一种外源蛋白原核分泌表达系统及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种以嗜麦芽寡养单胞菌D2突变株为 工程菌、以同源重组质粒PEX18S为载体的外源蛋白原核分泌表达系统及其应用。
【背景技术】
[0002] 蛋白/基因表达是指结构基因在生物体（宿主）中的转录、翻译以及加工过程；基 因工程技术中所谓的外源蛋白表达则是指将获得的外源基因片段通过载体重组到一个基 因表达宿主中，使其能产生具有生物活性大量蛋白表达产物，是当今分子生物学领域应用 最广泛的技术手段之一。随着生物工业生产工艺的发展，利用该技术已经成功生产出多种 疫苗、生化药物、工业酶等具有重要功能或用途的蛋白、多肽类生物产品。生命科学的各个 领域对高纯度、高产量和高稳定性的重组功能蛋白的需求日益增长，这使得外源蛋白表达 技术成为基因工程、生物制药研宄和应用的重要内容，也是生命科学研宄领域的热点之一。
[0003] 含有目的基因的宿主能否高效表达外源蛋白取决于多种因素，主要包括基因的结 构特征、表达系统（宿主菌、载体）和细胞培养等多个方面，其中，外源基因的表达系统是 影响蛋白表达的关键因素之一。一个理想的表达体系应具备目的基因的表达产量高、表达 产物稳定、生物活性高，而且表达产物容易分离纯化等特点。然而，高产量、高纯度的蛋白表 达、生产仍然是目前的瓶颈技术，其主要原因是缺乏可用于生产外源蛋白的分泌表达系统。
[0004] 蛋白表达系统的宿主可以为原核细胞（细菌）或真核细胞（酵母、植物细胞、动物 细胞等）。酵母作为表达工具表达产量通常较低，表达质粒易于丢失，外源整合基因不稳定， 较难用于外源蛋白的产业化；而哺乳类细胞、昆虫细胞等表达系统，虽然能够表达结构复杂 的真核细胞蛋白成分，但操作复杂、表达水平低，产业化生产造价昂贵，不易普遍推广使用。
[0005] 原核蛋白表达系统具有遗传背景清楚、操作简便、生产周期短、表达水平高、成本 低和易于大规模培养等优点，是最常用、最经济的外源蛋白表达系统。但是由于目前以大肠 杆菌为代表的多数原核细胞在大量生产时，其表达的外源目的蛋白常以包涵体形式表达， 为胞内不溶性表达，活性产物分离纯化困难，需要通过复性等复杂的步骤才能部分恢复活 性，从而限制了其应用。相比之下，如果外源蛋白能以"胞外分泌"的形式表达，产物分泌至 细胞外的培养基中，则具有较大的优势：蛋白一般可溶，在分泌的过程中能获得有生物活性 的蛋白质，从而避免了因包涵体复性带来的困难，不仅利于表达蛋白的纯化，还大大减小了 毒性蛋白对细胞的毒害作用。因此，外源蛋白的胞外分泌表达被认为是利用基因工程技术 生产外源蛋白质的最佳方式。枯草芽胞杆菌、短小芽胞杆菌等工程菌有更加完整的分泌体 系，蛋白在胞内表达后能够直接以可溶的形式分泌释放到培养基中，即"分泌表达"，形成包 涵体少，目的蛋白的回收相对简单，但其在表达外源蛋白的同时，往往自身也会向胞外分泌 大量的蛋白酶，使外源蛋白无法稳定存在。
[0006] 由上可见，寻找一种既能高效外来基因，又可增加蛋白质溶解性，而且目的产物易 于纯化的方法或系统，仍然是目前备受关注的研宄热点和重要任务。
【发明内容】
[0007] 为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种外源蛋白原核分泌表达系统，通过 所含工程菌和同源重组载体，实现外源蛋白的分泌表达的用途。
[0008] 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0009] 本发明提供一种外源蛋白原核分泌表达系统，包含工程菌和同源重组载体，其中 该工程菌为嗜麦芽寡养单胞菌D2 A smp缺失株，其smp基因被定点敲除，该同源重组载体 命名为PEX18S，其序列如SEQ ID:1所示。
[0010] 所述嗜麦芽寡养单胞菌D2 A smp缺失株，其菌种分类名称为：嗜麦芽寡养单胞菌 (Stenotrophomonas maltophilia)D2smpmutant，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研宄所， 保藏日期：2015年01月19日，保藏编号：CGMCC NO :10365。
[0011] 所述PEX18S以同源重组质粒pEX18Tc为骨架，按5' 一 3'将pEX18Tc的原多克隆 位点的HindIII和EcoRI间的序列替换为嗜麦芽寡养单胞菌D2株的smp基因的上游同源 臂序列、新的多克隆位点、嗜麦芽寡养单胞菌D2株的smp基因下游同源臂序列，其中上游同 源臂序列内含有嗜麦芽寡养单胞菌D2株的信号肽序列。
[0012] 所述同源重组载体PEX18S的制备方法包括如下步骤：
[0013] 步骤1.基因组DNA的提取
[0014] 将嗜麦芽寡养单胞菌D2野生株接种于LB液体培养基中过夜培养，用基因组DNA 提取试剂盒提取基因组DNA;
[0015] 步骤2. smp基因缺失片段的制备
[0016] 1)引物设计
[0017] 根据嗜麦芽寡养单胞菌D2野生株smp基因开放读码框架两侧的序列分别设计上、 下游同源臂的扩增引物，以扩增获得不含smp基因序列的片段，
[0018] 上游同源臂扩增引物：
