专利名称：T4噬菌体表面外源蛋白高效表达载体及其创建方法
技术领域：
本发明涉及基因工程蛋白质表达技术领域，具体地说是T4噬菌体表面外源蛋白高效表达载体及其创建方法。
背景技术：
自从1988年美国SMITH教授提出用噬菌体表面表达展示外源基因表达的蛋白的开创性概念以来，先后有噬菌体M13、T7，等几个噬菌体载体品种在实验室获得应用，并商业化上市有十年以上历史。但这几个噬菌体品种表面表达展示载体，它们的噬菌体基因组小，表面空间也较小，能包装表达的外源蛋白仅限于十数个至数十个氨基酸多肽长度。拷贝数低，约300拷贝以下，而且只能在噬菌体表面单一位点表达一种外源肽段。而且，常常只表达了目的蛋白-多肽的一级结构，因不能充分表达决定其生物活性所必需的空间结构而使所表达展示的一些外源蛋白丧失功能活性。
发明内容
本发明的目的是解决表达蛋白短，拷贝数低，有时缺乏生物活性的主要问题，提供一种使噬菌体表面表达展示外源基因表达蛋白的分子生物学技术更为完善的T4噬菌体表面外源蛋白高效表达载体及其创建方法。
本发明研究出在T4噬菌体外壳结构蛋白gp23表面，有两个生命非必须结构蛋白Soc-(960copy，9.4kDa)，Hoc-(120copy，41kDa)，缺失它们T4噬菌体病毒颗粒仍然能够复制。基于此，本发明的技术方案为1)在野生型T4噬菌体变异种T4-G326～160kb完全基因组上，人工缺失Soc-基因而不损伤其他功能基因，创建成T4噬菌体SOC位点表面表达展示载体ΦT4△Soc(T4 phage SOC display vector)2)在野生型T4噬菌体完全基因组～166Kb上人工缺失Hoc-基因而不损伤其他功能基因，创建成T4噬菌体HOC位点表面表达展示载体ΦT4△Hoc(T4phage HOC display vector)；3)把载体ΦT4△Soc和ΦT4△Hoc杂交后定向筛选，产生了Soc-基因及Hoc-基因双缺失而不损伤其他功能基因，SOC-HOC双位点表面表达展示载体ΦT4△Soc-△Hoc(T4 phage SOC-HOC bipartite display vector)。
三株T4噬菌体表面表达展示载体的创建方法如下1、T4噬菌体SOC位点表面表达展示载体(ΦT4△Soc)的创建方法1)以野生型T4噬菌体为模板，与质粒P△Soc9.8在工程菌E.coliCR63中进行同源重组，用SOC抗体为探针，经免疫蛋白杂交法(Western Blotting)筛选出Soc基因区9.8kb缺失的变种T4噬菌体株T4-△9.8Soc；2)将T4噬菌体变异株Eg326(S12+.△IPI，Alt-，e-，denV-)与T4噬菌体T4-△9.8Soc重组；3)以工程菌E.coli CR63作指示菌，35～37C°培养过夜，在溶菌酶依赖性培养基上筛选出目的载体ΦT4△Soc。
2、T4噬菌体HOC位点表面表达展示载体(ΦT4△Hoc)的创建方法1)以野生型T4噬菌体为模板，与质粒P△Hoc375aa在工程菌E.coliCR63中进行同源重组；2)用HOC抗体为探针，经免疫蛋白杂交法(Western Blotting)法筛选出Hoc-gp24区基因局部缺失的变种T4噬菌体株，即创建成目的载体ΦT4△Hoc。
3、T4噬菌体SOC、HOC双点位表面表达展示载体(ΦT4△Soc-△Hoc)的创建方法1)将ΦT4△Soc和ΦT4△Hoc在工程菌E.coli CR63中进行同源重组；2)同时用SOC，HOC双抗体为探针，经免疫蛋白杂交法(WesternBlotting)法筛选出Soc基因及Hoc基因双缺失的目的载体ΦT4△Soc-△Hoc；3)检验ΦT4△Soc-△Hoc株的溶菌酶依赖性。
