专利名称：弥漫性大B细胞淋巴瘤相关抗原特异TCR Vα6亚家族的MS基因序列及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一个T细胞受体(TCR)的核苷酸序列，特别涉及弥漫性大B 细胞淋巴瘤(DLBL)相关抗原特异TCR Va6亚家族的MS基因序列及应用。
背景技术：
近年来，非霍奇金淋巴瘤(NHL)发病率呈持续上升趋势。据估计，21 世纪初，NHL将占侵袭性恶性肿瘤的4.4M，并占所有癌症死亡数的4.8%。其 中弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBL)是最常见的NHL，约占30% 40%，其中 超过60岁的老年患者占70%。 20多年来主要采用以CHOP方案(环磷酰胺、 多柔比星、长春新碱、泼尼松)为主的化疗。但对部分老人有毒性作用，长期 生存率低。近期开展的靶向免疫治疗如利妥昔单抗(CD20单抗)的出现虽然 取得了新的疗效,但微小残留病变的存在导致的疾病复发仍然是目前临床治疗 的棘手问题。多年来，各国学者一直在努力寻求更有效的治疗方法。临床肿瘤 学家对特异性的细胞免疫治疗寄予厚望。Xue等于报道利用从白血病患分离出 能够特异识别HLA-A2限制的WT1抗原表位的CTL，将CTL的TCR基因转 染患者的T淋巴细胞，在小鼠试验中显示出转染细胞的特异杀伤性。随后Tsuji 等将从进一步证明了利用转导WT1特异的TCR基因的Thl和Tcl显示出HLA 限制的的杀伤作用，同时转染的Thl细胞具有分泌大量IFN-Y和IL-2的功能， 由于IFN-y和IL-2在遏制肿瘤中发挥重要的作用，因而可以通过该转染相应 的TCR基因的方法对肿瘤的免疫治疗发挥重要的作用。
目前利用肿瘤细胞相关抗原特异的TCR基因修饰正常T细胞(自体的或 供者源T细胞)，从而获得具有杀伤相应肿瘤细胞的细胞毒T淋巴细胞(CTL), 这是近年抗肿瘤特异性细胞免疫治疗的一个重要发现。抗原特异TCR修饰正 常T细胞而获得特异抗肿瘤T细胞克隆的研究首先在黑色素瘤中展开，随后 有多个研究扩展了该技术的应用，如特异性抗EB病毒阳性细胞的CTL、抗 WT1的CTL，个别已形成了 TCL产品用于临床治疗。制备CTL产品的关键 是明确肿瘤/白血病细胞的相关抗原，从而获得抗原特异的TCR，进而诱导产生特异抗白血病/肿瘤的T细胞克隆。目前国内外对淋巴瘤的研究主要集中在 T细胞型淋巴瘤，而对B淋巴细胞淋巴瘤的研究资料较少，主要原因可能是对 B淋巴细胞型淋巴瘤的相关抗原了解得较少有关。
发明内容
为了克服上述现有技术存在的不足，本发明的首要目的在于提供一种弥漫 性大B细胞淋巴瘤相关抗原特异TCR Vct6亚家族的MS基因序列。
本发明从DLBL患者外周血中存在T细胞受体(TCR) Va亚家族的克隆 性T细胞(TCRa和TCR|3链分别为TCRa|3+T细胞表面所表达的异源双链TCR 的组成部分，两者在T细胞免疫中具有同样重要的地位)，经序列分析显示其 特异性TCR序列的高度可变区V-N-J区，即互补决定区3 (CDR3)，与抗原 特异性识别结合的部位，表明该克隆性T细胞所表达的TCR为DLBL相关抗 原刺激所产生的特异性TCR，获得了 DLBL相关的TCR基因序列。
本发明公开了针对DLBL相关抗原的特异性TCR的基因序列，尤其是 TCR的高度可变区即CDR3，后者是T细胞表面受体识别抗原的特异区域， 针对于不同抗原，除了机体所选用的TCRVa亚家族T细胞不同，更为关键的 是其TCR基因的CDR3序列的差异，该部位决定了所属T细胞所能识别的抗 原。本发明提供的识别DLBL相关抗原的TCR Va6基因序列，由于其CDR3 的特异性，仅来自于单一克隆的T细胞，是一高度特异的序列。同时，根据 CDR3的基因序列编码的蛋白质，可用来了解DLBL的相关抗原肽，为了解 DLBL的生物学特性提供资料。
本发明的另一目的在于提供上述基因序列的应用。
根据所获得的DLBL相关抗原的特异性TCR的核苷酸序列，可以用于(1) 了解DLBL病人所存在的抗DLBL的TCR Va6亚家族T细胞的情况，用于评 价病人的免疫功能状态，(2)通过转基因技术将DLBL相关抗原的特异性TCR 基因转入正常T淋巴细胞中，使其强制表达这种特异性的TCR，改变T细胞 内源性TCR识别抗原的原有模式，具备分泌细胞因子和(或)特异杀伤耙细 胞的功能，经体外短期培养扩增即可产生足量的CTL，再回输入患者体内使 其对DLBL细胞行使靶向细胞免疫效应。
本发明的目的通过下述技术方案来实现 一种弥漫性大B细胞淋巴瘤相 关抗原特异TCR Va6亚家族的MS基因序列，所述MS基因序列如下所示TCCGCCAACCTTGTCATCTCCGCTTCACAACTGGGGGACTCAGCAATGTA
TTTCTGTGCAATGAGTCCCATGAACACAGGCTTTCAGAAACTTGTATTTG