[0019] 正向引物即4:核苷酸序列如5￡〇10此:2所示；
[0020] 反向引物UP-R :核苷酸序列如SEQ ID No:3所示；
[0021] 下游同源臂扩增引物：
[0022] 正向引物D0WN-F :核苷酸序列如SEQ ID No:4所示；
[0023] 反向引物D0WN-R :核苷酸序列如SEQ ID No:5所示；
[0024] 2)PCR分别扩增上、下游同源臂：
[0025] 其中，模板为步骤1提取的基因组DNA，引物为上、下游同源臂扩增引物UP-F、UP-R 和 D0WN-F 和 D0WN-R ;
[0026] 反应体系50 y L，其组成：
[0027] 模板 2. 0 y L，
[0028] PrimerSTAR/ HS DNA Polymerase 0? 5 y L，浓度为 5U/y 1，
[0029] 2X Primer STAR? GC Buffer 25 y L,
[0030] dNTP 4. 0 y L，其中每种浓度为 2. 5mmol/L，
[0031] dd H20 15. 5 y L，
[0032] 引物各1. 5 y L，引物浓度为10 y mol/L ;
[0033] PCR扩增参数：
[0034] 94°C 预变性 5min;
[0035] 98°C 10s，6(TC 5s，72°C 40s，30 个循环；
[0036] 72°C延伸 lOmin ;
[0037] 3)上、下游同源臂扩增产物的纯化
[0038] 使用PCR产物纯化试剂盒对上、下游同源臂扩增产物进行纯化；
[0039] 4)S0E PCR 连接
[0040] PCR引物为上游同源臂的正向引物UP-F和下游同源臂的反向引物D0WN-R，模板为 上、下游同源臂纯化产物；
[0041] 扩增体系：
[0042]模板各 1 y L ;
[0043] 浓度为 5U/y L 的PrimerSTARHS DNA polymerase 0? 5 y L，
[0044] 2 X primer STAR? GC Buffer 25 yL，
[0045] dNTPs 4. 0 y L，其中每种浓度为 2. 5mmol/L
[0046] dd H20 15. 5 y L，
[0047] 引物各1. 5yL，引物浓度lOymol/L ;
[0048] PCR扩增参数：
[0049] 94°C 预变性 5min ;
[0050] 98°C 10s，60°C 5s，72°C IminlOs，30 个循环
[0051] 72°C 延伸 10min，
[0052] 获得smp基因缺失片段并纯化，纯化方法与纯化上、下游同源臂扩增产物相同；
[0053] 步骤3.同源重组载体pEX18S的构建
[0054] 1)双酶切
[0055] 将步骤2获得的smp基因缺失片段和pEX18Tc质粒分别进行Hind III /EcoR I双 酶切，酶切体系20 y L体系：
[0056] lOXbuffer 2. 0 y L,
[0057] smp基因缺失片段或pEX18Tc质粒5. 0 y L，
[0058] Hind III 1. 0 y L,
[0059] EcoR I l.OuL,
[0060] dd H20 11 u L ；
[0061] 反应条件：37°C水浴30min，获得酶切产物，所述酶切产物为线性pEX18Tc质粒或 双酶切后的smp基因缺失片段；
[0062] 2)酶切产物的纯化：
[0063] 使用凝胶回收试剂盒分别纯化回收上述酶切产物：
[0064] 3)连接获得同源重组载体pEX18S
[0065] 反应体系：
[0066] 10XT4 DNA Ligase buffer 1 y L,
[0067] T4 DNA Ligase 1 y L，
[0068] 线性 pEX18Tc 质粒 1 y L，
[0069] 双酶切后的smp基因缺失片段4yL，
[0070] dd H20 3 y L，
[0071] 合计：10yL，
[0072] 反应条件：16°C过夜，获得同源重组载体pEX18S。
[0073] 本发明还提供一种外源蛋白原核分泌表达系统在制备外源蛋白中的用途。
[0074] 本发明还提供所述的外源蛋白原核分泌表达系统表达外源蛋白的方法，包括以下 步骤：
[0075] 1)PCR扩增目的外源蛋白的基因片段，并且在其两端加入酶切位点；
[0076] 2)将目的蛋白的基因片段和权利要求1所述同源重组载体pEX18S分别进行双酶 切、连接，构建含有外源蛋白基因片段的重组质粒；
[0077] 3)将含有外源蛋白基因的重组质粒转化到宿主细胞中，扩增培养；
[0078] 4)将宿主细胞和所述的嗜麦芽寡养单胞菌D2 A smp缺失株进行同源重组，获得含 有外源蛋白基因的嗜麦芽暴养单胞菌A smp缺失株；
[0079] 5)培养含有外源蛋白基因的嗜麦芽寡养单胞菌A smp缺失株，分离上清液，纯化 获得外源蛋白。
[0080] 优选地，步骤3)所述宿主细胞为大肠杆菌SM10 A pir。
[0081] 本发明的特点在于：
[0082] 1.表达系统中所采用的工程菌是以嗜麦芽寡养单胞菌D2野生株经过基因工程改 造后获得的突变株。具体说是以嗜麦芽寡养单胞菌D2株为出发菌，将该菌染色体上的D2 蛋白酶基因（以下以smp表示）定点敲除，获得嗜麦芽寡养单胞菌s