、⑶22)选自 表2-4(第1步)以模拟敏感的和中间的细胞系中差异过表达的主要成分。这3种基因的 表达是高度关联的，相关系数为+0.77或更高。由于它们的相似性，自表2-4选择一对基因 EPDRl来测量抗性细胞系中的对比过表达。在测定法中包括此类反_关联对基因提供了自 我标准化，即敏感性和抗性二者都与该对之一支的高表达有关。通过这种机制，测定法不依 赖于低的总体mRNA测定水平来限定任何类别，而是通过主要基因对其反关联配对的相对 表达样式来描述每一项(即log2刻度的带正负号的t值之和，其中正负号对应于倍数变化 估值)。在第2-5步中，基于作用机制自新表选择别的基因对，该新表是那些在调整先前步 骤中所鉴定的基因的带正负号的t值的累计之和后与IC25显著相关的。此逐步规程要求 每个新基因对给敏感指数添加另外的预测效力。在第5步后，IC25预测不再需要更多的基 因对。在第6步中，添加了另外一对，因为它有能力在基于前7对基因调整累计指数后预测 最大抑制时的细胞存活力。BCL6是独个添加的，没有相应的配对，这是基于作用机制基本原 理它目前没有掺入最终的敏感指数，其通过基因对1-8的log2刻度表达的带正负号的t 值之和给出。根据临床经验可以明确将其掺入指数。为了归入敏感组或中间组或抗性组， 为敏感指数选择初步截留，以使总体正确分类率最大化。以后为了临床应用可优化基于选 定探针的备选分类规则。结果和分析为了获得对抗⑶40抗体的作用机制的了解及鉴定NHL患者对抗⑶40抗体疗法的 响应性的一种或多种预测标志物，我们在一组31种NHL细胞系间测试了抗CD40 Ab. 1的活 性并评估了响应抗CD40抗体滴度的细胞存活力。来自此实验的表1中突出显示的IC25值 揭示了抗CD40抗体使10种细胞系敏感化，其中细胞存活力在浓度小于0. 4 μ g/ml时降低， 由此定义为“敏感性”细胞系，而13种细胞系甚至在浓度高达1 μ g/ml时都没有实现细胞 存活力降低，由此定义为“抗性”细胞系。8种细胞系具有大于0. 4且小于0. 8的IC25，由 此定义为“中间”细胞系。表1提供了体外NHL细胞系间的抗⑶40 Ab. 1 IC25敏感性数据。对于每种细胞 系，给出了每种细胞系的具体淋巴瘤亚型、IC25值和分类数据。DLBCL(弥漫性大B细胞淋 巴瘤)，FL (滤泡性淋巴瘤)，MCL (套细胞性淋巴瘤)，ALCL (间变性大细胞淋巴瘤)。表1
43
为了鉴定预示抗CD40 Ab. 1体外活性的基因，自处于细胞分裂对数期的细胞系制 备RNA并使用Affymetrix HGUl 33P2微阵列进行基因表达序型分析。通过中等t检验来 确定在敏感性与抗性细胞系之间差异表达的基因，并使用调整P值截留<0. 05来确定显著 性(表2)。在表2中，用调整ρ值<0. 05(5% FDR)来过滤基因列表，得到110种独特基因。 显示了探针ID、基因符号和描述。另外，通过Spearman氏等级相关来确定在所有NHL细胞 系间与IC25值有关的显著基因，并使用P值<-0.57或彡0.57来来过滤基因(表3)。在 表3中，用P值<-0.57或>0.57来过滤基因列表，得到130种独特基因。也显示了探针 ID、基因符号和描述。表4显示了通过这两种方法任一或二者鉴定得到的独特基因的合表。 在表4中，显示了 Log(2)倍数变化，其中关于抗CD40 Ab. 1敏感性，正的倍数变化代表敏感 性类别中的表达升高，而负的倍数变化代表抗性类别的NHL细胞系中的表达升高。基因代 表195种独特基因。也显示了探针ID、基因符号和描述。表2
基因符号探针描述调整P值SLC26A2205097—at溶质载体家族26 (硫酸转运蛋白)，成员20.042377536FCRLMl235400—atFc受体样和粘蛋白样10.042377536PDGFD219304—s—at血小板衍生生长因子D0.043219716