GAACTGGCACCCGACTTCTGGTCAGTCCAAATATCCAGAACCCTGACCC
TGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGC
CTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTC
TGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACT
TCAAGAGCAACAGTGCTGTGGCCT GGAGCAAC。
其中，所述基因序列为330个bp: l-65bp为V区；66-70bp为N区；71-130bp 为J区；131-330bp为C区。
上述弥漫性大B细胞淋巴瘤相关抗原特异TCR Va6亚家族的MS基因序 列翻译的蛋白质(110AA)如下
VYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFK SNSAVAWSN。
其中CDR3区包括V区的下游端、N区和J区的上游端。
上述弥漫性大B细胞淋巴瘤相关抗原特异TCR Va6亚家族的MS基因序 列的制备方法，包括如下步骤
a. 收集DLBL患者外周血，Ficoll分层法分离外周血单个核细胞；
b. 提取外周血单个核细胞的RNA, RT-PCR合成cDNA第一链；
c. 在NCBI的Genebank中査找TCRa链的基因序列，并标出各亚家族的V区 及C区在基因组中的位置；
d. 设计29个Va特异性上游引物及Ca下游引物；
e. PCR扩增29个Va亚家族TCR重排时产生的V-N-JC区；
f. Ca-Fam标记PCR产物，基因扫描分析T细胞亚家族的表达和克隆性；
g. 将呈单克隆或寡克隆扫描图的亚家族PCR产物进行切胶纯化序列分析。 上述弥漫性大B细胞淋巴瘤相关抗原特异TCR Va6亚家族的MS基因序
列在制备弥漫性大B细胞淋巴瘤特异性分子靶向过继性免疫药物中的应用。 本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果 (1 )本发明制备得到了 一种独特的DLBL抗原的相关TCR Va6基因序列， 该序列可以作为一种新的抗原识别TCR基因(主要变化区在于CDR3序列) 补充人类基因库资料。(2)该TCR基因可用于研究DLBL的特异性免疫诊断和治疗。 上述弥漫性大B细胞淋巴瘤相关抗原特异TCR Va6亚家族的基因序列，
一方面可用于进一步检测病人体内所存在的TCR Va6亚家族T细胞的情况，
以评价其细胞免疫功能状态，另一方面是应用在制备弥漫性大B细胞淋巴瘤
分子耙向过继性免疫细胞治疗研究方面。
前者的检测所采用技术与上述检测TCR基因的技术相同，通过不同时间
点的分析，可以了解病人所存在的TCRVa6亚家族T细胞的情况，用于了解
病人的免疫状态。
后者主要通过转基因技术将DLBL相关抗原特异的TCR基因修饰自体或 异基因正常T细胞，这些经过修饰的细胞就可提供对抗确定的肿瘤特异性抗 原的T细胞反应性，从而具备了发挥相应特异性识别杀伤DLBL细胞的细胞 毒活性，可以制备特异性抗DLBL细胞的CTL产品。国外有相关的动物实验 研究提示这类技术有可能发挥特异性的免疫治疗效果。本发明所提供的TCR 基因的应用最终目的是通过对DLBL患者进行特异性免疫治疗，从而提高疗 效，清除微小残留病变，减少疾病治疗后复发提高长期生存率，改善病人的生 存质量等，是具有很大的市场推广应用价值和和较大的社会经济效益。
图1为DLBL相关抗原特异TCRVa6亚家族的基因扫描图。 其中，A为TCRVa6亚家族单克隆图；B为TCRVa6亚家族双克隆图； C为TCRVa6亚家族多克隆图；D为TCR Va6亚家族寡克隆图。
具体实施例方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方 式不限于此。
实施例
(一)抗原特异性TCR基因序列的分析 分析TCR Va基因谱的CDR3的长度和碱基序列的方法是利用RT-PCR— 基因扫描方法分析TCR Va 29个亚家族的CDR3长度。首先收集DLBL患者 外周血，Ficoll分层法分离外周血单个核细胞，留取P10"个PBMCs (外周血单个核细胞)提取RNA， RT-PCR合成cDNA。同时，在NCBI的基因库中査 找出TCRa链的基因序列,并标出各亚家族的V区及C区在基因组中的位置。 根据Va 29个亚家族基因的cDNA设计相应的29个Va特异性上游引物，并 在Ca区设一 Ca下游引物，利用PCR技术扩增患者29个Va亚家族TCR重 排时产生的V-N-JC区。