专利名称：一种肿瘤抗原蛋白质和肿瘤抗原肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种肿瘤抗原蛋白质和肿瘤抗原肽，特别是涉及一种用于治疗肝癌和肺癌的肿瘤抗原蛋白质和肿瘤抗原肽。
背景技术：
恶性肿瘤是威胁人类健康的一大类疾病。肿瘤的发生是一个非常复杂的过程。肿瘤细胞能够发生和进展的一个重要因素在于其能够逃避机体免疫系统的监视作用，因此如何激发和唤起机体的免疫系统识别并排斥“非己”成分的肿瘤细胞是寻找新的肿瘤治疗方法的一个突破口。在对肿瘤的免疫治疗研究的初期，人们发展了很多办法来激发机体的免疫系统来排斥“非己”成分的肿瘤细胞，尽管这些方法在动物肿瘤模型的治疗上取得了很好的疗效，但是在人类肿瘤的治疗上仍缺乏显著的效果。
已知人体内的免疫系统，包括体液免疫与细胞免疫，尤其是T细胞免疫对肿瘤的杀伤抑制起着重要作用。随着人们对免疫应答反应本质的认识，人们发现不管免疫应答的过程多么复杂，最终导致T细胞活化而产生杀伤效应的就是与主要组织相容性复合体MHC相结合形成抗原肽复合物和共刺激信号，即细胞毒性T细胞(CTL)通过自身表面的T细胞受体(TCR)，识别表达于肿瘤细胞表面的肿瘤抗原蛋白质/肽与主要组织相容性复合体(MHC)I类抗原相结合形成的复合体，从而攻击杀伤肿瘤细胞。
肿瘤抗原蛋白质/肽的产生是由肿瘤细胞先表达成肿瘤抗原，其在细胞内由各种蛋白酶分解成8～10个氨基酸大小的抗原肽，这些抗原肽与同时在内质网中产生MHCI类分子结合，通过高尔基复合体表达于细胞的表面，最终提呈给肿瘤抗原特异的CTL，从而诱发免疫应答，杀伤清除肿瘤细胞。这种存在于肿瘤细胞中、能与MHC分子结合并诱发机体免疫反应的蛋白质抗原分子即为肿瘤抗原。可以用这些抗原诱导机体产生只针对肿瘤细胞的免疫应答反应，从而特异杀伤体内的肿瘤细胞而达到治疗或者防治肿瘤细胞转移的作用。因此近几十年来，人们把用免疫方法治疗肿瘤的重点放在寻找肿瘤特异和/或相关性抗原上。
在二十世纪五十年代，Foley等人把经化学诱变产生肿瘤的小鼠用灭活的自身肿瘤细胞免疫后，再给该小鼠接种活的肿瘤细胞，这些肿瘤细胞被排斥而不能生长成肿瘤，小鼠则存活；与之对照，没用灭活的自身肿瘤细胞免疫的小鼠接种活的肿瘤细胞后，肿瘤细胞不被排斥而生长成肿瘤，小鼠则死亡。此实验以令人信服的证据证明了化学诱变的肿瘤存在肿瘤特异性抗原，但是这种保护反应有着精确的特异性，即只针对相同类型的肿瘤而不针对不同类型的肿瘤，即使是对用同一致癌剂在同一小鼠上诱导的不同类型肿瘤也没有保护作用。
1991年，T.Boon等首次从人黑色素瘤细胞中鉴定出肿瘤抗原蛋白质，并命名为MAGE(科学，2541643-1647，1991)。随后，人们又鉴定出来其它一些肿瘤抗原蛋白质，可以分为肿瘤-睾丸(CT)抗原蛋白质、分化抗原蛋白质、突变的肿瘤抗原蛋白质、过表达的肿瘤抗原蛋白质和病毒抗原蛋白质五类。其中，应用于临床上最为广泛的是肿瘤-睾丸(CT)抗原蛋白质。
肿瘤-睾丸(CT)抗原蛋白质是目前鉴定的肿瘤抗原中最多的一类，它们编码基因的特点是在很多类型的肿瘤中都有表达，如在黑色素瘤、肺癌、肉瘤和膀胱癌中都有表达，但在除睾丸外的正常组织都不表达，在胎盘、卵巢、胰腺中有一定量的表达。因为睾丸是免疫特许部位，所以这一类抗原在治疗上被认为是肿瘤特异性的抗原，是最有希望用作为肿瘤免疫治疗用途的一类抗原。目前试用于临床上的也主要就是这一类抗原，如MAGE-1和NY-ESO-1即是在一定类型的肿瘤中有高阳性率的表达，又有很好的免疫原性的抗原蛋白质，用于肿瘤的免疫治疗时有很好的前景。
到目前为止，最具代表性的鉴定肿瘤抗原蛋白质的方法为基于特异性细胞免疫应答基础上的文库筛选法、基于体液免疫应答基础上的cDNA表达文库筛选法、组合肽文库筛选、酸洗脱法和生物信息学方法。
肝癌和肺癌是人类肿瘤中最为常见与最为恶性的肿瘤，尤其是近些年来，发病率逐渐增加。它们由于恶性度高，生长迅速，一旦发现就已经是中晚期，目前，治疗主要是传统的手术切除和放疗等局部治疗方法，但由于大部分患者确诊时都已进入了中晚期，并且对放疗与化疗有相当的抵抗性，因此治疗的效果和预后往往较差。肝癌病人的一年与五年存活率与其它各类肿瘤病人的存活率相比是很低的。寻找治疗方法上的突破或者是新的治疗方法一直是临床肿瘤学家追求的目标，人们期待着有新的方法来提高肝癌与肺癌的早期诊断与病人良好的预后，以及术后清除体内残留的肿瘤细胞和防止肿瘤细胞的转移。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可用于肝癌和肺癌治疗的肿瘤抗原蛋白质和肿瘤抗原肽。
本发明的目的是通过如下的技术方案实现的本发明提供一种肿瘤抗原蛋白质，该蛋白质通过细胞内分解，能产生与主要组织相容性复合体(MHC)-I类分子相结合的、在结合状态能被T细胞所识别的肽片段，其具有如下(a)或(b)所述的氨基酸序列(a)具有序列1所示的氨基酸序列；(b)将(a)中的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代，缺失或添加突变所产生的衍生蛋白质，且该衍生蛋白质与(a)的蛋白质具有相同的功能。
本发明提供一种DNA序列，它编码所述的肿瘤抗原蛋白质。
本发明所述的DNA序列具有序列2所示的核苷酸序列，其在基因文库中登录号为TPTE AF007118。
本发明提供所述的蛋白质作为肿瘤-睾丸抗原的应用。
本发明提供所述的基因作为肿瘤-睾丸抗原基因的应用。
本发明提供一种与所述肿瘤抗原蛋白质所产生的肽片断同等功能的肿瘤抗原肽，其分别具有序列1中氨基酸序列的第9位～第17位、第95位～第102位、第100位～第108位、第102位～第110位、第130位～第138位、第137位～第145位、第195位～第203位、第235位～第244位、第263位～第272位、第277位～第287位、第308位～第319位、第330位～第338位或第523位～第535位的氨基酸序列。
