专利名称：人白细胞介素7在真核宿主中表达的方法
技术领域：
本发明涉及应用重組DNA技术产生基因工程蛋白药物技术，具体来说涉及 到一种人白细胞介素7 (rhlL-7)在真核宿主中表达的方法。
背景技术：
人白细胞介素7 (human interleukin 7， rhlL-7)是细胞因子白介素蛋白家族中 一个重要的成员，该家族蛋白对调节淋巴细胞发育和存活有重要意义。它首次 被发现是在1988年，A.E. Namen等人在研究小鼠B细胞发育时分离出该细胞 因子，它具有刺激小鼠前B细增殖的功能。随后一些科学研究发现，注射IL-7 的小鼠体内，T细胞和B细胞的数量都大大增加，并且在IL-7及其受体敲除的 小鼠中表现出淋巴系统发育不正常，因此IL-7在淋巴系统发育过程中其非常重 要的作用。
重组人白细胞介素7是一条羊链、含有152个氨基酸的多肽，分子量为 17.4kDa.其N端含有 一段信号肽。虽然白介素7的晶体结构仍然没有解析出来， 但是根据它与其他蛋白家族成员序列同源性，用计算机模拟出的模型预测出它 与其他细胞因子相似的亲水表面和高等电点。
白介素7的受体结构与其他白介素家族蛋白非常相似，但是白介素7在胸 腺和自然T细胞中的功能却是非常特殊的。它通过一 系列的细胞信号转导途径， 例如JAK-STAT， PI3K，以及Src激酶信号通路，参与调节免疫代谢平衡和稳定。 最近，IL-7被证实在维持T细胞的能量代谢中起关键作用。它通过激活STAT5 和Akt激酶促进Glutl转运，从而促进葡萄糖的摄取。由于白介素7的多种功能， 它具有很好的临床应用价值。目前白介素7已经被用来治疗多种疾病，包括免 疫缺陷性疾患和恶性肿瘤，以及在骨髓和器官移植和肺瘤免疫学中都有广泛的 应用。
随着对IL-7作用机制以及临床应用的研究，IL-7的需求量大大增加。目前 市场上主要生产白介素的方法都是在原核宿主大肠軒菌里表达蛋白，但是一方 面大肠杆菌表达体系非常容易形成不正确折叠的蛋白容易形成包涵体，从而减 少蛋白的表达量和生物学的活性；另一方面，原核宿主表达可能存在毒性，因此每次表达产物都要经过毒性实验检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种人白细胞介素7在真核宿主表达的方法，根据该方 法可获得稳定、高效表达的人白细胞介素7，并保证得到的rhlL-7具有正确的空 间结构和生物学活性。
解决上迷目的的技术方案如下 人白细胞介素7在真核宿主中表达的方法， 真核宿主为毕赤酵母X-33，主要包 括以下步骤
(1) 克隆人IL-7基因以人骨髓基质细胞提取总mRNA为模板，先用RT-PCR扩 增出总cDNA，再以该cDNA为模板，用IL-7特异引物扩增出完整rhlL-7基因片 段，所用IL-7特异引物中引入Xho I酶切位点和在末端Xbal酶切位点；回 收PCR产物连接到质粒pMD20-T载体，得质粒rhlL-7/pMD20-T，经过测序确 认为正确表达序列；
(2) 构建真核表达载体将表达栽体pPICZaB和质粒rhlL-7/pMD20-T经过Xhol 和XbaI双酶后純化回收，并用T4 DNA连接酶于15—17。C连接15 — 17小时， 得重组载体pPICZaB-IL7;
(3) 转化重組载体到真核酵母宿主中重組载体pPICZaB-IL7用Sacl单酶切线性 化后，用氯化锂转化方法转化入毕赤酵母X-33宿主菌林中；经过抗性筛选得到 阳性克隆；
(4) 酵母宿主中表达rlL-7蛋白挑取含有阳性克隆的毕赤酵母X-33宿主菌林， 用BMGY培养基培养至光密度值〉2.0,离心收集细胞沉淀，用1LBMMY培养 基重悬细胞并加入0.5%甲醇诱导，温度在26 — 28。C继续培养4天，每24小时 补充甲醇使其中浓度保持0.5%,大量发酵表达IL-7蛋白，表达出的蛋白分泌在 蜂养基中。
优选地，所述IL-7特异引物为 5'GGCTCGAGATGTTCCATGTTTCTTTT 3' 3，AGTCTAGATCAGTGTTCTTTAGTGCC 5，。
