专利名称：厚垣孢轮枝孢zk7菌株的特异性分子标记及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及厚垣孢轮枝孢ZK7菌株的特异性分子标记及其应用，属分子生物学技术领域。
背景技术：
根结线虫(Meloidogyne spp.)是植物寄生线虫的重要类群之一，仅对世界上重要的经济作物每年造成的损失就高达数百亿美元(Barker et al.，1986)，是世界许多国家烟草生产的主要限制因素之一。在我国各大烟区造成了严重危害，且日趋严重，仅云南省发病面积就达40余万亩，病株造成烟叶减产30～50％(李天飞等，1994；杨铭等，1995)。由于生产上缺乏抗性品种，农作物复种指数高，化学杀线剂的使用受到限制及现代农业可持续发展的需要，使根结线虫的生物防治日益受到重视。
但是在生物防治过程中，迄今世界上研究开发的所有的生防制剂均不同程度的存在防效不稳定的问题。本发明人前期申请的“一种微生物及其生产生物杀线虫制剂的方法”(申请号99117391.0)，就是利用厚垣轮枝菌为出发菌株，研制开发了一种防治根结线虫的生物农药，目前开发的产品—线虫必克已经大量上市。但在产品的推广中仍不同程度的存在防效不稳定的问题，因此限制了线虫生物防治的推广应用。
造成生防制剂防效不稳定问题的主要原因是缺乏对生防菌生态学知识的了解。由于土壤是一个复杂的生态环境，要进行生防菌田间生态学研究首先必须解决生防菌田间快速检测问题。尽管许多学者对如何检测土壤特定的生防菌株进行了不懈的努力，针对不同的生防菌株研究开发了许多方法。如使用选择性和半选择性培养基、孢子回收技术、最大可能记数技术、酶联免疫分析、单克隆抗体技术等。在植物寄生线虫生防真菌的研究中，广泛使用线虫被寄生的数量来评估生防真菌的数量。但上述方法均存在一定的局限性，对生防真菌的检测过程中灵敏度和准确性不高，或者只能局限于特定的环境条件使用，不能准确客观地反映生防菌在自然环境中的定殖、存活及消长规律。
同时由于目前上市的线虫生防产品多为活菌体生产，消费者在使用时非常容易从产品分离出生产菌株。获得生产菌株后，即可仿造出同类产品，这对于原始创新是非常不公平的。因此，开发一种有效的线虫生防菌分子标记及检测方法，不但有利于跟踪研究生防菌株在土壤中消长，提高防效，更可通过标记，保护自主知识产权。
发明内容
本发明的目的在于通过对根结线虫生防菌ZK7菌株的特异性分子标记及其检测，提供一种快速鉴别和检测生防菌ZK7菌株的方法。
本发明采用的真菌是厚垣孢轮枝孢Verticillium chlamydosporium ZK7菌株，该菌株已于1999年9月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号CGMCC NO.0418。以该菌研制开发的微生物杀线虫剂——线虫必克已获国家临时农药登记，登记号LS 20011571。
本发明是这样实现的通过随机扩增DNA多态性(RAPD)PCR扩增技术对ZK7菌株和用为对照的同种不同菌株及土壤中常见真菌进行分子指纹分析，对ZK7菌株和对照菌株的分子指纹进行分析比较，获得ZK7菌株的RAPD特异性DNA片段Vc1200和Vc2000，进行回收、纯化，克隆和测序。