本发明所述的肿瘤抗原蛋白质在制备治疗肝癌药物中的应用。
本发明所述的肿瘤抗原蛋白质在制备治疗肺癌药物中的应用。
本发明所述的肿瘤抗原肽在制备治疗肝癌药物中的应用。
本发明所述的肿瘤抗原肽在制备治疗肝癌药物中的应用。
本发明提供的肿瘤抗原蛋白质和肿瘤抗原肽的优益之处在于本发明首次将TPTE基因鉴定为肿瘤-睾丸抗原基因；在使用免疫方法治疗癌症时，可以用这些抗原诱导机体产生只针对肿瘤细胞的免疫应答反应，从而在不杀伤正常细胞的同时，特异杀伤体内的肿瘤细胞而达到治疗或者防治肿瘤细胞转移的作用；同时，可以通过对该肿瘤抗原基因或抗体的检测，对肿瘤的发生、发展以及是否有转移进行诊断。
图1是编码本发明抗原蛋白质的基因TPTE在16种成人正常组织的RT-PCR检测结果；图中的1～16分别代表成人正常组织脾、前列腺、卵巢、小肠、大肠、白细胞、睾丸、心脏、肺、肝、脑、肾、胎盘、骨骼肌、胰腺、胸腺；图2是编码本发明抗原蛋白质的基因TPTE在肝癌的癌组织与配对的癌旁组织的RT-PCR结果；图中的ca代表癌组织，adj代表配对的癌旁组织；图3是编码本发明抗原蛋白质的基因TPTE在肝癌组织与配对的癌旁组织的Northern blot结果；图中的ca代表癌组织，adj代表配对的癌旁组织；图4是通过Western blot方法检测的本发明抗原蛋白质在大肠杆菌中的重组蛋白与肝癌病人血清反应的代表性结果；图中的M代表蛋白质分子量标准参照，1代表表达有本发明中的肿瘤-睾丸抗原重组蛋白的sf9昆虫细胞裂解物与抗组氨酸标签的单克隆抗体反应的结果，2代表纯化的本发明中的肿瘤-睾丸抗原重组蛋白与抗组氨酸标签的单克隆抗体反应的结果，3代表表达有本发明中的肿瘤-睾丸抗原重组蛋白的sf9昆虫细胞裂解物与肝癌病人血清反应的结果，4代表纯化的本发明中的肿瘤-睾丸抗原重组蛋白与肝癌病人血清反应的结果，5代表转染有空表达载体的sf9昆虫细胞裂解物与肝癌病人血清反应的结果，6代表转染有无关蛋白对照表达载体的sf9昆虫细胞裂解物与肝癌病人血清反应的结果；图5是通过ELISA方法检测的本发明肿瘤-睾丸抗原蛋白质在sf9昆虫细胞中的重组蛋白与肝癌病人血清反应的结果；其中X轴代表血清的稀释度，Y轴代表波长为410nm时的吸光度； 分别代表重组蛋白与6个不同肿瘤病人血清反应的结果。
具体实施例方式
实施例1、TPTE基因的筛选以睾丸特异性表达为主题词在美国国家生物技术信息中心网站(http//www.ncbi.nlm.nih.gov)的基因数据库(GenBank)与文献检索数据库(PubMed)中检索那些已经有严格定义的在人正常组织中睾丸特异表达的基因，但它必须到目前为止没有任何与肿瘤相关的报道。由此我们获得了包括TPTE基因在内的数个在人正常组织中睾丸特异表达的基因，把他们作为我们下一步Unigene与SAGE数据库分析的靶基因。
实施例2、Unigene与SAGE数据库分析Unigene是一个将来源于同一个基因的所有Genbank序列自动进行归类的网络工具。在Unigene数据库中，每一个Unigene基因包含有来源于各种组织的、但属于同一个基因的片断大小不同的序列，这些序列的组织来源与表达信息都被注明。SAGE(基因表达的系列分析)数据库是一个可以对某一特定基因的表达谱进行定量和定性的在线工具。因此，应用Unigene与SAGE数据库，就可以对某一特定的基因的时间与空间性表达进行分析，从而获得它的相关功能信息。在本发明过程中，三个标准被用来筛选候选基因，以期望获得目的的肿瘤-睾丸(CT)抗原基因①候选基因必须是严格定义的在人正常组织中睾丸特异表达的基因，但它必须到目前为止没有任何与肿瘤相关的报道。②在本发明过程中的Unigene数据库分析中，候选基因的Unigene数据中必须含有来源于肿瘤的表达序列标签(EST)③在本发明过程中的SAGE数据库分析中，如果候选基因存在SAGE标签，只有严格对应候选基因的SAGE标签才能被应用于候选基因的分析中。当上述三个标准被采用后，候选基因TPTE被认为是最有可能的肿瘤-睾丸抗原基因。在TPTE基因的Unigene数据中，共有47个EST片段，虽然其中的43个EST来源于睾丸组织，但是另外的4个是来源于肿瘤组织；在TPTE基因的SAGE数据中，TPTE基因有2个来源于肿瘤组织的SAGE标签。基于上述分析，认为TPTE基因有可能是本发明中欲寻找的目的基因—肿瘤-睾丸抗原基因，下一步将设计实验予以证明。
实施例3、用RT-PCR的方法来分析TPTE基因的表达生物技术公司CLONTECH的16种商品化的人正常组织的cDNA(脾、前列腺、睾丸、卵巢、小肠、大肠、白细胞、心脏、肺、肝、脑、肾、胰腺、胎盘、骨骼肌、胸腺)、来源于62例肝癌病人的癌组织与配对的癌旁组织的cDNA、来源于14例肺癌病人的癌组织与配对的癌旁组织的cDNA、来源于14例胃癌病人的癌组织与配对的癌旁组织的cDNA与来源于14例肺癌病人的癌组织与配对的癌旁组织的cDNA被用来检测TPTE基因在正常组织与肿瘤组织的表达情况。
本发明中进行RT-PCR的条件应用CLONTECH公司的advanced热启动DNA聚合酶，94℃、15秒；65℃、30秒；72℃、90秒，30循环，之后，72℃、6分钟。进行RT-PCR的引物序列，正向引物cca caa tgg tcc acc cac aaa tg；反向引物aac atg tgg cagggt tgg aaa gaa c。结果发现TPTE基因在40％的肝癌标本、36％的肺癌中表达，而与之配对的癌旁组织都不表达(如图2)；在16种成人重要正常组织中，本发明中发现TPTE基因仅在睾丸组织中表达，TPTE基因在肝癌中的表达量与在睾丸的表达量一致，而在肺癌中比睾丸低。基于以上实验数据，本实施例中证明与实施例1中Unigene与SAGE数据库分析结果一致，TPTE基因是一个新的肿瘤-睾丸抗原基因。