用本发明所迷的表达方法分泌表达的人活性IL-7具有良好的优势 一方面，它能够防止宿主菌对表达产物的降解、减轻宿主细胞代谢的负荷以及表达
产物对宿主的毒性作用二是能够促进分泌蛋白按适当的方式折叠、恢复其天 然构想和活性；三是毕赤酵母在表达重組蛋白的同时进行适度的糖基化修饰上， 且不会引起超抗原反应，提高使用安全性，也有利于糖基化蛋白的生物活性。 利用酵母载体上的分泌性的a-因子以及IL-7自身的信号肽引导目的基因分泌表 达。用目的蛋白将会大量分泌到培养液中，能够形成准确的空间结构，从而保 持了IL-7的天然活性；由于不受宿主菌体细胞内蛋白的影响，减少了纯化工艺， 提高了回收率；同时酵母细胞结构简单、生长迅速、易于培养和发酵、生产成 本低、目的蛋白产量高。
本发明改变传统的用原核宿主大肠杆菌表达IL-7，探索出用真核宿主毕赤 酵母来表达IL-7的方法，既保证了 IL-7生物学活性，又获得大量稳定的蛋白。
图1是真核表达载体rhlL-7/pPICZaB构建示意图2是毕赤酵母表达出的rhlL-7各个时段SDS-PAGE电泳分析示意图3是毕赤酵母表达出的rhlL-7各个时段Western检测结果示意图4是用阳离子亲和层析方法(SP-Sepharose)纯化目的蛋白结果图示意图5是小鼠前B细胞增殖方法rhlL-7生物学活性检测结果图示意图。
具体实施例方式
本发明选用的X-33毕赤酵母林，整合性表达质粒pPICZaB.载体均购自美国 Invritrogen公司。 1.克隆rhlL-7全基因
设计一对引物，以人骨髓基质细胞mRNA逆转录所得cDNA为模板进行PCR 扩增，条件为94。C 5min, 94°C 45s, 58°C 45s, 72°C 1 min， 30个循环:72°C 10 min。 所获得的扩增片断连接到高效克隆载体pMD20-T(购自于广州TaKaRa公司)，用 PCR、酶切和核酸序列测定鉴定，测定序列与Genebank公布的IL-7序列一致。 引物序列为
5 ，GGCTCGAGATGTTCCATGTTTCTTTT 加入了 Xho I酶切位点 3，AGTCTAGATCAGTGTTCTTTAGTGCC 加入了 Xba I酶切位点2.构建毕赤酵母分泌型表达栽体rhIL-7/pPICZaB
1) 用Xho I和Xba I双酶切重組质粒rhlL-7/Pmd20-T，获得目的片断rhlL-7,反 应体系如下，所用内切酶和緩冲液均购自大连TaKaRa公司，
质粒rhlL-7/Pmd20-T 15 |il
10 *H buffer 5|xl XhoI 5U XbaI 5U 无菌水 Upto50nl
2) 用Xho I和Xba I双酶切表达栽体pPICZaB，获得载体片断，反应体系如下， 所用内切酶和緩冲液均购自大连TaKaRa公司，
pPICZaB载体 15 pi
10先H buffer 5 pi
XhoI 5U
Xba I 5U 无菌水 Upto50jxl
3) 由1)和2)步所后得目的片断和载体片断，DNA凝胶回收试剂盒回收，该 试剂盒购自于大连TaKaRa公司，具体操作按试剂盒说明书进行。构建示意图见 图U
4) 回收得到的目的片断和载体用T4DNA连接酶(购自美国Invitrogen公司) 进行连接反应，目的基因准确的插入到含有a-因子的分泌型载体读码框内.反应 体系如下
目的片段 3(il
载体片断 lul
10 * ligase buffer
T4 ligase 0.5^1
无菌水 4.5ul
总体积
5)转化重組质粒到毕赤酵母X-33中用Sac I单酶切重组载体rhIL-7/pPICZaB 进行线性化，按照Invitrogen公司操作手册用氯化锂转化的方法将重組栽体转化到宿主菌X-33中。转化后用含有100 pg/ml Zeocin抗生素的YPD ( yeast extract peptone dextrose)平板进行篩选阳性克隆。
3.重组表达载体rhIL-7/pPICZaB在宿主菌毕赤酵母X-33中的表达