NEDD9240019—at神经前体细胞表达的，发育下调的9-0. 573878183表 4 表4中高表达的基因可能是受到共调节的基因，可能与抗CD40活性的生物学无 关。因此，为了 了解在敏感性与抗性细胞间差异表达的基因的生物学功能，我们进行了基因 集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis) (GSEA) 0在此分析中，我们通过计算该集合 中基因的均值t统计，然后将该均值t统计与为容量相同的随机基因集合计算的均值统计比较来解决问题。低P值可指示基因集与用于生成统计的样品分类之间有一些关联。如此， 基因集分析可解读成高度差异表达的基因的特性的汇总。表5提供了抗CD40 Ab. 1敏感性 对抗性NHL细胞系的基因集富集分析。显示了富集的基因集、每个基因集的基因数目、标准 化的富集得分(NES)、和名义ρ值(NOM p-val)。NES越高和NOMp值越低，则发现越有可能 是显著的。表 5 在GSEA鉴定得到的在生物学方面重要的基因集中，涉及B细胞受体信号传导 (BCR)的基因集和生发中心起源的基因(表5)得到富集。主要感兴趣的是通过BASS0_ GERMINAL_CENTER_CD40_DN基因集确定的涉及⑶40信号传导的基因的观察结果(图1)。 Basso et al.，Blood 104 :4088_96，2004。此基因集涉及据报告在Ramos细胞系中受到 ⑶40L遏制的基因。关于此基因集的表6显示了来自差异表达基因列表的等级和调整ρ值。 在表6中，对已知受CD40L下调的基因，富集在敏感性与抗性细胞系间差异表达的基因。排 好等级的基因衍生自中等t检验(表2)。总共70种基因是此基因集的一部分，此表中显示 了头11种。表6中所显示的基因在抗⑶40 Ab. 1敏感性细胞系中过表达。预期BCR基因 与⑶40L基因有部分交叠，因为这两种信号转导途径在NF- κ B转录轴处会聚，而且这两种 途径能协同来活化B细胞。接着，我们确认是否任何由CD40L诱导的基因能够区分抗CD40 Ab. 1敏感性与抗性NHL细胞系。在表2和表3上差异表达基因列表内的⑶40L基因中，VNN2 给出敏感性与抗性细胞系的最准确区分(图2)。表6 进一步检查差异表达基因列表还揭示了诸如CD22、RGS13、和MEF2B(表2和图3、 图4、图6)等基因，它们指示生发中心B(GCB)细胞在抗⑶40Ab. 1敏感性细胞系中过表达。 图5中显示了与抗⑶40. Ab. 1敏感性有关的⑶40签名基因。值得注意的是，RGS13是通过 中等t检验(表2)和Spearman氏等级相关(表3)在各细胞系间等级最高的基因之一，而 且作为单一基因能以高准确度区分敏感性与抗性以及中间型与抗性类别敏感性对抗性的 准确度为96 %，中间型对抗性为81 %，而敏感性/中间型对抗性为87 %。为了获得最佳归类准确度，有可能会需要基因签名或metagene分类。因此，为了 鉴定可促成最准确分类的基因，我们生成了一种算法来鉴定在组合时会关于抗CD40 Ab. 1 敏感性给出细胞系间最佳可能归类的基因对。因此，我们进行了逐步线性建模来实现此目 的，而且在表7中显示了最终的基因选择。在表7中，显示了每种靶基因及其相应的逆向关 联的(反-关联的)配对基因，次序为选择靶基因包括在指数中的步骤，如较早所描述的。 在计算得到敏感指数(本质上是基因对1-8的log2刻度表达的带正负号的得分之和)后， 此基因对选择揭示了关于抗CD40 Ab. 1的敏感性、中间型和抗性类别的可靠归类(图4)。表7 使用逐步线性建模鉴定的抗⑶40 Ab. 1敏感指数
基因对 编号步骤 编号主要基 因符号主要基 因探针倍数变 化估值配对基 因符号配对基 因探针与主要基因 的相关性11VNN2205922—at+2. 63EPDRl223253—at-0. 7221RGS13210258—at+5. 18EPDRl223253—at-0. 8831CD22204581—at+2. 70EPDRl223253—at-0. 68
75 总之，⑶40L在活化B细胞中发挥至关重要的作用，导致B细胞的扩充和增殖以及 Ig类别转换，而且⑶40L信号传导途径在pre-GCB细胞和post-GCB细胞(包括幼稚和记忆 B细胞)内也是有活性的。因此，令人惊讶的是注意到展示对抗CD40 Ab. 1的敏感性的NHL 细胞与GCB细胞在起源方面是相似的(根据细胞表达序型分析)且具有高表达的CD40L下 调基因(与抗性细胞不同)，指示GCB与决定对抗CD40 Ab. 1的敏感性的CD40途径激活状 态之间的联系。为了进一步确认预测性分类，使用异种移植物模型来探索疗法(诸如组合疗法)。 使用实时定量RT-PCR(qRT-PCR)来测量基因表达水平。在确认预测性分类之后，为一小组 选定的标志物(例如VNN2和RGS13)开发免疫组织化学(IHC)测定法。在临床试验样品中 进一步测试选定的标志物基因。实施qRT-PCR和IHC来测量临床试验样品中选定的标志物基因的表达水平。