实施例4、用Northern杂交的方法来分析TPTE基因在肝癌与肺癌中的表达用TRIZOL试剂(PROMEGA)从肝癌与肺癌病人的癌组织与配对的癌旁组织中提取总RNA，接着应用mRNA分离试剂盒(PROMEGA)从总RNA中分离mRNA。在甲酰胺、甲醛存在的条件下将2ug的mRNA变性，进行琼脂糖电泳后转到Hybond-N+尼龙膜(Amersham)上，用紫外交联的方法固定。用地高辛DNA探针标记试剂盒(Roche)标记实施例2中扩增出来的DNA片段，以制作DNA探针，按照常规的Northern杂交方法与膜上的mRNA进行杂交，之后进行放射自显影，检测出本发明中的睾丸-肿瘤抗原蛋白质基因TPTE的mRNA。然后，将检测出该基因mRNA所用的膜在1％SDS溶液中煮沸，除掉地高辛标记的探针后，用标记的管家基因G3PDH作探针，用同样的方法进行Northern杂交，检测出的mRNA作阳性对照。结果如图3所示。从这一结果可以看出，本发明的肿瘤抗原蛋白质基因的mRNA仅在癌组织中表达，而配对的癌旁组织不表达。与肿瘤-睾丸抗原基因的特性一致。
实施例5、TPTE基因重组蛋白质在sf9昆虫细胞中的表达应用Bac-To-Bac杆状病毒表达系统(GIBCOBRL)，在sf9昆虫细胞中，27℃生长条件下，表达重组蛋白质。SDS-PAGE蛋白电泳对重组蛋白的表达进行鉴定。之后，应用镍离子亲和层析柱子(INVOTRIGEN)将重组蛋白质从sf9昆虫细胞全蛋白中分离、纯化出来。用抗重组蛋白带有的6个组氨酸的单克隆抗体，通过Western杂交方法，对重组蛋白进行鉴定。表达肿瘤-睾丸抗原TPTE的杆状病毒储存液以及含有质粒pFASTBac-TPTE的大肠杆菌菌株DH10Bac被保存在中华人民共和国北京大学医学部基础医学院免疫系T细胞研究室的-80℃低温冰箱中，保存日期为2002年7月12日。
实施例6、用Western杂交与ELISA方法检测肝癌与肺癌病人血清中的抗TPTE重组蛋白的抗体参照实验医学杂志，1871349，1998中的方法，筛选TPTE mRNA转录本阳性的肿瘤病人的血清，发现在肿瘤病人的血清中存在抗TPTE重组蛋白的抗体(图4、5)。因此，TPTE是一个新的肿瘤-睾丸抗原，具有诱导肿瘤病人产生免疫应答，排斥杀伤肿瘤细胞的能力，有应用于肿瘤的临床免疫治疗的潜能。
实施例7、应用肿瘤抗原肽体外诱导CTL的形成与CTL体外杀伤实验参照中华普通外科杂志(17218，2002)中的实验方法。将2×106/ml浓度的PBMC(外周血单核细胞)2ml培养于24孔培养板中，作为效应淋巴细胞，同时，将另外一部分PBMC按2×106/ml浓度稀释于RPMI 1640培养基中，加入具有序列1中的第9位～第17位的氨基酸序列的肿瘤抗原肽40ug/ml，37℃孵育2小时后，经30GY60Coγ射线照射，离心，洗去剩余肽，用作为抗原提成细胞，按效应细胞APC为1.3∶1的APC细胞数，将抗原提成细胞加入上述效应细胞共同培养，于24小时后加入IL-2(澳大利亚Ludwig Institute for Cancer Research提供)25U/ml继续培养。以后每隔7天，按效应细胞∶抗原提成细胞为1.3∶1的抗原提成细胞细胞数量将抗原提成细胞加入效应细胞中再刺激3次，于第28天检测CTL的杀伤效应。杀伤实验按下述进行(1)采用非放射性细胞毒分析盒，测定CTL与靶细胞共培养后LDH释放值检测CTL的杀伤效应。按照试剂盒推荐程序操作。所用的培养基为含3％FCS的无酚红RPMI 1640，每种反应均设3个复孔，同时测定靶细胞自发释放值、靶细胞最大释放值、效应细胞自发释放值、体积校正值和培养基背景值。应用如下公式计算杀伤效应杀伤效应(％)＝(实验值-效应细胞自发释放值-靶细胞自发释放值)/(靶细胞最大释放值-靶细胞自发释放值)×100。(2)混合淋巴细胞与靶细胞共培养4小时后，观察淋巴细胞与靶细胞的形态学变化。28天后，外周血单核细胞扩增了32倍，其中CD3阳性细胞的比例上升了16％(从54％到70％)，CTL比例上升了20％(从36％到56％)。当效应细胞∶靶细胞为10∶1时，CTL对肿瘤抗原肽(由上海吉尔生化有限公司合成)孵育的的自体淋巴母细胞的杀伤效应为62.5％，对肿瘤抗原TPTE阳性的肿瘤细胞的杀伤效应为40.2％，两者均明显高于对自体淋巴母细胞的杀伤效应(17.9％)和肿瘤抗原TPTE阴性的肿瘤细胞的杀伤效应(1.6％)；当效应细胞∶靶细胞为3.3∶1时，CTL对肿瘤抗原肽孵育的的自体淋巴母细胞的杀伤效应为53.6％，明显高于对自体淋巴母细胞的杀伤效应(15.6％)。这些结果说明肿瘤抗原TPTE的肿瘤抗原肽能从肿瘤病人的PBMC中有效的诱导出具有特异杀伤肿瘤细胞的CTL，从而增强肿瘤病人清除肿瘤的能力。
使用序列1中第95位～第102位、第100位～第108位、第102位～第110位、第130位～第138位、第137位～第145位、第195位～第203位、第235位～第244位、第263位～第272位、第277位～第287位、第308位～第319位、第330位～第338位或第523位～第535位氨基酸序列的其它肿瘤抗原肽进行同样的实验，得到同样的结果。
实施例8、CTL细胞被肿瘤抗原肽刺激后分泌IFNγ能力的检测参照中华医学杂志(811234，2001)中的实验方法。用酶联免疫斑点检测法(ELISPOT)进行IFN-γ的定量。96孔平底硝酸纤维素板(购自法国Millipore公司)，用抗人IFN γ单抗(溶于pH9.6碳酸盐缓冲液中，终浓度为2ug/ml)包被，4℃过夜；第2天经含0.05％Tween 20的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后，用含10％AB血清的RPMI 1640培养液室温避光封闭1小时，再以0.05％Tween PBS洗涤，加入经7天诱导的效应细胞(effector cells，E)5×104个/孔。此后实验分两组进行，即效应细胞与T2细胞组(E+T2)、效应细胞与T2细胞加载肿瘤抗原肽组(E+T2肿瘤抗原肽)，每组各作两复孔。