一种提高米曲霉l-苹果酸合成过程中碳源利用率的方法
【专利摘要】本发明公开了一种提高米曲霉L?苹果酸合成过程中碳源利用率的方法，属于遗传工程领域。本发明以Aspergillus oryzae NRRL 3488作为出发菌株，首先通过过表达米曲霉细胞质内丙酮酸羧化酶和苹果酸脱氢酶，强化了从草酰乙酸合成苹果酸的代谢流，L?苹果酸的摇瓶产量提高至50.5±1.06g/L，提高了38.4％。再在转化子Aspergillus oryzae p16中通过表达了大肠杆菌的丙酮酸羧化酶和丙酮酸羧化激酶，加强了米曲霉胞质内磷酸烯醇式丙酮酸到草酰乙酸的合成效率，最终L?苹果酸的产量达到了63.2±1.32g/L，琥珀酸浓度为8.88±0.45g/L，生产强度也由初始Aspergillus oryzae NRRL 3488的0.24g/(L·h)提高至0.7g/(L·h)，为进一步代谢工程改造米曲霉生产L?苹果酸奠定了基础。
【专利说明】
一种提高米曲霉L-苹果酸合成过程中碳源利用率的方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种提高米曲霉L-苹果酸合成过程中碳源利用率的方法，属于遗传工 程领域。
【背景技术】
[0002]苹果酸作为一种重要的四碳二羧酸主要用作食品、饮料中的酸味剂，金属物的清 洗剂，以及农业、化妆品和医药等领域。2004年，美国能源部将苹果酸和富马酸、琥珀酸这三 种四碳二羧酸均作为可通过微生物利用可再生原料发酵大规模生产的12种平台化合物之 〇
[0003] 米曲霉作为"generally regarded as safe"（GRAS)安全菌株，早在1000多年前已 被应用于食品、饲料、产酸、酿酒等发酵工业，是理想的真核表达载体。黄曲霉是最初的苹果 酸生产菌株，但由于其产生黄曲霉毒素而不能用于大规模生产，尤其是不能应用于食品行 业。米曲霉与黄曲霉的基因组有较高的同源性，且不产霉菌毒素，故可作为潜在的苹果酸的 生产菌株。
[0004] 米曲霉内有四条苹果酸的合成途径，分别为位于细胞质内的还原TCA途径和位于 线粒体内的TCA途径、乙醛酸环形途径和非环形乙醛酸循环途径。其中还原TCA途径的转化 率最高，理论转化率为2mol苹果酸/mol葡萄糖。在米曲霉还原TCA途径中，丙酮酸羧化酶PYC 催化丙酮酸生成草酰乙酸，此过程可固定一分子C02,草酰乙酸再经苹果酸脱氢酶MDH催化 生成苹果酸。在细菌的还原TCA途径中，磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶PCK和磷酸烯醇式丙酮 酸羧化酶PPC均可以催化磷酸烯醇式丙酮酸生成草酰乙酸，该过程两个酶分别可以固定一 分子C〇2，而在米曲霉内只有PCK而没有PPC。
[0005] 目前关于米曲霉代谢改造的报道相对较少。2013年，有研究者通过在米曲霉内过 表达苹果酸转运蛋白、苹果酸脱氢酶和丙酮酸羧化酶三个编码基因，提高了苹果酸的产量。
[0006] 提高苹果酸合成过程中的碳源利用率将有利于降低生产成本。因此，有必要开发 新的方法以提高苹果酸产量和碳源利用率。
【发明内容】
[0007] 为了解决上述问题，本发明首先在野生型Aspergillus oryzae NRRL 3488中过表 达了来源于其自身的苹果酸脱氢酶(mdh)和丙酮酸羧化酶(pyc)两个基因，强化了丙酮酸向 苹果酸合成的代谢，初步提高了苹果酸的产量。在此基础上，异源表达了来源于大肠杆菌的 磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶(pck)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(ppc)基因，提高了磷酸烯醇 式丙酮酸到草酰乙酸的转化率，使更多的碳源流向L-苹果酸的合成，提高了苹果酸合成过 程中的碳源利用率。
[0008] 本发明的第一个目的是提供一种能够提高米曲霉合成L-苹果酸的过程中葡萄糖 转化率的的方法。
[0009] 在本发明的一种实施方式中，所述方法，是在初始米曲霉菌株中过表达米曲霉来 源的苹果酸脱氢酶mdh和丙酮酸羧化酶pyc，并同时表达来源于大肠杆菌的磷酸烯醇式丙酮 酸羧化激酶pck和/或磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ppc基因。
[0010]在本发明的一种实施方式中，所述苹果酸脱氢酶mdh的基因序列如NCBI上Gene ID: 5994966所示，丙酮酸羧化酶pyc的基因序列如NCBI上Gene ID: 5993308所示。
[0011]在本发明的一种实施方式中，所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶pck编码基因如 NCBI上Gene ID:945667所示，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ppc编码基因如NCBI上Gene ID: 948457所示。
[0012] 在本发明的一种实施方式中，所述初始米曲霉菌株，是Aspergillus oryzae NRRL 3488〇
[0013] 在本发明的一种实施方式中，所述过表达米曲霉来源的苹果酸脱氢酶mdh和丙酮 酸羧化酶pyc，或者表达来源于大肠杆菌的磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶pck和/或磷酸烯醇 式丙酮酸羧化酶ppc基因，是整合到米曲霉基因组上进行表达。