本发明与现有技术比较具有以下积极效果本发明是目前已知噬菌体中基因组最大者(1.6×105核苷酸)，一个噬菌体颗粒表面能双位点(SOC、HOC)同时表达展示两种性质来源各异的蛋白多肽，拷贝数达1120，而且所表达的外源蛋白空间结构不变，能保持其本来生物活性。本发明的功能优越性目前处于世界基因工程技术的前列水平。现使用T4噬菌体表面外源蛋白高效表达展示载体已成功表达一系列人和动物烈性传染病抗源段，也创建成功T4噬菌体口蹄疫基因工程试验疫苗株，目前正进行动物口蹄疫强毒攻击保护试验。该载体成为基因工程疫苗研究开发的工具。目前还拟用该载体研究开发动物和入传染病诊断试纸条。本发明已进行了下列的应用人爱滋病毒HIV-1高抗原性片段gp120-Loop3，(长度43氨基酸aa)小儿麻痹病毒VPI抗原(213aa)；人脑膜炎耐瑟菌抗原(34aa)；猪瘟疫苗抗原E2(375aa)；禽法氏囊抗原VPII(420aa)；禽流感抗原HA(450aa)；口蹄疫病毒全抗原P1(830aa)。
表达展示的外源蛋白长度最长已达830多个氨基酸长度，除抗原免疫活性肽外，还表达了爱滋病毒细胞受体gp120-CD4，酶活性蛋白，溶菌酶与DNA连接酶的生物学活性。还可以用其制备从生物蛋白、多肽库中吊取目标肽段的“大海捞针”探针，从106PFU肽库中钓出一个目标肽段。
图1为本发明的T4噬菌体SOC位点表面表达展示载体元件结构示意图；图2为本发明的T4噬菌体HOC位点表面表达展示载体元件结构示意图；图3为本发明的T4噬菌体SOC-HOC双位点表面表达展示载体元件结构示意图；具体实施方式
实施例三株T4噬菌体表面表达展示载体的创建方法如下1、T4噬菌体SOC位点表面表达展示载体(ΦT4△Soc)的创建方法1)以野生型T4噬菌体为模板，与质粒P△Soc9.8在工程菌E.coliCR63中进行同源重组，用SOC抗体为探针，经免疫蛋白杂交法筛选出Soc基因区9.8kb缺失的变种T4噬菌体株T4-△9.8Soc；2)将T4噬菌体变异株Eg326(S12+，△IPI，Alt-，e-，denV-)与T4噬菌体T4-△9.8Soc重组；
3)以工程菌E.coli CR63作指示菌，37C°培养过夜，在溶菌酶依赖性培养基(其本培养基加50μg/ml溶菌酶)上筛选出目的载体ΦT4△Soc。
2、T4噬菌体HOC位点表面表达展示载体(ΦT4△Hoc)的创建方法1)以野生型T4噬菌体为模板，与质粒P△Hoc375aa在工程菌E.coliCR63中进行同源重组；2)用HOC抗体为探针，经免疫蛋白杂交法法筛选出Hoc-gp24区基因局部缺失的变种T4噬菌体株，即创建成目的载体ΦT4△Hoc。
3、T4噬菌体SOC、HOC双点位表面表达展示载体(ΦT4△Soc-△Hoc)的创建方法1)将ΦT4△Soc和ΦT4△Hoc在工程菌E.coli CR63中进行同源重组；2)同时用SOC，HOC双抗体为探针，经免疫蛋白杂交法法筛选出Soc基因及Hoc基因双缺失的目的载体ΦT4△Soc-△Hoc；3)检验ΦT4△Soc-△Hoc株的溶菌酶依赖性。
权利要求
1.一种T4噬菌体表面外源蛋白高效表达载体，其特征在于载体为1)T4噬菌体SOC位点表面表达展示载体ΦT4ΔSoc，其结构为 2)T4噬菌体HOC位点表面表达展示载体ΦT4ΔHoc，其结构为 3)SOC-HOC双位点表面表达展示载体φT4ΔSoc-ΔHoc，其结构为
2.权利要求1所述的T4噬菌体表面外源蛋白高效表达载体的创建方法，其特征在于由以下方法创建而成1)在野生型T4噬菌体变异种T4-G326～160kb完全基因组上，人工缺失Soc-基因而不损伤其他功能基因，创建成T4噬菌体SOC位点表面表达展示载体ΦT4ΔSoc2)在野生型T4噬菌体完全基因组～166Kb上人工缺失Hoc-基因而不损伤其他功能基因，创建成T4噬菌体HOC位点表面表达展示载体ΦT4ΔHoc3)把载体ΦT4ΔSoc和ΦT4ΔHoc杂交后定向筛选，产生了Soc-基因及Hoc-基因双缺失而不损伤其他功能基因，SOC-HOC双位点表面表达展示载体ΦT4ΔSoc-ΔHoc。
全文摘要
本发明是一种T4噬菌体表面外源蛋白高效表达载体及其创建方法。载体为1)T4噬菌体SOC位点表面表达展示载体ΦT4△Soc；2)T4噬菌体HOC位点表面表达展示载体ΦT4△Hoc3)SOC－HOC双位点表面表达展示载体ΦT4△Soc－△Hoc。本发明是目前已知噬菌体中基因组最大者(1.6×10
文档编号C12N15/33GK1523114SQ03135768
公开日2004年8月25日 申请日期2003年9月4日 优先权日2003年9月4日
发明者任兆钧 申请人:任兆钧