单纯T2细胞及加载了10uf/ml肿瘤抗原肽的T2细胞在无血清RPMI 1640中，37℃、5％CO2条件下孵育2小时，经60Coγ射线100GY照射，用无血清RPMI 1640洗去多余的抗原肽后作为刺激细胞，以1×105个/孔加入各效应细胞孔；该反应体系在不含细胞因子及血清的RPMI 1640培养液中，37℃、5％CO2条件下孵育18～20h后，用0.05％TweenPBS充分冲洗培养板以去除残留细胞；随后加入0.2uf/ml生物素标记的抗人IFNγ二抗，于37℃孵育2小时，洗板；再加入碱性磷酸酶标记的链霉亲和素1ug/m，室温下避光孵育1小时；洗板，加入底物显色液，避光显色5分钟，用自来水冲洗，终止反应。待反应板晾干后，于解剖显微镜下计数每孔呈黑紫色的斑点数，求出两复孔的平均值。E+T2肿瘤抗原肽组斑点数减去E+T2组斑点数即为肿瘤抗原特异的CTL细胞频数。ELISPOT检测中，以产生IFNγ的CD8+T细胞的频数为指标，分别在肿瘤组织表达TPTE mRNA的患者中测出对肿瘤抗原TPTE的应答者，而在癌组织无TPTEmRNA表达的患者中均未检测到相应的特异免疫应答。在部分癌组织表达TPTEmRNA，但血清无TPTE抗体的肿瘤患者中，仍然可以检测到CD8+T细胞对肿瘤抗原TPTE与抗原肽的免疫应答。本实验为进一步应用肿瘤抗原TPTE及抗原肽治疗肿瘤的临床体内实验提供了依据。
实施例9、突变的肿瘤抗原蛋白质的制备及其血清抗体筛选应用众所周知的方法制备了如下随机突变的DNA，将序列号2中的第413个碱基由T突变为C，由此也就将序列号1中的第138个氨基酸由L突变为P；将序列号2中的第38个碱基由T突变为C，由此也就将序列号1中的第38个氨基酸由V突变为A。将突变的DNA克隆到表达载体中，表达突变的肿瘤抗原，详细参照实施例4。应用制备的突变的肿瘤抗原参照实施例5筛选肿瘤病人的血清，发现在肿瘤病人的血清中也存在着这些突变肿瘤抗原的抗体。由于该实施例中的突变位点是随机选定的，这说明在肿瘤病人的血清中也存在针对其它位点的突变产生的肿瘤抗原蛋白质的抗体。该实施例说明突变的肿瘤抗原也有诱导肿瘤病人产生免疫应答，排斥杀伤肿瘤细胞的能力，有应用于肿瘤的临床免疫治疗的潜能。
应用本发明的肿瘤抗原蛋白质和肿瘤抗原肽可以提供活化抗肿瘤免疫的医药、可提供肿瘤的诊断方法。抗本发明中的肿瘤抗原蛋白质或肿瘤抗原肽的抗体可用于亲和层析、cDNA文库的筛选、免疫学诊断或医药的制备。
序列表包括序列1和序列2序列1为肿瘤-睾丸抗原蛋白质TPTE的氨基酸序列序列长度551拓扑学线性序列种类肽来源生物名人(Homo sapiens)组织种类肝癌组织序列特征特征的记号肽存在位置1..551序列1Met Asn Glu Ser Pro Asp Pro Thr Asp Leu Ala Gly Val Ile Ile Glu1 5 10 15Leu Gly Pro Asn Asp Ser Pro Gln Thr Ser Glu Phe Lys Gly Ala Thr20 25 30Glu Glu Ala Pro Ala Lys Glu Ser Pro His Thr Ser Glu Phe Lys Gly35 40 45Ala Ala Arg Val Ser Pro Ile Ser Glu Ser Val Leu Ala Arg Leu Ser50 55 60Lys Phe Glu Val Glu Asp Ala Glu Asn Val Ala Ser Tyr Asp Ser Lys65 70 75 80Ile Lys Lys Ile Val His Ser Ile Val Ser Ser Phe Ala Phe Gly Leu85 90 95
Phe Gly Val Phe Leu Val Leu Leu Asp Val Thr Leu Ile Leu Ala Asp100 105 110Leu Ile Phe Thr Asp Ser Lys Leu Tyr Ile Pro Leu Glu Tyr Arg Ser115 120 125Ile Ser Leu Ala Ile Ala Leu Phe Phe Leu Met Asp Val Leu Leu Arg130 135 140Val Phe Val Glu Arg Arg Gln Gln Tyr Phe Ser Asp Leu Phe Asn Ile145 150 155 160Leu Asp Thr Ala Ile Ile Val Ile Leu Leu Leu Val Asp Val Val Tyr165 170 175Ile Phe Phe Asp Ile Lys Leu Leu Arg Asn Ile Pro Arg Trp Thr His180 185 190Leu Leu Arg Leu Leu Arg Leu Ile Ile Leu Leu Arg Ile Phe His Leu195 200 205Phe His Gln Lys Arg Gln Leu Glu Lys Leu Ile Arg Arg Arg Val Ser210 215 220Glu Asn Lys Arg Arg Tyr Thr Arg Asp Gly Phe Asp Leu Asp Leu Thr225 230 235 240Tyr Val Thr Glu Arg Ile Ile Ala Met Ser Phe Pro Ser Ser Gly Arg245 250 255Gln Ser Phe Tyr Arg Asn Pro Ile Lys Glu Val Val Arg Phe Leu Asp260 265 270Lys Lys His Arg Asn His Tyr Arg Val Tyr Asn Leu Cys Ser Glu Arg275 280 285Ala Tyr Asp Pro Lys His Phe His Asn Arg Val Val Arg Ile Met Ile290 295 300Asp Asp His Asn Val Pro Thr Leu His Gln Met Val Val Phe Thr Lys305 310 315 320Glu Val Asn Glu Trp Met Ala Gln Asp Leu Glu Asn Ile Val Ala Ile325 330 335His Cys Lys Gly Gly Thr Asp Arg Thr Gly Thr Met Val Cys Ala Phe