如图1所示，荧光素Fam标记各亚家族PCR产物的Ca 区，基因扫描分析T细胞各亚家族的表达，根据不同位置，高度和形态的峰， 表示产物的大小、量和均一性，从而确定T细胞克隆性(一般情况下，正常 转录的每个Va亚家族包含8 10个峰，即8 10个不同克隆的T细胞；主峰 的出现表明相同大小cDNA的过度扩增，单峰表明产物中DNA片断大小相同， 均存在寡克隆或单克隆T细胞群，三者分别提示产物来自多克隆、寡克隆和 单克隆的T细胞)。基因扫描结果发现患者的Va6亚家族T细胞呈明显单克 隆；将Va6亚家族的PCR产物切胶纯化，序列分析发现了 Va6亚家族TCR 的基因序列及其CDR3区(V-N-J区)，即为与淋巴瘤相关抗原特异性结合的 部位。弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBL)相关抗原特异TCR Va6亚家族的MS 基因序列的具体制备方法1、 分离外周血单个核细胞(1) 取淋巴细胞分离液(Ficoll，密度1.077) 4mL加入离心管内，将稀 释后的抗凝外周血标本混悬液平铺于分离液之上，以水平离心机，2000rpm， 离心15分钟。(2) 吸取中间单个核细胞层转移至另一离心管内，再加入5mL 1640液， 轻轻吹打，以1500rpm，离心洗涤10分钟，弃上清，加入1640液至2mL，混 匀后计数，并用同样的方法洗涤两次，按2xl07mL调整细胞浓度备用。2、 RNA提取(TRIzol试剂盒方法提取法)(1) 将已加入TRIzol试剂一2(TC冻存的细胞取出，置冰上解冻，混匀后 加入0.2mL氯仿，充分混匀，4°C， 14000rpm离心30分钟。(2) 吸取上层液至另一离心管，加入0.5mL异丙醇并混匀，室温静置IO 分钟后4。C， 14000 rpm离心30分钟。(3) 去上清，并用lmL75^乙醇(一20。C)洗两次(2 8。C， 14000rpm)， 每次混匀30秒后，离心IO分钟。(4) 去上清，再离心2 3分钟，去除剩余的乙醇，置于超净台上自然干燥1 1.5小时。加入超净水(20 50pL)溶解。(5) 于紫外线分光光度仪中检测样品的纯度和含量，0.8%琼脂糖凝胶电 泳检测RNA的完整性和质量。(6) RNA保存RNA样品加入其0.1倍容积的3mol/LNaAC (醋酸钠) 和2倍容积的乙醇后，保存于一80'C备用。3、 cDNA合成(1 )应用六聚体随机引物和反转录酶试剂盒合成cDNA第一链。l吗RNA 加入16.5卩iL预先配制的混合液其中包括7pL H20、 2ML10xPCR-Buffer、 2^iL 0.1mmol/L DTT、 5^L 2.5mmol/L dNTP和0.5jiL Rand.Hexmer。(2) 于73°C 3分钟后，置于冰中30秒。低温高速离心30秒置于冰中2 3分钟。(3) 加入0.6pL Rnasin (33U/(xL)和0.5Superscript (200U/|iL)后， 低温高速离心30秒。(4) 室温静置10分钟；42°C， 40分钟以上；83°C， 5分钟，一20。C保存备用。4、 cDNA合成质量检测将所有样本的cDNA经PCR检测p2M基因(引物序列见表1)而确定其 合成质量。总反应体系20^L，其中上下游引物0.5(xmol/L， dNTP 0.1mmol/L， Taq聚合酶l.OU， MgCL2 1.5mmol/L， 10xPCR缓冲液2^iL， cDNA产物l^iL 和dH20，同时设置阳性和阴性对照。在德国BiometraPCR扩增仪中进行PCR反应。反应条件94°C 1分钟(首次3分钟)，58°C 1分钟，72°C 1分钟(末次 6分钟)，共35个循环，最后保存于4。C中。取8pLPCR产物以1.5% (w/v) 琼脂糖凝胶进行电泳，P2M阳性者可进一步研究，阴性者视为无cDNA合成， 弃去不用。5、 PCR扩增TCRVa29个亚家族以29个TCR Va亚家族基因设计相应的特异性上游引物，并在Ca区设 计一个下游引物(引物序列见表1)。 PCR按常规方法进行。总反应体系20pL, 其中含任一Va引物(24个VP亚家族之一)和Ca引物0.5jamol/L，余同上。反应条件94°C、 1分钟(首次3分钟)，60°C、 1分钟和72°C、 1分钟(末 次6分钟)，共进行40个循环，最后PCR产物保存于4°C中。取8pLPCR产物电泳分析结果。6、 T细胞克隆性分析(1) 标记PCR产物lOiaL的反应体系含2.5pL未标记的PCR产物、0.15pmol/L Ca-fam引物、 1.5mmol/LMgCl2， 0.1mmol/L dNTP， 0.75UTaq聚合酶，1^iL10xPCR缓冲液 和dH20。 PCR共进行35循环，每一循环包括94°C、 1分钟(首次3分钟)， 66°C、 1分钟和72'C、 l分钟(末次6分钟)，最后PCR产物保存于4X:中。(2) 基因扫描样品配制荧光素标记的PCR产物(2pL)加入高质量的去离子甲酰胺(Hi-Di Formamide)与Genescan-500 LIZ分子量标准品按20 : 1 (体积比)比例配好 的10pL混合液中。