[0014] 在本发明的一种实施方式中，所述过表达米曲霉来源的苹果酸脱氢酶mdh和丙酮 酸羧化酶pyc，或者表达来源于大肠杆菌的磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶pck和/或磷酸烯醇 式丙酮酸羧化酶ppc基因，是将目标基因连接到载体上得到含有目标基因的重组质粒，从重 组质粒中得到含有目的基因的线性DNA片段，然后经原生质体转化法将目标基因重组进米 曲霉。
[0015] 在本发明的一种实施方式中，所述过表达目标基因 mdh和pyc时使用的载体，为自 行构建的带有氨节和苯菌灵抗性的pBg32质粒。该质粒是在pMD19-T Vector的基础上，通过 添加米曲霉磷酸甘油酸激酶启动子(Ppgk)、葡萄糖淀粉酶终止子(Tgla)和构巢曲霉的苯菌 灵抗性基因（benA)构建而成。
[0016] 在本发明的一种实施方式中，所述表达目标基因 pck和ppc时使用的载体，为自行 构建的带有氨苄和潮霉素抗性的pHgll质粒。该质粒是在pMD19-TVect〇r的基础上，通过添 加米曲霉磷酸甘油酸激酶启动子(Ppgk)、葡萄糖淀粉酶终止子(Tgla)和潮霉素抗性基因 (hyg)构建而成。
[0017] 在本发明的一种实施方式中，所述原生质体转化法，其中原生质体制备方法参见 ^it^Brown , S . H. , Bashkirova , L . ,Berka,R. ,Chandler,T. ,Doty,T. ,McCall,K., McCulloch,M.,McFarland,S.jThompsonjS.,Yaver,D.,Berry,A.,2013.Metabolic engineering ofAspergillus oryzae NRRL 3488for increased production ofL-malic acid.Applied microbiology and biotechnology.97,8903_12;原生质体转化方法参见文 南犬Blumhoff，Μ·，Steiger，M.G.，Marx，H.，Mattanovich，D.，Sauer，M.，2013.Six novel constitutive promoters for metabolic engineering of Aspergillus niger.Applied microbiology andbiotechnology.97,259-67〇
[0018] 本发明的第二个目的是提供一种米曲霉重组菌，所述重组菌以米曲霉为宿主，过 表达米曲霉来源的苹果酸脱氢酶mdh和丙酮酸羧化酶pyc，并同时表达来源于大肠杆菌的磷 酸烯醇式丙酮酸羧化激酶pck和/或磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ppc基因。
[0019] 在本发明的一种实施方式中，宿主为Aspergillus oryzae NRRL 3488。
[0020]在本发明的一种实施方式中，所述苹果酸脱氢酶mdh的基因序列如NCBI上Gene ID:5994966所示，丙酮酸羧化酶pyc的基因序列如NCBI上Gene ID:5993308所示。
[0021] 在本发明的一种实施方式中，所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶pck编码基因如 NCBI上Gene ID:945667所示，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ppc编码基因如NCBI上Gene ID: 948457所示。
[0022] 在本发明的一种实施方式中，所述过表达或者表达，是整合到米曲霉基因组上进 行表达。
[0023] 在本发明的一种实施方式中，所述过表达或者表达，是将目标基因连接到载体上 得到含有目标基因的重组质粒，从重组质粒中得到含有目的基因的线性DNA片段，然后经原 生质体转化法将目标基因重组进米曲霉。
[0024]本发明的第三个目的是提供一种生产L-苹果酸的方法，所述方法是以本发明的米 曲霉重组菌为生产菌株进行发酵生产。
[0025] 在本发明的一种实施方式中，所述发酵生产，是制备米曲霉重组菌孢子浓度为IX 106个/mL至9X10 6个/mL的孢子悬浮液，然后28~32°C振荡培养12~16h，然后转接至发酵培 养基，于28~32°C振荡培养发酵90~106h。
[0026] 在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基（g/L):葡萄糖110,胰蛋白胨12， K2HPO4 0.15，KH2P〇4 0.15，MgS04*7H20 0.1，CaCl2*H20 0.1，lmL微营养液（5g NaCl、5g FeS〇4 · 7H20、lg柠檬酸），CaC0390。
[0027] 本发明还要求保护所述米曲霉重组菌在食品、农业、化妆品或者医药等领域的应 用。
[0028]本发明的有益效果：