340 345 350Leu Ile Ala Ser Glu Ile Cys Ser Thr Ala Lys Glu Ser Leu Tyr Tyr355 360 365Phe Gly Glu Arg Arg Thr Asp Lys Thr His Ser Glu Lys Phe Gln Gly370375 380Val Glu Thr Pro Ser Gln Lys Arg Tyr Val Ala Tyr Phe Ala Gln Val385 390 395 400Lys His Leu Tyr Asn Trp Asn Leu Pro Pro Arg Arg Ile Leu Phe Ile405 410 415Lys His Phe Ile Ile Tyr Ser Ile Pro Arg Tyr Val Arg Asp Leu Lys420 425 430Ile Gln Ile Glu Met Glu Lys Lys Val Val Phe Ser Thr Ile Ser Leu435 440 445Gly Lys Cys Ser Val Leu Asp Asn Ile Thr Thr Asp Lys Ile Leu Ile450 455 460Asp Val Phe Asp Gly Pro Pro Leu Tyr Asp Asp Val Lys Val Gln Phe465 470 475 480Phe Tyr Ser Asn Leu Pro Thr Tyr Tyr Asp Asn Cys Ser Phe Tyr Phe485 490 495Trp Leu His Thr Ser Phe Ile Glu Asn Asn Arg Leu Tyr Leu Pro Lys500 505 510Asn Glu Leu Asp Asn Leu His Lys Gln Lys Ala Arg Arg Ile Tyr Pro515 520 525Ser Asp Phe Ala Val Glu Ile Leu Phe Gly Glu Lys Met Thr Ser Ser530 535 540Asp Val Val Ala Gly Ser Asp545 550序列2为肿瘤-睾丸抗原蛋白质基因TPTE的核苷酸序列序列长度2168链型双链拓扑学线性序列种类cDNA至mRNA假设序列无反义无起源生物名人(Homo sapiens)组织种类肝癌组织序列特征特征的表示记号5’UTR存在位置1..339特征的表示记号CDS存在位置340..1995特征的表示记号3’UTR存在位置1996..2153特征的表示记号polyA位点存在位置2154..2168序列2GAATCCGCGG GGAGGGCACA ACAGCTGCTA CCTGAACAGT TTCTGACCCA ACAGTTACCC 60AGCGCCGGAC TCGCTGCGCC CCGGCGGCTC TAGGGACCCC CGGCGCCTAC ACTTAGCTCC 120GCGCCCGAGA GAATGTTGGA CCGACGACAC AAGACCTCAG ACTTGTGTTA TTCTAGCAGC 180TGAACACACC CCAGGCTCTT CTGACCGGCA GTGGCTCTGG AAGCAGTCTG GTGTATAGAG 240TTATGGATTC ACTACCAGAT TCTACTGTAT GCTCTTGACA ACTATGACCA CAATGGTCCA 300CCCACAAATG AATTATCAGG AGTGAACCCA GAGGCACGTA TGAATGAAAG TCCTGATCCG 360ACTGACCTGG CGGGAGTCAT CATTGAGCTC GGCCCCAATG ACAGTCCACA GACAAGTGAA 420TTTAAAGGAG CAACCGAGGA GGCACCTGCG AAAGAAAGCC CACACACAAG TGAATTTAAA 480GGAGCAGCCC GGGTGTCACC TATCAGTGAA AGTGTGTTAG CACGACTTTC CAAGTTTGAA 540GTTGAAGATG CTGAAAATGT TGCTTCATAT GACAGCAAGA TTAAGAAAAT TGTGCATTCA 600ATTGTATCAT CCTTTGCATT TGGACTATTT GGAGTTTTCC TGGTCTTACT GGATGTCACT 660CTCATCCTTG CCGACCTAAT TTTCACTGAC AGCAAACTTT ATATTCCTTT GGAGTATCGT 720TCTATTTCTC TAGCTATTGC CTTATTTTTT CTCATGGATG TTCTTCTTCG AGTATTTGTA 780