(3) 基因扫描(按操作指南进行)1) 按操作指南准备好仪器并更换水和缓冲液。2) 灌胶灌胶前2小时从4。C冰箱取出POP-4 (Performance Optimized Polymer-4)胶回温1 2小时，把胶液抽进贮胶5mL针筒中(抽取的mL数约 为0.5+0.07 x做样次数)，倒置排出针筒内气泡，装紧针筒。3) 上样将备好的样品于9《C变性4分钟，然后立即放置冰上冷却2分 钟。变性后的样品加入96孔板，直接装载到3100遗传分析仪进行电泳。4) 运行自动进样器会自动把样品板移到要分析的4个样品的位置，电 泳过程中CCD检测器把荧光信号转换为电信号并把它传送给安装了3100数据 采集软件的计算机工作站。5) 数据处理数据处理完成后就存贮在计算机的数据库里并以电泳信号 图的形式显示出来。电泳信号图的X轴表示时间，Y轴表示相对荧光强度， 每个图中同时画出几种用于标记DNA片断的荧光素信号，电泳信号图中的每 个峰代表一个DNA片断。完成处理的数据被自动地从数据库中提取并进行分 析。6) 结果分析打开GeneMapper SoftwareTM v3.5，将保存于计算机硬盘 数据库中的原始数据加进分析软件，分析产物的长度和荧光素强度。7、 核苷酸序列分析(1) E.Z.N.A.凝胶回收试剂盒纯化PCR产物O切胶将PCR产物全部加入l 2n/。的琼脂糖凝胶的加样孑L，当电泳至足以分离目的DNA时，于紫外灯下用干净的手术刀切下含有目的条带的琼脂 糖凝胶块，切下的凝胶块置于1.5 mL离心管中。2) 按E.Z.N.A.凝胶回收试剂盒说明进行PCR产物的纯化，先加入500 Binding Buffer, 55 65"C孵育至凝胶块完全溶解；凝胶溶解液加入HiBind DNA spin-column中高速离心去废液后，再依次加入300Binding Buffer、 700 SPW Buffer洗膜；高速离心甩干spin-column的滤膜后，加入30DNA Elution Buffer (加于滤膜上)，室温静置5 min，高速离心1 min后可得纯化的PCR产 物。3) 取3 |_iL纯化后的PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，观察纯化效果； 剩余的PCR纯化产物真空冷冻干燥浓縮约20 min至10 左右。(2) BigDye标记用BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit标记纯化后的PCR产物， 反应体系为BigDye Terminator 1 pL、相应单向引物(2 nmol/L) 1.6|iL、纯 化后PCR产物2.4 nL，反应条件96°C 1 min， (96°C 10 sec、 50°C 5 sec、 60°C 4 min) 25个循环。(3) 测序将标记好BigDye的5 体系的测序产物补水至20 ^L，转入1.5 ml的离 心管，再依次加入2 3 MNaAc(pH 5.2)、2 125 mM EDTA-Na2、50 jiL 95% 乙醇，旋涡振荡后室温下避光放置15 min; 5415型高速台式离心机2800 g离 心20 min，沿离心沉淀物的对侧小心吸取上清并弃去，加入250 70%冰冻 乙醇，2800g离心5min，弃上清；将管盖打开置于加热板上，94 95°C 1 min 使其干燥。加入IO ^L高质量的去离子甲酰胺，反复吹打混匀，转入0.2 的PCR管内，在PCR仪上95t:变性4 min，然后迅速置冰中冷却至少4 min 后，装载到3100 DNA序列分析仪上进行毛细管电泳。_表l RT-PCR实验所涉及的引物序列引物_^_Val5' GGCATTAACGGTTTTGAGGCTGGA3， Va25' CAGTGTTCCAGAGGGAGCCATTGT3， Va35' CCGGGCAGCAGACACTGCTTCTTA3， Va45' TTGGTATCGACAGCTTCACTCCCA3' Va55' CGGCCACCCTGACCTGCAACTATA3，Va65'TCCGCCAACCTTGTCATCTCCGCT3'Va75'GCAACATGCTGGCGGAGCACCCAC3'Va85'CATTCGTTCAAATGTGGGCAAAAG3'Va95，CCAGTACTCCAGACAACGCCTGCA3'ValO5，CACTGCGGCCCAGCCTGGTGATAC3'Vall5，CGCTGCTCATCCTCCAGGTGCGGG3'Val25，TCGTCGGAACTCTTTTGATGAGCA3'Val35，-TTCATCAAAACCCTTGGGGAC