将来 自对抗CD40治疗有响应的具有复发性弥漫性大B细胞淋巴瘤的患者的样品中的表达水平 与来自对治疗无响应的患者的样品中的表达水平比较。实施例2 临床试验中与对抗CD40Ab. 1治疗的响应性有关的标志物的鉴定临床试验001 (II期)一项多中心、II期、开放标记的研究，用于测定抗⑶40 Ab. 1在复发性DLBCL患 者中的总体响应率和毒性谱。由中心实验室对肿瘤样品评估病理确认和CD40表达。符合 条件的患者在诊断时具有从头的或转化的DLBCL，而且若有在先的无痛性淋巴瘤史的话，则 排除在外。要求由含利妥昔单抗的组合化疗和(如果符合条件的话)自体干细胞移植组 成的在先疗法。患者在5周里接受6次IV输注抗⑶40 Ab. 1 (周期1)，为患者内剂量加载 (intra-patientdose loading)(第 1 天 lmg/kg ；第 4 天 2mg/kg ；第 8 天 4mg/kg)禾口此后 8mg/kg/wk0有响应的患者和具有SD (病情稳定)的患者符合继续治疗的条件，直至疾病有 进展或长达至多12个周期。在接受抗CD40 Ab. 1治疗之前自患者采集肿瘤组织。例如，作 为例行淋巴瘤诊断的一部分来采集样品。临床试验002 (I期)进行了多机构、多剂I期研究来测试静脉内抗⑶40 Ab. 1在复发性NHL患者中的 安全性、药动学特性、免疫原性、和抗肿瘤活性。具有多种NHL组织学亚型的患者登记了此 研究，包括弥漫性大B细胞(DLBCL ； 14)、滤泡(FCL ；9)、套细胞(MCL ；9)、边缘区(MZL ；2)和 小淋巴细胞(SLL ;1)。用如下的剂量加载方案治疗患者第1天和第4天lmg/kg抗⑶40 Ab. 1，随后是第2-5周期间的患者内剂量放大，四个小组剂量放大至最大剂量3、4、6、或8mg/kg。随后，在一个小组中测试了快速剂量加载方案(周期1期间使用的总抗CD40 Ab. 1 增加40% )。有响应的患者或病情稳定的患者符合第二个周期的条件，其中第二个周期由 连续四次每周一次输注小组特异性最大剂量的抗⑶40 Ab. 1组成。8名DLBCL患者完成了 周期1并接受了最大剂量至少3mg/kg抗⑶40 Ab. 1，客观响应率为37. 5% (即1名CR和 2名PR)和2名SD。在1名MCL患者(CR)和1名MZL患者(PR)中看到另外的客观响应。 尚未达到这5名患者的响应持续时间中值(范围为8-37周)。在接受抗CD40 Ab. 1治疗之 前自患者采集肿瘤组织。例如，作为例行淋巴瘤诊断的一部分来采集样品。临床样品制备和qRT-PCR在适宜的IRB批准和患者同意下，自临床调查场所获得来自上文所述I期和II期 临床试验的福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)的档案肿瘤组织。在玻璃载玻片上封固自肿瘤 组织得来的4-6微米切片，而且使用标准病理学实验室方案对每个病例的一张载玻片进行 H&E染色。一名经过委员会验证的病理学家对H&E载玻片标记肿瘤含量，并作为指导用于宏 观解剖剩余含肿瘤区，用于使用Ambion RecoverAll 用于FFPE组织的总核酸分离试剂盒 (产品目录 No. AM1975 ；Applied Biosystems/Ambion, Austin, TX)提取 RNA。使用Applied Biosystems的高容量逆转录cDNA合成试剂盒(产品目录 No. 4368814 ；Applied Biosystems, Foster City, CA)在总反应体积 20uL 中逆转录每份样 品450ng总RNA。遵循制造商的推荐，只是缩短成37 °C 60min RT反应。将5ng总RNA当量 的cDNA(假设100%的cDNA合成效率)产物与AppliedBiosystems的2X通用大师级混合 物(无UNG)在每个PCR测定孔15uL体积中混合。所有扩增在384孔中一式三份地进行， 使用2步(95°C 15秒钟，60°C 1分钟)PCR扩增规程。反应在经过确认的ABI 7900实时 PCR系统上进行40个循环。表10中显示了所使用的引物和探针的序列。