具体特征为通过引物OPL-02(5′-TGG GCG TCA A-3′)扩增出一条1200bp的ZK7菌株特有的DNA片段，该片段命名为Vc1200；通过引物OPD-05(5′-TGA GCG GAC A-3′)扩增出一条2000bp的ZK7菌株特有的DNA片段，该片段命名为Vc2000；特异性DNA片段Vc1200碱基序列长度为1168bp，特异性DNA片段Vc2000碱基序列长度为1987bp；扩增DNA片段Vc1200的特异性引物及碱基序列为FVc1200(5′→3′)TGG GCG TCA AAG GAG TGG CRVc1200(5′→3′)TGG GCG TCA ATA CTT GAG AG扩增DNA片段Vc2000的特异性引物及碱基序列为FVc2000(5′→3′)TGA GCG GAC AGA GTG GAC TRVc2000(5′→3′)TGA GCG GAC AAT AGA GCC GA根据该特异性DNA片段序列设计特异性SCAR-PCR引物，对施用ZK7菌株的自然环境土壤提取的DNA进行PCR扩增，特异性检测ZK7菌株在自然环境土壤中的存在与否及其种群数量。同时将扩增出的ZK7菌株特异性DNA片段Vc1200和Vc2000进行地高辛标记制成杂交探针，利用标记探针对施用ZK7菌株的自然环境土壤提取的DNA进行斑点杂交，特异性检测ZK7菌株在自然环境土壤中的存在与否及其种群数量。
本发明具有能对DNA分子进行快速鉴别和检测的功能，为该菌株的生态学研究提供科学、高效研究手段。此外，当该菌株被非法使用和生产时，可利用该特异性引物进行准确鉴别，成为解决法律纠纷有力证据。
图1为特异性DNA片段Vc1200的测序碱基序列。
图2为特异性DNA片段Vc2000的测序碱基序。
图3特异性引物FVc1200和RVc1200对ZK7菌株的PCR检测结果。
图4特异性引物FVc2000和RVc2000对ZK7菌株的PCR检测结果。
图5特异性DNA片段Vc1200标记探针对ZK7菌株斑点杂交检测结果。
图6特异性DNA片段Vc2000标记探针对ZK7菌株斑点杂交检测结果。
具体实施例方式下面用实例来进一步详述本发明，但本发明的内容并不局限于此。
1、特异性DNA片段的获得通过培养ZK7菌株和对照菌株纯培养物菌丝体，分别提取其基因组DNA，用通用引物进行PCR扩增，筛选出对所有供试菌株具有DNA多态性的引物。对扩增出的DNA多态性进行比较，其中引物OPL-02(5′-TGG GCG TCA A-3′)扩增出一条大小约为1200bp的ZK7菌株特有的DNA片段，该片段命名为Vc1200；引物OPD-05(5′-TGA GCG GAC A-3′)扩增出一条大小约为2000bp的ZK7菌株特有的DNA片段，该片段命名为Vc2000。
2、特异性DNA片段序列测定在紫外观察仪下分别切取电泳后琼脂糖凝胶上特异性DNA片段Vc1200和Vc2000，用QIAquick Gel Extraction Kit回收纯化该DNA片段。将该片段分别用pGEM-T-Easy Vector Systems试剂盒进行克隆，通过蓝白斑平板筛选重组克隆菌落，并制备重组克隆质粒DNA，电泳检测其分子量大小，确定特异性DNA片段单拷贝插入的重组质粒后，将该重组质粒送商业测序公司测序。测序结果表明，特异性DNA片段Vc1200碱基序列长度为1168bp(附图1)，特异性DNA片段Vc2000碱基序列长度为1987bp(附图2)。
3、特异性引物设计根据SCAR-PCR技术原理，分别以特异性DNA片段Vc1200和Vc2000的两端碱基序列作为特异性引物的上游引物和下游引物。
扩增DNA片段Vc1200的特异性引物及碱基序列为FVc1200(5′→3′)TGG GCG TCA AAG GAG TGG CRVc1200(5′→3′)TGG GCG TCA ATA CTT GAG AG扩增DNA片段Vc2000的特异性引物及碱基序列为FVc2000(5′→3′)TGA GCG GAC AGA GTG GAC TRVc2000(5′→3′)TGA GCG GAC AAT AGA GCC GA4、ZK7菌株的特异性PCR检测提取施用ZK7菌株土壤DNA，以未施用ZK7菌株土壤DNA为对照，分别用特异性引物FVc1200/RVc1200和FVc2000/RVc2000进行PCR扩增。扩增结果表明，施用ZK7菌株的土样能分别扩增出特异性DNA片段Vc1200和Vc2000，而未施用ZK7菌株的土壤DNA无任何扩增产物(附图3和附图4)。