AGC-3'Val45，-CCCAGCAGGCAGATGATTCTCGTT-3'Val55，-TTGCAGACACCGAGACTGGGGACT-3'Val65，-TCAACGTTGCTGAAGGGAATCCTC-3'Val75，-TGGGAAAGGCCGTGCATTATTGAT-3'Val85，-CAGCACCAATTTCACCTGCAGCTT-3'Val95，-ACACTGGCTGCAACAGCATCCAGG-3'Va205，-TCCCTGTTTATCCCTGCCGAC AGA-3'Va215，-AGC AAAATTC ACCATCCCTGAGCG-3'Va225，-CCTGAAAGCCACGAAGGCTGATGA-3'Va235，-TGCCTCGCTGGATAAATCATCAGG-3'Va245，-CTGGATGCAGACACAAAGCAGAGC-3 ，Va255，-TGGCTACGGTACAAGCCGGACCCT-3Va265'-AGCGCAGCCATGCAGGCATGTACC-3'Va275，-AAGCCCGTCTCAGCACCCTCCACA-3'Va285，隱TGGTTGTGCACGAGCGAGACACTG-3'Va295，-GAAGGGTGGAGAACAGATGCGTCG-3'Cal5，-GTTGCTCCAGGCCGCGGCACTGTT-3'Ca-Fam5，-Fam-ATACACATCAGAATCCTTACTTTG-3'5，隱TACACTGAATTCACCCCCAC|32-M3'5，-CATCCAATCCAAATGCGGCA(二)抗原特异TCR基因转导技术1、重组质粒TCRVa6 (MS) -pIRES的构建*(1) 目的基因的扩增 根据DLBL相关TCRVa6亚家族基因序列(包括完整的CDR3区)设计引物，扩增病人样本中的TCR Va6基因序列的上游引物上带有Xho I酶切位 点、下游引物上带有EcoRl酶切位点(与真核表达载体pIRES中的插入位点 A的酶切位点相对应)。按BD Advantage 2 PCR试剂盒说明书进行PCR反 应PCR总反应体系50pL，其中含10 XBD Advantage 2 PCR Buffer、上下游 引物各0.5 jimol/L、 dNTP Mix 0.2 mmol/L、 50XBD Advantage 2 Polymerase Mix、超纯水和1 nL cDNA模板，同时设置阳性和阴性对照。反应条件94 °C 1 min (首次为3 min)、 60°C 1 min、 72 °C 2 min (末次为7 min)，共35 个循环。扩增产物用1% (w/v)琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。(2) 重组质粒的构建A、 E.Z.N.A.凝胶回收试剂盒纯化目的基因TCRVa6的PCR产物(同第一 部分，步骤7);B、 将真核表达载体pIRES与纯化后的TCRVa6PCR产物分别用Xho I酶 切，体系为①TCRVa6PCR产物28pL、 TangoTMbuffer 8 ^L、 Xho I内切酶 1 nL、超纯水3 nL;②pIRES载体4 ^iL、TangoTMbuffer 8 nL、Xho I内切酶l fiL、 超纯水27pL;混匀后置于37'C水浴3h;C、 纯化Xho I酶切后的pIRES载体和TCRVa6PCR产物；D、 将已纯化好的Xho I酶切后的pIRES载体和TCRVa6PCR产物分别再 用EcoR I酶切，体系为①TCR Va6 PCR产物(Xho I ) 28 jiL、 TangoTMbuffer 8 pL、 EcoR I内切酶l pL、超纯水3 ②pIRES载体(Xho I ) 28 ^L、 TangoTMbuffer 8 pL、 EcoRl内切酶lpL、超纯水3 ^L;混匀后置于37。C水浴3 h;E、 双酶切后的pIRES载体和TCRVa6PCR产物进行连接反应体系为 10XT4bufferl ^L、 T4DNA酶lpL、双酶切后的pIRES载体2 ^L、双酶切后的 TCR Va6 PCR产物6 pL，混匀后置于16。C过夜；F、 转化①将连接产物(10pL)加入感受态大肠杆菌DH5a (1.5mL离 心管，100nL菌液，一70。C保存，北京Tiangen公司)中，轻轻混匀，置冰中 30min;②42。C热休克90s，迅速置冰中3 min;③加入SOC培养基800 ^L，置干燥恒温振荡箱中37"C 180 200rpm振摇60min; 菌液用玻璃推铺于1.5% LB固体培养基(含氨苄青霉素100pg/mL)上，置37。