数据加工依照下文“标准化、换算、和归类”下的描述预加工作为结果的原始qRT-PCR，并如“敏感指数和分类”下所述计算敏感指数。将Spearman氏等级相关用于相关性估值和相应 的P值。对于多变量敏感指数，选择探针，并使用套索(lasso) (Li)和脊(ridge) (L2)带 处罚的回归(penalized regression)的弹性网混合(elastic net blend)来评估系数， 如 Zhou et al.，Statist. Soc. B. 67 :301_320，2005 所描述的和如 Friedman, Hastie and Tibshirani, RegularizationPaths for Generalized Linear Models via Coordinate Descent.Technical Report, Dept. of Statistics, Stanford University at www-stat. Stanford, edu/ hastie/Papers/glmnet. pdf所执行的。使用X2检验来检验分类变量间 的关联。标准化、换算和归类下文是测定数据和模型参数的定义定义测定数据1 =参照样品集(例如NHL细胞系)N1 =样本容量
P=探针数目(不包括标准化者(normalize!·)) ^f6s) =对探针j检测到的样本容量 Ai^3) =对探针j未检测到的样本容量
Vij
(σ6 )=对样品i、探针j检测到的原始测定值
^wmAfts)=对样品i检测到的标准化者的值的数目 ^fmAW =对样品i、探针j检测到的标准化者的值 模型参数
Agj6i"-)=对探针j检测到的测定值的1集均值(未标准化的) Sf6s) =对探针j检测到的测定值的1集标准偏差 7f 均值以上的标准偏差的1集数目对于参照样品集，诸如用于拟合指数系数和分类截留的，使用参照集数据计算均 值和标准偏差模型参数(见下文用于参照集模型参数的公式)。对于新样品，例如要计算 指数和类别的一份新样品，必须自参照集1取得模型参数，其选择成对于新样品所来源的 群体最具代表性的。例如，可以维持其中使用该测定法的每种适应证和疗法线(line of therapy)的临床参照集。下文显示了用于计算参照集模型参数和经过换算、标准化的的测 定值的公式。公式参照集模型参数中间值
经过换算、标准化的测定值 中间值
= -^7 sE碏“"’0^样品标准化因数) ρ)
经过换算、标准化、归类的测定值
将完整的N1X ρ数值矩阵，
Xi
S巧
S肿
44
X广■
敏感指数和分类
下文是测定数据和模型参数的定义 定义
测定数据
1 =参照样品集(例如NHL细胞系) N1 =样本容量 P=探针对数目
Xij =对样品i、探针j经过换算、标准化的测定值 Xij ,=如上，对探针j具有抗相关探针对j correlated pair probe to probe j) 模型参数
βU=探针j的1集系数
iW=探针j的经过换算、标准化的测定值的ι集均值 略=探针j的经过换算、标准化的测定值的ι集均值 C1 =分类切点
下文显示了用于计算参照集模型参数和敏感指数和分类的公式 公式
参照集模型参数 探针均值和标准偏差
N = W1JI Zii 1 i=l
输入至敏感指数和分类计算t
(as above with j' the 4 =瓦Σ (即-知广指数和分类敏感指数 敏感类别 临床试验001结果下文表11提供了来自临床试验001的测定标本和临床样品的样品计数。对来自24 名DLBCL患者的29份档案FFPE肿瘤标本进行qRT-PCR加工。3名患者具有多份标本，而且 所有24名患者有至少一份标本有可使用的qRT-PCR结果。在这24人中，21人具有基线和至 少一次基线后拜访时报告的肿瘤直径乘积之和(sum of the product ofdiameters (SPD))测量。表11 临床试验001样品计数 表12汇总了促成敏感指数的主要与配对基因之间的成对Spearman氏等级相关。 基于细胞系开发样品，平均而言，在特定患者组中具有低表达的基因预期应当具有相应配 对的相对高表达，从而提供敏感指数作为上调对下调表达途径之比(即在log2刻度上)的 自我标准化和解读。此第一临床样品中的对之间的相关程度始终是统计学显著的，并且是 突出高的，具有较低的相关估值，为-0. 67 (P = 0. 0004)。这些测试单独构成独立的证实，即 在体外测定靶序列在来自此临床群体的肿瘤样品中表达，而且该测定法检测档案FFPE组 织样品中的表达。
表12 主要和配对基因反_相关(N = 21)