[0029] (1)不同来源的磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶PCK和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PPC目 前已被报道作为固碳基因通过代谢工程用于琥珀酸等生产，但尚未有人将其用于米曲霉的 代谢改造或苹果酸的生产。本发明通过在米曲霉内异源表达这两个基因，使更多的碳源流 向苹果酸的生产，提高糖酸的转化率，从而降低工业化生产成本。
[0030] (2)本发明提供的米曲霉重组菌Aspergillus oryzae pp25经过90h摇瓶发酵L-苹 果酸的产量达到63.2 ± 1.32g/L，琥珀酸浓度为8.88 ± 0.45g/L，为进一步代谢工程改造米 曲霉生产苹果酸奠定了良好的基础。本发明提供的丝状真菌代谢改造的方法简单，便于使 用，具有很好地应用前景。
【具体实施方式】
[0031] 米曲霉种子培养及发酵：
[0032] (1)种子培养基（g/L):葡萄糖30,胰蛋白胨3，KH2P〇4 0.75，K2HP〇4 0.75，NaH2P〇4 0.56，K2HP〇4 0.56，MgS04,7H20 0.075，CaCl2，H20 0.075,0.75mL微营养液（5gNaCl、 5gFeS〇4 · 7H20、lg柠檬酸）。
[0033] (2)发酵培养基（g/L):葡萄糖 110,胰蛋白胨 12，K2HP〇4 0·15，ΚΗ2Ρ〇4 0.15， MgS04.7H20 0.1，CaCl2.H20 0.1，lmL微营养液（5g NaCl、5g FeS〇4.7H20、lg柠檬酸）， CaC03 90〇
[0034] (3)培养条件：
[0035] 米曲霉平板产孢条件为34°C恒温培养3-7天。米曲霉摇瓶种子培养基孢子终浓度 为1.5 X 106个/mL，30°C、200rpm培养14h，以10 %的接种量转接发酵培养基，30°C、200rpm发 酵 106h。
[0036]苹果酸的测定方法：
[0037]高效液相色谱(HPLC)检测法:Agilent 1200，UV 检测器，C18 柱（250X4.6mm，5ym)， 流动相：10%甲醇和0.75mmol稀磷酸。流速0.7mL/min，柱温20°C，波长210nm，进样体积为10 yL〇
[0038] 样品制备：向已知体积的发酵液中加入相同体积的2M HC1以溶解生成的苹果酸钙 沉淀和残留的CaC03。离心后再稀释5倍，经0.22μπι滤膜过滤后，滤液用于液相检测。
[0039] 实施例1米曲霉原生质体转化和转化子的筛选
[0040] 米曲霉原生质体制备和转化方法如下：
[00411原生质体制备方法参见文献Brown，S.
[0042] H., Bashkirova,L.,Berka,R.,Chandler,T.,Doty,T.,McCall,K.,McCulloch,M., McFarland,S.,Thompson,S.,Yaver,D.,Berry,A.,2013.Metabolic engineering ofAspergillus oryzae NRRL3488for increased production of L-malic acid.Applied microbiology and biotechnology.97,8903-12。
[0043] 原生质体转化方法参见文献Blumhoff,M. ,Steiger,M.G. ,Marx,H. ,Mattanovich, D.,Sauer,M.,2013.Six novel constitutive promoters for metabolic engineering ofAspergillus niger.Applied microbiology andbiotechnology·97,259-67。
[0044] 筛选到的阳性转化子通过抗性平板数次传代得到纯合的米曲霉重组菌株。
[0045] 实施例2过表达苹果酸脱氢酶mdh和丙酮酸羧化酶pyc
[0046] 根据NCBI上公布的米曲霉mdh和pyc基因的上下游序列，设计引物，构建苹果酸脱 氢酶MDH和丙酮酸羧化酶PYC表达载体。
[0047] 表1扩增mdh和pyc基因的引物
[0049]以米曲霉基因组为模板，通过PCR扩增相关基因。米曲霉的基因组的提取方法为天 根植物基因组提取试剂盒法。扩增所得目的基因和上述载体质粒pBg32均使用快切酶Nsi I 和Κρη I双酶切，目的基因与载体连接所得mdh基因的表达质粒pMBg33和pyc基因的表达质 粒pPBg28。再使用快切酶Asc I、Not I双酶切得到目的片段，通过1%琼脂糖凝胶电泳回收 纯化目的DNA。
[0050]采用实施例1的方法，将目的DNA片段转到到米曲霉Aspergillus oryzae NRRL 3488中，转化子选择培养基为含有1.2μg/ml苯菌灵的PDA固体培养基。
[00511实施例3pck和ppc基因异源表达载体的构建
[0052] 根据NCBI上公布的大肠杆菌pck和ppc上下游序列，设计引物。
[0053] 表2扩增pck和ppc基因的引物
[0055]以大肠杆菌BL21的基因组为模板，使用上述引物PCR扩增相关基因。使用快切酶 pac I和Κρη I分别双酶切目的基因和上述载体pHgll，目的基因与载体连接得到ppc基因的 表达质粒pPHg2和pyc基因的表达质粒pPCg32。再使用快切酶Asc I、Hind III双酶切得到目 的片段，通过1%琼脂糖凝胶电泳回收纯化目的DNA。