GAAAGGAGAC AGCAGTATTT TTCTGACTTA TTTAACATTT TAGATACTGC CATTATTGTG 840ATTCTTCTGC TGGTTGATGT CGTTTACATT TTTTTTGACA TTAAGTTGCT TAGGAATATT 900CCCAGATGGA CACATTTACT TCGACTTCTA CGACTTATTA TTCTGTTAAG AATTTTTCAT 960CTGTTTCATC AAAAAAGACA ACTTGAAAAG CTGATAAGAA GGCGGGTTTC AGAAAACAAA 1020AGGCGATACA CAAGGGATGG ATTTGACCTA GACCTCACTT ACGTTACAGA ACGTATTATT 1080GCTATGTCAT TTCCATCTTC TGGAAGGCAG TCTTTCTATA GAAATCCAAT CAAGGAAGTT 1140GTGCGGTTTC TAGATAAGAA ACACCGAAAC CACTATCGAG TCTACAATCT ATGCAGTGAA 1200AGAGCTTACG ATCCTAAGCA CTTCCATAAT AGGGTCGTTA GAATCATGAT TGATGATCAT 1260AATGTCCCCA CTCTACATCA GATGGTGGTT TTCACCAAGG AAGTAAATGA GTGGATGGCT 1320CAAGATCTTG AAAACATCGT AGCGATTCAC TGTAAAGGAG GCACAGATAG AACAGGAACT 1380ATGGTTTGTG CCTTCCTTAT TGCCTCTGAA ATATGTTCAA CTGCAAAGGA AAGCCTGTAT 1440TATTTTGGAG AAAGGCGAAC AGATAAAACC CACAGCGAAA AATTTCAGGG AGTAGAAACT 1500CCTTCTCAGA AGAGATATGT TGCATATTTT GCACAAGTGA AACATCTCTA CAACTGGAAT 1560CTCCCTCCAA GACGGATACT CTTTATAAAA CACTTCATTA TTTATTCGAT TCCTCGTTAT 1620GTACGTGATC TAAAAATCCA AATAGAAATG GAGAAAAAGG TTGTCTTTTC CACTATTTCA 1680TTAGGAAAAT GTTCGGTACT TGATAACATT ACAACAGACA AAATATTAAT TGATGTATTC 1740GACGGTCCAC CTCTGTATGA TGATGTGAAA GTGCAGTTTT TCTATTCGAA TCTTCCTACA 1800TACTATGACA ATTGCTCATT TTACTTCTGG TTGCACACAT CTTTTATTGA AAATAACAGG 1860CTTTATCTAC CAAAAAATGA ATTGGATAAT CTACATAAAC AAAAAGCACG GAGAATTTAT 1920CCATCAGATT TTGCCGTGGA GATACTTTTT GGCGAGAAAA TGACTTCCAG TGATGTTGTA 1980GCTGGATCCG ATTAAGTATA GCTCCCCCTT CCCCTTCTGG GAAAGAATTA TGTTCTTTCC 2040AACCCTGCCA CATGTTCATA TATCCTAAAT CTATCCTAAA TGTTCCCTTG AAGTATTTAT 2100TTATGTTTAT ATATGTTTAT ACATGTTCTT CAATAAATCT ATTACATATA TATAAAAAAA 2160AAAAAAAA 2168
PI034448-sequence list.txtSEQUENCE LISTING<110>北京大学<120>一种肿瘤抗原蛋白质和肿瘤抗原肽<130>PI034448<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>551<212>PRT<213>Homo sapiens<400>1Met Asn Glu Ser Pro Asp Pro Thr Asp Leu Ala Gly Val Ile Ile Glu1 5 10 15Leu Gly Pro Asn Asp Ser Pro Gln Thr Ser Glu Phe Lys Gly Ala Thr20 25 30Glu Glu Ala Pro Ala Lys Glu Ser Pro His Thr Ser Glu Phe Lys Gly35 40 45Ala Ala Arg Val Ser Pro Ile Ser Glu Ser Val Leu Ala Arg Leu Ser50 55 60Lys Phe Glu Val Glu Asp Ala Glu Asn Val Ala Ser Tyr Asp Ser Lys65 70 75 80Ile Lys Lys Ile Val His Ser Ile Val Ser Ser Phe Ala Phe Gly Leu85 90 95Phe Gly Val Phe Leu Val Leu Leu Asp Val Thr Leu Ile Leu Ala Asp100 105 110Leu Ile Phe Thr Asp Ser Lys Leu Tyr Ile Pro Leu Glu Tyr Arg Ser115 120 125Ile Ser Leu Ala Ile Ala Leu Phe Phe Leu Met Asp Val Leu Leu Arg130 135 140Val Phe Val Glu Arg Arg Gln Gln Tyr Phe Ser Asp Leu Phe Asn Ile145 150 155 160Leu Asp Thr Ala Ile Ile Val Ile Leu Leu Leu Val Asp Val Val Tyr165 170 175Ile Phe Phe Asp Ile Lys Leu Leu Arg Asn Ile Pro Arg Trp Thr His180 185 190Leu Leu Arg Leu Leu Arg Leu Ile Ile Leu Leu Arg Ile Phe His Leu195 200 205Phe His Gln Lys Arg Gln Leu Glu Lys Leu Ile Arg Arg Arg Val Ser210 215 220