。表13汇总了每种探针个别的测量与基线后肿瘤SPD最大降低(或最小升高)之 间的关联。因为等级相关是基于基线后对基线测量的差异(或比)，所以正关联意味着平 均而言，探针的较高表达与肿瘤增大有关；而平均而言，负关联意味着较高的探针表达与肿 瘤缩小有关。值得注意的是，所有主要-配对探针对与SPD具有反向关联。P值与此样品 中有希望的趋势一致。所有P值低于.5 (当没有真正的关联时预期为50%)。所有范围 是作为自助法(bootstrap)第95百分位置信区间计算得到的，其基于采样时有来自DLBCL 患者样品的置换的 5，000 份复制品，N = 21 (based upon 5,000 replicates sampledwith replacement from the DLBCL patient sample，N = 21)。随着样本容量±曾大，会得至Ij较窄 的范围。由于产生这些结果不需要构建或检查模型，所以它们包含一种强趋势，其确认了这 些qRT-PCR探针测量总体上与用抗⑶40 Ab. 1治疗的患者中肿瘤SPD的缩小是相关的。表13 =SPD和各探针测量(N = 21)之间的关联 多变量敏感指数是表12和13中的探针的加权平均值。因为预期细胞系的权重 不反映患者肿瘤标本中的最佳权重，所以将细胞系的权重限制成1和-1，对应于有正负号 的、相等加权的平均值，其中所述正负号匹配每种探针与细胞系对抗CD40 Ab. 1的抗性(即 IC25)之间的关联。对于临床群体，需要新的权重。作为仅仅基于21份样品的初步分析，我 们选择使用带处罚的、多变量回归规程来选择和估算14种探针中最好的8种的权重。表14 中显示了那些权重(系数)，而图7中描绘了所得敏感指数与相对于基线的SPD变化之间的 关联。较大的多变量敏感指数值与基线后的SPD降低有关(Spearman Sp=-O. 58，P = 0. 006)。表13、14、和15中的所有范围是作为自助法第95百分位置信区间计算得到的，其 基于采样时有来自DLBCL患者样品的置换的5，000份复制品，N = 21。随着样本容量增大， 会得到较窄的范围。表14 多变量敏感指数的权重(N = 21) 使用来自临床试验001的26份样品，表15显示了得到的μ」和σ」值的范围。表15 基于来自临床试验001的数据的μ」和ο」范围 临床试验002结果为具有存档标本的10名患者成功生成了原始qRT-PCR结果。对于这10名患者， 表16显示了诊断、治疗组、多变量敏感指数、临床响应、和相对于基线的SPD变化。多变量 敏感指数权重取自21名临床试验001患者(表14)，所以这些患者组成很小的确认集。敏 感指数大于0的4名患者中有2人在抗⑶40Ab. 1暴露后展现一些肿瘤缩小，而敏感指数小 于等于0的6名患者中有4人展现肿瘤增大或最佳SPD响应(2名患者的SPD不可得，但是 该患者的最佳临床响应结果可得)。表16 临床试验002中6名患者的诊断、治疗组、多变量敏感指数、临床响应和SPD 变化的汇总。
BCL6. qRT-PCR测定法含有针对BCL6基因的第15种探针。虽然目前没有在多变 量敏感指数中使用，但是先前将它鉴定为对抗CD40 Ab. 1的响应的潜在预测物。如图8所 示，虽然不是与组合DLBCL患者样品中的SPD变化显著相关(P = 0. 25, N = 26)，但是BCL6 在肿瘤增大的患者样品中倾向于较低(P =_0.23)。虽然为了清楚理解，已经经由说明和实施例较为详细地描述了上述发明，但是说 明和实施例不应解释为限制本发明的范围。
权利要求
一种用于预测具有B细胞淋巴瘤的受试者对抗CD40抗体治疗的响应性的方法，包括下述步骤(a)测量自所述受试者获得的包含B细胞淋巴瘤细胞的样品中选自下组的一种或多种标志物基因的表达水平IFITM1、CD40、RGS13、VNN2、LMO2、CD79B、CD22、BTG2、IGF1R、CD44、CTSC、EPDR1、UAP1、和PUS7；并(b)基于来自步骤(a)的一种或多种标志物基因的测量表达水平预测所述受试者是否有可能响应抗CD40抗体治疗。
2.权利要求1的方法，其中所述测量表达水平是标准化的。
3.权利要求1或2的方法，其中所述抗CD40抗体治疗是用激动性抗CD40抗体进行的 治疗,且其中IFITM1、CD79B、IGF1R、CD44、CTSC、EPDR^P PUS7中一项或多项的表达与参 照水平相比升高指示所述受试者不太可能响应激动性抗CD40抗体治疗。
4.权利要求3的方法，其中所述参照水平是基于如下样品中相应标志物基因的表达水 平确定的，所述样品来自在抗CD40抗体治疗后肿瘤体积增大的受试者且包含B淋巴瘤细 胞。
5.权利要求4的方法，其中所述来自用于确定参照水平的受试者的样品与所述来自要 预测对抗CD40抗体治疗的响应性的受试者的样品包含相同类型的B淋巴瘤细胞。