C孵箱过夜培养；G、 随机挑选10个菌落，分别接种于5mL含氨苄青霉素的LB培养液中， 37°C 180rpm振摇培养过夜，PureLinkTM超纯质粒提取试剂盒抽提质粒(5415 型台式高速离心机)①3000rpm室温下离心菌液15min，去上清；②加入250 )dL含RNase A的Resuspension Buffer,重悬细菌；③加入250 Lysis Buffer, 轻轻混匀，室温下放置5min;④加入350jaL Precipitation Buffer,立即振荡混 匀；⑤以11400rpm离心10min后，将上清液转移至Mini column中，11400rpm 离心l min， 去废液；⑥力卩入700 jjL Wash Buffer, 11400 rpm离心l min， 去废 液；⑦再以11400 rpm离心1 min后，将Mini column放入一新的1.5mL离心管中， 加入75 nL预热65。C的TE Buffer,室温下放置3 min， 11400 rpm离心2 min，所 收集的溶液即为富含质粒溶液；H、 提取质粒DNA后用XhoI和EcoRl双酶切鉴定，同时在pIRES载体的 IRES区设计一下游引物IRES-R (5'-TATAGACAAACGCACACCGG-3，)，结 合pIRES载体上游的T7公共引物(5'-TACGACTCACTATAGGCTAG-3，)进行 PCR鉴定，PCR反应体积为25 pL，包括0.1mmol/LdNTP、 1.5UTaq聚合酶、 10XPCR缓冲液、1.5mmol/LMgCl2和超纯水，引物浓度均为0.4nmol/L，以l : 500稀释的质粒DNA1 nL作为模板。PCR扩增条件为94。C 3 min， (94°C 30 s， 60°C lmin， 72°C 2 min， 35个循环)，72°C 5 min;酶切产物及PCR扩增产 物用1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。筛选出阳性克隆，再对其进行双向测序鉴 定，证实为本发明特异基因序列后扩增阳性克隆并提取质粒，从而获得特异性 CTL相关的TCRVa6-pIRES质粒。用紫外分光光度计测定重组质粒的浓度。2、脂质体介导的重组质粒TCR Voi6-pIRES转染(1)脂质体Lipofectamine TM2000转染A549细胞株、Molt4细胞株 转染A549细胞株①将处于对数生长期的A549细胞株以4X1()s个细胞 /孔的密度，加入2 mL无血清无抗生素的IMDM培养基，接种6孔培养板； ②取TCR Va6-pIRES重组质粒(4 pg)置于1.5 mL离心管中，加入无血清 无抗生素的IMDM培养基至250 jaL，轻轻混匀；③取15 脂质体 Lipofectamine TM 2000置于1.5 mL离心管中，加入无血清无抗生素的IMDM 培养基至250 pL，轻轻混匀后室温下孵育5 min; 将②和③混匀后，室温 下孵育20 min;⑤将④加入①的A549细胞培养基中(转染平行2孔)，另设i孔转染plRES空载体作为阴性对照，具体操作方法同转染重组质粒；置于37。C、 5。/。C02培养箱中培养24h后全量换液为完全培养基，培养72h后加 G418进行筛选(终浓度600 |ig/mL)，每4天换一次培养基，同时加入相同 浓度的G418，在此筛选条件下培养20 d可得到稳定表达细胞系。转染Molt4细胞株将处于对数生长期的Molt4细胞株以2X 106个细胞/ 孔的密度接种6孔板，取4 pg TCR Va&pIRES重组质粒和脂质体Lipofectamine TM2000混合后转染Molt4细胞株，方法同转染A549细胞株。3、重组质粒转染后TCR Va6基因表达的鉴定(1) RT-PCR和实时定量PCR检测TCR Va6 mRNA的表达 转染7天后，各孔收集3乂106细胞(A549细胞株需胰酶消化)，用TRIZol试剂盒和SurperScriptII逆转录试剂盒分别提取总RNA、合成cDNA，经PCR扩 增管家基因(32M检测cDNA的合成质量(同第一部分，步骤7);用相应的TCR Va6引物以及相应的Ca引物进行PCR扩增，转染空载体组作为阴性对照，PCR 扩增体系和扩增条件同前所述。(2) 间接免疫荧光法和流式细胞仪检测重组质粒的表达 转染10天后，收集1X10嘲胞(A549细胞株需胰酶消化)，用0.1mol/L的PBS洗涤细胞两次后，标记大鼠抗人TCRVa单抗(一抗，1 : 100稀释)， 3TC孵育lh; PBS洗涤细胞三次后，标记FITC-兔抗大鼠IgG抗体(二抗，1: 50稀释)，37i:孵育lh; PBS洗涤细胞三次后，在荧光显微镜下观察重组质粒 在转染后细胞株中的表达情况；或直接用FITC-大鼠抗人TCRVa6单抗标记， 37t:孵育30 min， PBS洗涤细胞一次后用流式细胞仪进行流式检测重组质粒的 表达。(3 )点印记杂交和Western Blot检测TCR Va6蛋白的表达 转染20天后，收集2Xl(f稳定表达重组质粒的细胞，用RjpA蛋白提取试 剂盒提取总蛋白，真空冷冻干燥浓縮后考马斯亮兰法定量；同样提取脐血细胞 (TCR Va6亚家族表达均阳性)的蛋白作为阳性对照，转染空载体的细胞的 蛋白为阴性对照。 