PI034448-sequence list.txtGlu Ash Lys Arg Arg Tyr Thr Arg Asp Gly Phe Asp Leu Asp Leu Thr225 230 235 240Tyr Val Thr Glu Arg Ile Ile Ala Met Ser Phe Pro Ser Ser Gly Arg245 250 255Gln Ser Phe Tyr Arg Asn Pro Ile Lys Glu Val Val Arg Phe Leu Asp260 265 270Lys Lys His Arg Asn His Tyr Arg Val Tyr Asn Leu Cys Ser Glu Arg275 280 285Ala Tyr Asp Pro Lys His Phe His Asn Arg Val Val Arg Ile Met Ile290 295 300Asp Asp His Asn Val Pro Thr Leu His Gln Met Val Val Phe Thr Lys305 310 315 320Glu Val Asn Glu Trp Met Ala Gln Asp Leu Glu Asn Ile Val Ala Ile325 330 335His Cys Lys Gly Gly Thr Asp Arg Thr Gly Thr Met Val Cys Ala Phe340 345 350Leu Ile Ala Ser Glu Ile Cys Ser Thr Ala Lys Glu Ser Leu Tyr Tyr355 360 365Phe Gly Glu Arg Arg Thr Asp Lys Thr His Ser Glu Lys Phe Gln Gly370 375 380Val Glu Thr Pro Ser Gln Lys Arg Tyr Val Ala Tyr Phe Ala Gln Val385 390 395 400Lys His Leu Tyr Asn Trp Asn Leu Pro Pro Arg Arg Ile Leu Phe Ile405 410 415Lys His Phe Ile Ile Tyr Ser Ile Pro Arg Tyr Val Arg Asp Leu Lys420 425 430Ile Gln Ile Glu Met Glu Lys Lys Val Val Phe Ser Thr Ile Ser Leu435 440 445Gly Lys Cys Ser Val Leu Asp Asn Ile Thr Thr Asp Lys Ile Leu Ile450 455 460Asp Val Phe Asp Gly Pro Pro Leu Tyr Asp Asp Val Lys Val Gln Phe465 470 475 480Phe Tyr Ser Asn Leu Pro Thr Tyr Tyr Asp Asn Cys Ser Phe Tyr Phe485 490 495Trp Leu His Thr Ser Phe Ile Glu Asn Asn Arg Leu Tyr Leu Pro Lys500 505 510Asn Glu Leu Asp Asn Leu His Lys Gln Lys Ala Arg Arg Ile Tyr Pro515 520 525
PI034448-sequence list.txtSer Asp Phe Ala Val Glu Ile Leu Phe Gly Glu Lys Met Thr Ser Ser530 535 540Asp Val Val Ala Gly Ser Asp545 550<210>2<211>2168<212>DNA<213>Homo sapiens<400>2gaatccgcgg ggagggcaca acagctgcta cctgaacagt ttctgaccca acagttaccc 60agcgccggac tcgctgcgcc ccggcggctc tagggacccc cggcgcctac acttagctcc 120gcgcccgaga gaatgttgga ccgacgacac aagacctcag acttgtgtta ttctagcagc 180tgaacacacc ccaggctctt ctgaccggca gtggctctgg aagcagtctg gtgtatagag 240ttatggattc actaccagat tctactgtat gctcttgaca actatgacca caatggtcca 300cccacaaatg aattatcagg agtgaaccca gaggcacgta tgaatgaaag tcctgatccg 360actgacctgg cgggagtcat cattgagctc ggccccaatg acagtccaca gacaagtgaa 420tttaaaggag caaccgagga ggcacctgcg aaagaaagcc cacacacaag tgaatttaaa 480ggagcagccc gggtgtcacc tatcagtgaa agtgtgttag cacgactttc caagtttgaa 540gttgaagatg ctgaaaatgt tgcttcatat gacagcaaga ttaagaaaat tgtgcattca 600attgtatcat cctttgcatt tggactattt ggagttttcc tggtcttact ggatgtcact 660ctcatccttg ccgacctaat tttcactgac agcaaacttt atattccttt ggagtatcgt 720tctatttctc tagctattgc cttatttttt ctcatggatg ttcttcttcg agtatttgta 780gaaaggagac agcagtattt ttctgactta tttaacattt tagatactgc cattattgtg 840attcttctgc tggttgatgt cgtttacatt