6.权利要求1或2的方法，其中所述抗CD40抗体治疗是用激动性抗CD40抗体进行的 治疗，且其中CD40、RGS13、VNN2、LM02、CD22、BTG2、和UAPl中一项或多项的表达与参照水 平相比升高指示所述受试者有可能响应激动性抗CD40抗体治疗。
7.权利要求6的方法，其中所述参照水平是基于如下样品中相应标志物基因的表达水 平确定的，所述样品来自在抗CD40抗体治疗后肿瘤体积缩小的受试者且包含B淋巴瘤细 胞。
8.权利要求7的方法，其中所述来自用于确定参照水平的受试者的样品与所述来自要 预测对抗CD40抗体治疗的响应性的受试者的样品包含相同类型的B淋巴瘤细胞。
9.权利要求3-8任一项的方法，其中所述激动性抗⑶40抗体刺激⑶40且增强⑶40和 ⑶40配体之间的相互作用。
10.权利要求9的方法，其中所述激动性抗⑶40抗体包含SEQID NO :1所示重链氨基 酸序列和SEQ ID NO 2所示轻链氨基酸序列。
11.权利要求3-8任一项的方法，其中所述激动性抗CD40抗体刺激CD40且不增强或抑 制⑶40和⑶40配体之间的相互作用。
12.权利要求1-11任一项的方法，其中测量至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、 至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种、至少i^一种、至少十二种、至少十三 种、或至少十四种标志物基因的表达水平。
13.权利要求12 的方法，其中测量 IFITMl、RGS13、CD79B、CD22、BTG2、CD44、EPDRUP UAPl的表达水平。
14.权利要求1-13任一项的方法，其中所述B细胞淋巴瘤是弥漫性大B细胞淋巴瘤 (DLBCL)。
15.权利要求1-13任一项的方法，其中所述B细胞淋巴瘤是非何杰金氏淋巴瘤。
16.权利要求15的方法，其中所述非何杰金氏淋巴瘤是滤泡性淋巴瘤、套细胞性淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、或小淋巴细胞性淋巴瘤。
17.权利要求1-16任一项的方法，其中所述包含B淋巴瘤细胞的样品是福尔马林固定、 石蜡包埋的活检样品。
18.权利要求1-17任一项的方法，其中所述一种或多种标志物基因的表达水平是通过 所述一种或多种标志物基因的RNA转录物水平测量的。
19.权利要求18的方法，其中所述RNA转录物是通过qRT-PCR测量的。
20.权利要求1-17任一项的方法，其中所述一种或多种标志物基因的表达水平是通过 所述一种或多种标志物基因的蛋白质表达水平测量的。
21.权利要求1-20任一项的方法，进一步包括测量BCL6的表达水平，其中BCL6的表达 水平与参照水平相比更高指示所述受试者有可能响应抗CD40抗体治疗。
22.权利要求21的方法，其中所述参照水平是基于如下样品中BCL6的表达水平确定 的，所述样品来自在抗CD40抗体治疗后肿瘤体积缩小的受试者且包含B淋巴瘤细胞。
23.一种为具有B细胞淋巴瘤的受试者制备个性化基因型序型的方法，包括下述步骤(a)测定自所述受试者获得的包含B淋巴瘤细胞的样品中选自下组的一种或多种标志 物基因的表达水平IFITM1、CD40、RGS13、VNN2、LM02、CD79B、CD22、BTG2、IGF1R、CD44、CTSC、 EPDR1、UAP1、PUS7、和 BCL6 ；并(b)生成总结步骤(a)中获得的一种或多种标志物基因的表达水平的报告。
24.权利要求23的方法，其中所述表达水平是标准化的。
25.权利要求23或24的方法，其中测量至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少 六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种、至少十一种、至少十二种、至少十三种、至 少十四种、或至少十五种标志物基因的表达水平。
26.权利要求25 的方法，其中测量 IFITMl、RGS13、CD79B、CD22、BTG2、CD44、EPDRUP UAPl的表达水平。
27.权利要求23-26任一项的方法，其中所述报告包括对所述受试者推荐抗CD40抗体治疗。