1)点印记杂交A、 取NC膜2cmX4cm，划分小格，用微量加样枪分别点膜，重组质粒组、 阳性对照组、阴性对照组的蛋白样品分别点3次，每次l ^L;进行2个平行反应；B、 用blockingReagent封膜4h后用washbuffer洗涤2次，每次5min;C、 加入l : 500的大鼠抗人TCRVa6单抗(用blocking Reagent稀释)，4 "C孵育过夜后用washbuffer洗涤2次，每次5 min;D、 加入l : 500的HRP-兔抗大鼠IgG抗体(用blockingReagent稀释)室温 孵育2h,用washbuffer洗涤3次，每次5 min;E、 将NC膜浸入DAB底物液(避光)显色。 2) Western BlotA、 SDS-PAGE电泳将转染重组质粒组的浓縮蛋白样品、阳性对照和阴 性对照分别加样于15。/。SDS-PAGE胶(每孔上样约100吗)，以PageRuler Prestained Protein Ladder为预染marker，进行3个平行反应；用恒压60 V电泳30 min后，改恒压100Vlh;B、 分离其中1个平行反应的SDS-PAGE胶，用考马斯亮兰染色后，用冰乙 酸甲醇洗脱液反复漂洗直至有清晰条带显出；C、 转膜PVDF膜预先用甲醇浸泡lmin，再浸泡到转膜液中备用；切好 的滤纸和海绵也浸泡到转膜液中IO min;将切下的另2个平行反应的SDS-PAGE 胶与相应的PVDF膜放入转膜液中浸泡片刻；将海绵_滤纸一PVDF膜_ SDS-PAGE胶一滤纸一海绵依次放到阳极板上，胶大小=膜>滤纸；用4。C预冷 的转膜液，恒压40V， 90min (湿转);D、 封膜用blockingReagent封膜4h后用washbuffer洗漆2次，每次5 min;E、 检测人P-actin蛋白(内参照)的表达将其中1个平行反应的PVDF膜 加入l : 800的小鼠抗人p-actin单抗(用blocking Reagent稀释)，4'C孵育过夜 后用washbuffer洗涤2次，每次5min;加入l : 1000的HRP-羊抗小鼠IgG抗体(用 blocking Reagent稀释)室温孵育2 h，用wash buffer洗涤3次，每次5 min;F、 检测目的蛋白TCRVa6的表达:将另l个平行反应的PVDF膜加入l : 800 的大鼠抗人TCRVa6单抗(用blockingReagent稀释)，4。C孵育过夜后用wash buffer洗涤2次，每次5 min;加入l : 1000的HRP-兔抗大鼠IgG抗体(用blocking Reagent稀释)室温孵育2h，用wash buffer洗涤3次，每次5 min;G、 化学发光法显影在暗室中将PVDF膜转入LumiGLO Working Reagent 中，室温孵育3min;用镊子将PVDF膜取出，沥去多余的试剂；将PVDF膜放 入塑料薄膜中，要保证PVDF膜与塑料薄膜之间没有气泡；将含有PVDF膜的 塑料薄膜放入X线曝光暗盒中，压上X线胶片(曝光30s)，常规显影、定影后 得到显影的X线胶片。4、重组质粒TCRVa6-pIRES转染正常人T细胞，构建特异性CTL(1) 重组质粒TCRVa6-pIRES转染正常人T细胞 将处于对数生长期的正常人T细胞以2Xl(^个细胞/孔的密度接种6孔板，取4 pg TCR Va6-pIRES重组质粒和脂质体Lipofectamine TM2000混合后转染 正常人T细胞，操作方法同前所述，培养扩增后得到表达抗原特异性CTL相 关TCRVa6基因的T细胞，并检测验证重组质粒的表达(方法同前)。(2) 细胞毒活性实验以乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)检测试剂盒分别在转染后 第1周、第3周进行细胞毒性试验，操作按说明进行。分别以转染重组质粒的 正常T细胞、转染空载体的正常T细胞为效应细胞，以DLBL细胞株、Raji 细胞、Molt4细胞(阴性对照)为耙细胞，另设未转染质粒的正常T细胞为空 白组。效靶比为10 : 1，靶细胞浓度1乂104个细胞/孔，每组3个复孔；置U 型96孔培养板内，稍离心2500 rpm 30 s，以促进效、靶细胞之间接触，于37 °C、 5。/。C02饱和湿度培养箱中孵育4 h;用1000 rpm离心5 min，吸取上清100 加入平底酶标板中，加入100 nL LDH底物反应液，室温下避光作用30 min， 每孔加50 (iL 1 mol/L盐酸终止酶促反应；felx-800酶标仪测定光密(optical density, OD)值，测定波长490nm，参考波长670 nm。