挑取含有阳性克隆的宿主菌用25ml BMGY培养基培养至光密度值> 2.0， 2500g离心15分钟收集细胞沉淀，用lLBMMY培养基重悬细胞并加入0.5Q/o甲 醇诱导，温度在28。C继续培养4天，每24小时补充甲醇使其中浓度保持0.5%。 每隔12小时取样检测，SDS-PAGE电泳结果见图2,在17kD处有目的蛋白表 达。Western检测结果见图3 。培养基配方如下
1. BMGY
蛋白胨 2%
酵母提取物 1%
酵母含氮碱基 1.34%
生物素 4xl(T5%
葡萄糖 2% 磷酸钾溶液PH6.0 lOOMm
甘油 1%
2. BMMY
蛋白胨 2%
酵母提取物 1%
酵母含氮碱基 1.34%
生物素 4xl0'5%
葡萄糖 2% 磷酸钾溶液PH6.0 lOOMm
甲醇 0.5 %
4. 纯化rhlL-7蛋白第4步发酵液5000g离心15分钟，收集上清，上清用20mM PBS浓缩后过阳离子亲和层析柱(SP-Sepharose),用0.2MNaCl和1M PBS洗 脱目的蛋白。纯化结果图见图4。
5. 纯化所得rhlL-7蛋白生物活性检测96孔细胞培养板中每孔加入2xl05个2E8 细胞(小鼠前B细胞品系，购自于美国ATCC公司)，不同浓度的rhlL-7蛋白
(lpg/ml到100ng/ml)分别加入8个孔，每个浓度3个平行孔。细胞在IMDM培养基(购于美国GIbco公司)48小时培养后每个孔加入10|ilMTT，继续培养 4小时，之后细胞离心去上清并加入DMSO，震荡10分钟，在多孔板酶标仪上 测定570nrn光吸收值，根据数据作图。IL-7蛋白功能活性检测结果见图5 ， 10pg/ml 蛋白就具备了使前B细胞增殖的能力，与天然rML-7生物活性相似，因而具备 很高生物活性。
权利要求
1、人白细胞介素7在真核宿主中表达的方法，其特征在于真核宿主为毕赤酵母X-33，主要包括以下步骤(1)克隆人IL-7基因以人骨髓基质细胞提取总mRNA为模板，先用RT-PCR扩增出总cDNA，再以该cDNA为模板，用IL-7特异引物扩增出完整rhIL-7基因片段，所用IL-7特异引物中引入XhoI酶切位点和在末端XbaI酶切位点；回收PCR产物连接到质粒pMD20-T载体，得质粒rhIL-7/pMD20-T，经过测序确认为正确表达序列；(2)构建真核表达载体将表达载体pPICZαB和质粒rhIL-7/pMD20-T经过XhoI和XbaI双酶后纯化回收，并用T4DNA连接酶于15-17℃连接15-17小时，得重组载体pPICZαB-IL7；(3)转化重组载体到真核酵母宿主中重组载体pPICZαB-IL7用SacI单酶切线性化后，用氯化锂转化方法转化入毕赤酵母X-33宿主菌株中；经过抗性筛选得到阳性克隆；(4)酵母宿主中表达rIL-7蛋白挑取含有阳性克隆的毕赤酵母X-33宿主菌株，用BMGY培养基培养至光密度值＞2.0，离心收集细胞沉淀，用1L BMMY培养基重悬细胞并加入0.5％甲醇诱导，温度在26-28℃继续培养4天，每24小时补充甲醇使其中浓度保持0.5％，大量发酵表达IL-7蛋白，表达出的蛋白分泌在培养基中。
2、 根据权利l所述的方法，其特征在于所迷IL-7特异引物为 5'GGCTCGAGATGTTCCATGTTTCTTTT 3， 3，AGTCTAGATCAGTGTTCTTTAGTGCC 5，。
全文摘要
本发明公开了一种人白细胞介素7在真核宿主中表达的方法，真核宿主为毕赤酵母X-33，主要包括以下步骤(1)克隆人IL-7基因；(2)构建真核表达载体；(3)转化重组载体到真核酵母宿主中；(4)酵母宿主中表达rIL-7蛋白。本发明改变传统的用原核宿主大肠杆菌表达IL-7，探索出用真核宿主毕赤酵母来表达IL-7的方法，既保证了IL-7生物学活性，又获得大量稳定的蛋白。
文档编号C12N15/81GK101302517SQ20081002627
公开日2008年11月12日 申请日期2008年2月3日 优先权日2008年2月3日
发明者吴东海, 李侍武, 勇 罗, 许爱民, 金守光 申请人:中国科学院广州生物医药与健康研究院;中国科学技术大学