28.权利要求27的方法，其中所述抗CD40抗体治疗是用激动性抗CD40抗体进行的治 疗,且其中IFITM1、CD79B、IGF1R、CD44、CTSC、EPDR^P PUS7中一项或多项的表达与参照 水平相比升高指示所述受试者不太可能响应激动性抗CD40抗体治疗。
29.权利要求28的方法，其中所述参照水平是基于如下样品中相应标志物基因的表达 水平确定的，所述样品来自在抗CD40抗体治疗后肿瘤体积增大的受试者且包含B淋巴瘤细 胞。
30.权利要求29的方法，其中所述来自用于确定参照水平的受试者的样品与所述来自 要制备个性化基因组序型的受试者的样品包含相同类型的B淋巴瘤细胞。
31.权利要求27的方法，其中所述抗CD40抗体治疗是用激动性抗CD40抗体进行的治 疗,且其中CD40、RGS13、VNN2、LM02、CD22、BTG2、和UAPl中一项或多项的表达与参照水平 相比升高指示所述受试者有可能响应激动性抗CD40抗体治疗。
32.权利要求31的方法，其中所述参照水平是基于如下样品中相应标志物基因的表达 水平确定的，所述样品来自在抗CD40抗体治疗后肿瘤体积缩小的受试者且包含B淋巴瘤细 胞。
33.权利要求32的方法，其中所述来自用于确定参照水平的受试者的样品与所述来自 要制备个性化基因组序型的受试者的样品包含相同类型的B淋巴瘤细胞。
34.权利要求28-33任一项的方法，其中所述激动性抗⑶40抗体刺激⑶40且增强⑶40 和⑶40配体之间的相互作用。
35.权利要求34的方法，其中所述激动性抗⑶40抗体包含SEQID NO :1所示重链氨 基酸序列和SEQ ID NO :2所示轻链氨基酸序列。
36.权利要求28-33任一项的方法，其中所述激动性抗CD40抗体刺激CD40且不增强或 抑制⑶40和⑶40配体之间的相互作用。
37.权利要求23-36任一项的方法，其中所述B细胞淋巴瘤是弥漫性大B细胞淋巴瘤 (DLBCL)。
38.权利要求23-36任一项的方法，其中所述B细胞淋巴瘤是非何杰金氏淋巴瘤。
39.权利要求38的方法，其中所述非何杰金氏淋巴瘤是滤泡性淋巴瘤、套细胞性淋巴 瘤、边缘区淋巴瘤、或小淋巴细胞性淋巴瘤。
40.权利要求23-39任一项的方法，其中所述包含B淋巴瘤细胞的样品是福尔马林固 定、石蜡包埋的活检样品。
41.权利要求23-40任一项的方法，其中所述一种或多种标志物基因的表达水平是通 过所述一种或多种标志物基因的RNA转录物水平测量的。
42.权利要求41的方法，其中所述RNA转录物是通过qRT-PCR测量的。
43.权利要求23-40任一项的方法，其中所述一种或多种标志物基因的表达水平是通 过所述一种或多种标志物基因的蛋白质表达水平测量的。
44.一种用于预测具有B细胞淋巴瘤的受试者对抗CD40抗体治疗的响应性的方法，包 括下述步骤(a)测量自所述受试者获得的包含B淋巴瘤细胞的样品中选自下组的至少两种标志物 基因的表达水平IFITM1、CD40、RGS13、VNN2、LM02、CD79B、CD22、BTG2, IGF1R、CD44、CTSC、 EPDRl、UAPl、和 PUS7 ；(b)基于步骤(a)中的标志物基因的测量表达水平通过下述方程计算敏感指数值 (Si) 其中测量表13所示至少一种具有正关联值的标志物基因的和至少一种具有负关联值 的标志物基因的表达水平；其中(i) h是所测量的每一种标志物基因的系数值；(ii)p是 所测量的标志物基因的数目；(iii)Xi是对于来自要测量表达水平的受试者的样品所测量 的每一种标志物的经过换算、标准化的表达水平；而(iv) μ」和ο」是所测量的每一种标志 物基因的均值和标准偏差；其中βρ μ ^和％.是自包含B淋巴瘤细胞的、来自临床实验的 患者样品确定的；且其中敏感指数的值等于或大于零指示所述受试者有可能响应抗CD40 抗体治疗，或者其中敏感指数的值小于零指示所述受试者不太可能响应抗CD40抗体治疗。
45.权利要求44的方法，其中测量至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七 种、至少八种、至少九种、至少十种、至少十一种、至少十二种、至少十三种、或至少十四种标 志物基因的表达水平并用于计算敏感指数。
46.权利要求44 的方法，其中测量 IFITMl、RGS13、CD79B、CD22、BTG2、CD44、EPDRUP UAPl的表达水平并用于计算敏感指数。
47.权利要求44的方法，其中β、μ和σ是自与要预测对抗CD40治疗的响应性的受 试者的样品具有相同类型B淋巴瘤细胞的患者样品确定的。
48.