5、ZK7菌株的核酸探针检测将特异性引物扩增的DNA片段分别用地高辛标记成探针，用提取施用ZK7菌株的土壤DNA作为模板进行斑点杂交，以未施用ZK7菌株土壤DNA为对照。杂交结果表明，施用ZK7菌株的土样DNA出现杂交信号，而未施用ZK7菌株的土壤DNA无任何杂交信号(附图5和附图6)。
根据以上研究结果，由ZK7菌株特异性DNA片段Vc1200和Vc2000的碱基序列设计的特异性引物FVc1200/RVc1200和FVc2000/RVc2000可以对该菌株进行特异性快速PCR检测和斑点杂交检测。同时还可以利用该引物进行PCR扩增确定ZK7菌株在土壤环境中的种群数量。
权利要求
1.厚垣孢轮枝孢ZK7菌株的特异性分子标记，包括特异性DNA片段的获得、特异性DNA片段序列测定、特异性引物设计、地高辛标记制成杂交探针，其特征在于1.1采用真菌是厚垣孢轮枝孢Verticillium chlamydosporium ZK7菌株为培养的菌丝体；1.2引物OPL-02(5′-TGG GCG TCA A-3′)扩增出一条大小约为1200bp的ZK7菌株特有的DNA片段，该片段命名为Vc1200；引物OPD-05(5′-TGA GCG GACA-3′)扩增出一条大小约为2000bp的ZK7菌株特有的DNA片段，该片段命名为Vc2000；1.3特异性DNA片段Vc1200碱基序列长度为1168bp，特异性DNA片段Vc2000碱基序列长度为1987bp；1.4扩增DNA片段Vc1200的特异性引物及碱基序列为FVc1200(5′→3′)TGG GCG TCA AAG GAG TGG CRVc1200(5′→3′)TGG GCG TCA ATA CTT GAG AG；1.5扩增DNA片段Vc2000的特异性引物及碱基序列为FVc2000(5′→3′)TGA GCG GAC AGA GTG GAC TRVc2000(5′→3′)TGA GCG GAC AAT AGA GCC GA。
2.厚垣孢轮枝孢ZK7菌株的特异性分子标记的应用，其特征在于该特异性分子标记可应用ZK7菌株的分子鉴别和检测。
全文摘要
本发明涉及厚垣孢轮枝孢ZK7菌株的特异性分子标记及其应用，属分子生物学技术领域。本发明通过随机扩增DNA多态性(RAPD)PCR扩增技术对ZK7菌株和作为对照的同种不同菌株及土壤中常见真菌进行分子指纹分析和比较，获得ZK7菌株的RAPD特异性DNA片段Vc1200和Vc2000，进行回收、纯化，克隆和测序。根据该特异性DNA片段序列设计特异性SCAR－PCR引物，对施用ZK7菌株的自然环境土壤提取的DNA进行PCR扩增。同时将扩增出的ZK7菌株特异性DNA片段Vc1200和Vc2000进行地高辛标记制成杂交探针，利用标记探针对施用ZK7菌株的自然环境土壤提取的DNA进行斑点杂交，特异性检测ZK7菌株在自然环境土壤中的存在与否及其种群数量。本发明能快速进行分子鉴别和检测，为该菌株的生态学研究提供科学、高效的研究手段。
文档编号C12Q1/68GK1514021SQ0313531
公开日2004年7月21日 申请日期2003年6月27日 优先权日2003年6月27日
发明者张克勤, 祝明亮, 周薇 申请人:云南大学