[0056] 采用实施例1的方法，将目的DNA片段转到以Aspergillus oryzae NRRL 3488为出 发菌株的同时过表达了mdh和pyc基因的米曲霉重组菌中。用于转化子筛选的培养基为含有 2g/L潮霉素 B和ImM氯丙嗪的PDA固体培养基。
[0057]实施例4米曲霉发酵生产L-苹果酸
[0058] 将34°C培养3-7天的米曲霉的孢子用0.05 %的吐温80洗脱，使用云母布过滤除去 菌丝体。米曲霉摇瓶种子培养基孢子终浓度为1.5 X 106个/mL，30 °C、200rpm培养14h，以 10%的接种量转接发酵培养基，30°C、200rpm发酵106h。
[0059] 在Aspergillus oryzae NRRL 3488中仅过表达mdh基因，苹果酸的摇瓶发酵浓度 为42.3±0.70g/L。同时过表达了mdh和pyc基因的转化子Aspergillus oryzae pl6苹果酸 的产量达到50 · 5 ± 1 · 06g/L。在Aspergi 1 lus oryzae p 16中表达大肠杆菌来源的pck基因的 重组菌株Aspergillus oryzae pck3,摇瓶发酵95h苹果酸浓度为55.3±0.48g/LjJj|?酸的 浓度为9 · 13±0.42g/L，苹果酸相对于葡萄糖的转化率为0· 5g/g。在Aspergillus oryzae pl6的基础上，同时表达了异源的pck和ppc基因的重组菌株Aspergillus oryzae pp25,摇 瓶发酵90h苹果酸产量为63.2 ± 1.32g/L，琥珀酸的浓度为8.88 ±0.45g/L，苹果酸相对于葡 萄糖的转化率为〇.57g/g，生产强度也由初始Aspergillus oryzae NRRL 3488的0.24g/ (L · h)提尚至0.7g/(L · h)，有效实现了代谢改造菌株生广性能的提尚。
[0060] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技 术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。
【主权项】
1. 一种能够提高米曲霉合成L-苹果酸的过程中葡萄糖转化率的的方法，其特征在于， 所述方法是在初始米曲霉菌株中过表达米曲霉来源的苹果酸脱氢酶mdh和丙酮酸羧化酶 pyc，并同时表达来源于大肠杆菌的磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶pck和/或磷酸烯醇式丙酮 酸羧化酶ppc基因。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶pck编码 基因如NCBI上Gene ID:945667所示，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ppc编码基因如NCBI上Gene ID :948457所示。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述苹果酸脱氢酶mdh的基因序列如NCBI 上Gene ID:5994966所示，丙酮酸羧化酶pyc的基因序列如NCBI上Gene ID:5993308所示。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述初始米曲霉菌株，是Aspergill us oryzae NRRL 3488〇5. -种米曲霉重组菌，其特征在于，所述重组菌以米曲霉为宿主，过表达米曲霉来源的 苹果酸脱氢酶mdh和丙酮酸羧化酶pyc，并同时表达来源于大肠杆菌的磷酸烯醇式丙酮酸羧 化激酶pck和/或磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ppc基因。6. 根据权利要求5所述的重组菌，其特征在于，所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶pck编 码基因如NCBI上Gene ID: 945667所示，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ppc编码基因如NCBI上 Gene ID :948457所示。7. 根据权利要求5所述的重组菌，其特征在于，所述宿主为Aspergillus oryzae NRRL 3488〇8. -种生产L-苹果酸的方法，其特征在于，所述方法是以权利要求5~7任一所述的米 曲霉重组菌为生产菌株进行发酵生产。9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述发酵生产是制备米曲霉重组菌孢子浓 度为1 X 106个/mL至9X 106个/mL的孢子悬浮液，然后28~32°C振荡培养12~16h，然后转接 至发酵培养基，于28~32 °C振荡培养发酵90~106h。10. 权利要求5~7任一所述的米曲霉重组菌在食品、农业、化妆品或者医药领域的应 用。
【文档编号】C12R1/69GK105969790SQ201610603079
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年7月27日
【发明人】刘龙, 陈坚, 刘晶晶, 堵国成, 李江华, 房峻
【申请人】江南大学