49.一种试剂盒，包括用于测量来自受试者的包含B淋巴瘤细胞的样品中选自下组的 至少一种标志物基因的表达水平的试剂IFITMl、CD79B、IGF1R、CD44、CTSC、EPDRl、PUS7、 CD40、RGS13、VNN2、LM02、CD22、BTG2、和 UAP1。
50.权利要求49的试剂盒，其中所述试剂包括用于通过qRT-PCR检测每一种标志物基 因的表达水平的至少一对引物和至少一种探针。
51.权利要求49或50的试剂盒，进一步包括关于基于所测量的一种或多种标志物基因 的表达水平评估具有B细胞淋巴瘤的人类受试者是否有可能响应抗CD40抗体治疗的指令。
52.权利要求50的试剂盒，其中所述引物对和探针选自下组SEQID N0:27、28和29; SEQ ID NO :60、61、和 62 ;SEQ ID NO :93、94、和 95 ;SEQ ID NO :24、25、和 ·26 ;SEQ ID NO: 57、58、和 59 ;SEQ ID NO :90、91 和 92 ;SEQ ID NO :114、115、和 116 ;SEQ ID N0:126、127、 ^P 128 ；SEQ ID NO :30、31、和32 ;SEQ ID NO :63、·64、和65 ;SEQ ID NO :96、97、和98 ;SEQ ID NO :12、13、和 14 ;SEQ ID NO :45、46、和 47 ;SEQID NO :78、79、和 80 ;SEQ ID N0:141、142、 ^P 143 ；SEQ ID NO :150、151、和 152 ;SEQ ID NO 159、160、和 161 ;SEQ ID NO 15、16、和 17 ； SEQ ID NO :48、49、和50 ;SEQ ID NO :81、82、和83 ;SEQ ID NO :9、10、和 ·11 ;SEQ ID NO :42、 43、和 44;SEQ ID NO :75、76、和 77 ;SEQ ID NO :6、7、和 8 ;SEQ ID NO :39、40、和 41 ;SEQ ID NO :72、73、和 74 ;SEQ ID NO :174、175、和 ·176 ;SEQ ID NO :180、181、和 182 ;SEQ ID NO 186、 187、和188;SEQ ID NO 165、166、禾口167 ；SEQ ID NO 168、169、禾口170 ;SEQ ID N0:171、172、 和 ·173 ；SEQ IDNO :21、22、禾口 23 ；SEQ ID NO :54、55、禾口 56 ；SEQ ID NO :87、88、和 89 ；SEQ ID NO :129、130、禾口131 ;SEQ ID NO 132、133、和134 ;SEQ ID NO 135、136、和137 ;SEQ ID NO: 138、139、和140 ;SEQ IDNO :147、148、和149 ;SEQ ID NO :156、157、和158 ;SEQ ID N0:177、 178、和 179 ；SEQ ID NO :183、·184、和 185 ；及 SEQ ID NO :189、190、和 191。
53.权利要求49-52任一项的试剂盒，进一步包括用于测量来自受试者的包含B淋巴瘤 细胞的样品中BCL6的表达水平的试剂。
54.权利要求53的试剂盒，其中所述试剂包括用于通过qRT-PCR测量BCL6的表达水平 的至少一对引物和至少一种探针。
55.权利要求54的试剂盒，其中所述引物对和探针是SEQID NO 102、103和104，或者 是 SEQ ID NO :108、109 和 110。
全文摘要
本发明提供了对于预测或评估B细胞淋巴瘤对抗CD40抗体治疗的响应性有用的方法和试剂盒。
文档编号C12Q1/68GK101910414SQ200880124201
公开日2010年12月8日 申请日期2008年11月7日 优先权日2007年11月7日
发明者巴特·布林顿, 戴维·多南 申请人:健泰科生物技术公司