ttttttgaca ttaagttgct taggaatatt 900cccagatgga cacatttact tcgacttcta cgacttatta ttctgttaag aatttttcat 960ctgtttcatc aaaaaagaca acttgaaaag ctgataagaa ggcgggtttc agaaaacaaa1020aggcgataca caagggatgg atttgaccta gacctcactt acgttacaga acgtattatt1080gctatgtcat ttccatcttc tggaaggcag tctttctata gaaatccaat caaggaagtt1140gtgcggtttc tagataagaa acaccgaaac cactatcgag tctacaatct atgcagtgaa1200agagcttacg atcctaagca cttccataat agggtcgtta gaatcatgat tgatgatcat 1260aatgtcccca ctctacatca gatggtggtt ttcaccaagg aagtaaatga gtggatggct1320caagatcttg aaaacatcgt agcgattcac tgtaaaggag gcacagatag aacaggaact1380atggtttgtg ccttccttat tgcctctgaa atatgttcaa ctgcaaagga aagcctgtat1440tattttggag aaaggcgaac agataaaacc cacagcgaaa aatttcaggg agtagaaact1500ccttctcaga agagatatgt tgcatatttt gcacaagtga aacatctcta caactggaat1560ctccctccaa gacggatact ctttataaaa cacttcatta tttattcgat tcctcgttat1620gtacgtgatc taaaaatcca aatagaaatg gagaaaaagg ttgtcttttc cactatttca1680ttaggaaaat gttcggtact tgataacatt acaacagaca aaatattaat tgatgtattc1740gacggtccac ctctgtatga tgatgtgaaa gtgcagtttt tctattcgaa tcttcctaca1800
PI034448-sequence list.txttactatgaca attgctcatt ttacttctgg ttgcacacat cttttattga aaataacagg1860ctttatctac caaaaaatga attggataat ctacataaac aaaaagcacg gagaatttat1920ccatcagatt ttgccgtgga gatacttttt ggcgagaaaa tgacttccag tgatgttgta1980gctggatccg attaagtata gctccccctt ccccttctgg gaaagaatta tgttctttcc2040aaccctgcca catgttcata tatcctaaat ctatcctaaa tgttcccttg aagtatttat2100ttatgtttat atatgtttat acatgttctt caataaatct attacatata tataaaaaaa2160aaaaaaaa 2168
权利要求
1.一种肿瘤抗原蛋白质，该蛋白质通过细胞内分解，能产生与主要组织相容性复合体(MHC)-I类分子相结合的、在结合状态能被T细胞所识别的肽片段，其具有如下(a)或(b)所述的氨基酸序列(a)具有序列1所示的氨基酸序列；(b)将(a)中的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代，缺失或添加突变所产生的衍生蛋白质，且该衍生蛋白质与(a)的蛋白质具有相同的功能。
2.一种权利要求1所述的蛋白质作为肿瘤-睾丸抗原的应用。
3.一种权利要求1所述的肿瘤抗原蛋白质在制备治疗肝癌药物中的应用。
4.一种权利要求1所述的肿瘤抗原蛋白质在制备治疗肺癌药物中的应用。
5.一种DNA序列，它编码权利要求1所述的肿瘤抗原蛋白质。
6.一种权利要求5所述的DNA序列，其特征在于，具有序列2所示的核苷酸序列，其在基因文库中登录号为TPTE AF007118。
7.一种权利要求5所述的基因作为肿瘤-睾丸抗原基因的应用。
8.一种具有与权利要求1所述的肿瘤抗原蛋白质所产生的肽片断同等功能的肿瘤抗原肽，其分别具有序列1中氨基酸序列的第9位～第17位、第95位～第102位、第100位～第108位、第102位～第110位、第130位～第138位、第137位～第145位、第195位～第203位、第235位～第244位、第263位～第272位、第277位～第287位、第308位～第319位、第330位～第338位或第523位～第535位的氨基酸序列。
9.一种权利要求8所述的肿瘤抗原肽在制备治疗肝癌药物中的应用。
10.一种权利要求8所述的肿瘤抗原肽在制备治疗肺癌药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种肿瘤抗原蛋白质和肿瘤抗原肽。该肿瘤抗原蛋白质通过细胞内分解，能产生与主要组织相容性复合体(MHC)－I类分子相结合的、在结合状态能被T细胞所识别的肽片段。编码该肿瘤抗原蛋白质的DNA序列具有在基因文库中登录号为TPTE AF007118的序列的核苷酸序列。该肿瘤抗原蛋白质/肿瘤抗原肽可用于制备治疗肝癌或肺癌的药物。
文档编号C12N15/12GK1548455SQ03136069
公开日2004年11月24日 申请日期2003年5月15日 优先权日2003年5月15日
发明者陈慰峰, 董学员 申请人:北京大学