CTL细胞毒活性计算公式CTL活性(％) 二(实验组OD值一效应细胞自然释放组OD值一靶细胞自然 释放组OD值)/ (最大释放组OD值—靶细胞自然释放组OD值)上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实 施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、 替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。SEQUENCE LISTING<110>广州医学院第一附属医院 暨南大学<120>弥漫性大B细胞淋巴瘤相关抗原特异TCR V a 6亚家族的MS基因序列及应用 <130> 45 <160> 2<170> Patentln version 3.2<210> 1<211> 330<212> DNA<213> Artificial sequence<220><223>弥漫性大B细胞淋巴瘤相关抗原特异TCR V a 6亚家族的MS基因序列 <400> 1tccgccaacc ttgtcatctc cgcttcacaa ctgggggact cagcaatgta tttctgtgca 60 atgagtccca tgaacacagg ctttcagaaa cttgtatttg gaactggcac ccgacttctg 120 gtcagtccaa atatccagaa ccctgaccct gccgtgtacc agctgagaga ctctaaatcc 180 agtgacaagt ctgtctgcct attcaccgat tttgattctc aaacaaatgt gtcacaaagt 240 aaggattctg atgtgtatat cacagacaaa actgtgctag acatgaggtc tatggacttc 300 aagagcaaca gtgctgtggc ctggagcaac 330<210> 2<211> 110<212> PRT<213> Artificial sequence <220><223>弥漫性大B细胞淋巴瘤相关抗原特异TCR V a 6亚家族的MS基因序列翻译的蛋白质<400> 2Ser Ala Asn Leu Val lie Ser Ala Ser Gin Leu Gly Asp Ser Ala Met 15 10 15Tyr Phe Cys Ala Met Ser Pro Met Asn Thr Gly Phe Gin Lys Leu Val20 25 30Phe Gly Thr Gly Thr Arg Leu Leu Val Ser Pro Asn lie Gin Asn Pro35 40 45Asp Pro Ala Val Tyr Gin Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser 50 55 60Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gin Thr Asn Val Ser Gin Ser65 70 75 80Lys Asp Ser Asp Val Tyr lie Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg 85 90 95Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Tip Ser Asn 100 105 110
权利要求
1、一种弥漫性大B细胞淋巴瘤相关抗原特异TCR Vα6亚家族的MS基因序列，其特征在于所述MS基因序列如下TCCGCCAACCTTGTCATCTCCGCTTCACAACTGGGGGACTCAGCAATGTATTTCTGTGCAATGAGTCCCATGAACACAGGCTTTCAGAAACTTGTATTTGGAACTGGCACCCGACTTCTGGTCAGTCCAAATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCTGTGGCCT GGAGCAAC。
全文摘要
本发明公开了一个针对弥漫性大B细胞淋巴瘤相关抗原的特异性T细胞受体的核苷酸序列。通过RT-PCR基因扫描分析DLBL患者外周血中TCR Vα6亚家族呈明显单克隆，其PCR产物进行序列分析了特异性TCR序列的V-N-J区，即互补决定区3，是和抗原特异性识别结合的部位；表明该克隆性T细胞的TCR为DLBL相关抗原刺激所产生的特异性TCR。它是通过TCR转基因技术进行DLBL分子靶向的过继性免疫治疗的基础和关键。该特异性TCR的核苷酸序列为进一步开展针对淋巴瘤的特异性细胞免疫治疗提供重要作用。
文档编号C12N15/12GK101225390SQ20081002643
公开日2008年7月23日 申请日期2008年2月22日 优先权日2008年2月22日
发明者叶静梅, 尹青松, 李扬秋, 杨力建, 获 谭, 陈少华 申请人:广州医学院第一附属医院;暨南大学