专利名称：淡紫拟青霉m-14菌株的特异性分子标记及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及淡紫拟青霉M-14菌株的特异性分子标记及其应用，属生物技术领域。
背景技术：
大豆胞囊线虫(Heterodera glycines)是植物寄生线虫的重要类群之一，在我国，线虫主要危害烟草、花卉、蔬菜、棉花、大豆、花生、三七、西洋参等主要经济作物，成为发展这些作物的重要限制因子。黑龙江省仅大豆胞囊线虫每年造成的损失达8亿元之多。更严重的是由于线虫侵染后造成作物伤口，致使作物根部病害严重发生。据不完全统计，线虫病害每年造成各种作物产量平均损失达10～15％。长期以来线虫依赖于化学农药防治，随着科学技术发展，发现化学杀线虫剂不仅存在残毒影响人体健康，更重要的是因其主要防治目标线虫生长于地下。而土壤生态环境复杂，必须大剂量施用才可能有效。而大剂量使用对地下水造成严重污染。因此相当多的化学杀线虫剂的使用均不同程度受到限制，有的已经被禁用。市场呼唤高效低毒化学及生物杀线虫剂。
在线虫生物防治中，目前所有研究开发的线虫生防制剂均不同程度的存在防效不稳定的问题。由中国农科院生防所刘杏忠研究员与黑龙江农垦科学院联合，利用淡紫拟青霉M-14开发的大豆胞囊线虫抑制剂在推广过程中，同样存在防效不稳定的问题。究其原因，主要是缺乏对生防菌生态学研究。由于土壤是一个复杂的生态环境，要进行生防菌田间生态学研究首先必须解决生防菌田间快速检测问题。尽管许多学者对如何检测进行了不懈的努力，针对不同的菌株研究开发了许多方法，但仍未解决问题。主要是对生防菌检测灵敏度和准确性不高，不能准确客观地反映生防菌在自然环境中的定殖、存活及消长规律。因此，开发一种有效的线虫生防菌分子标记及检测方法已经是线虫生防领域中急待解决的问题。
随着分子生物学技术的快速发展，特别是分子标记和基因标记技术的建立与成熟，为解决上述问题提供了有效手段。将通过分子标记和基因标记的生防菌释放到自然环境后，可以根据生防菌携带的标记基因或特定分子标记进行快速检测及生态学研究，准确掌握生防菌在自然环境中的定殖、生长及繁殖等活动规律，为生防制剂的开发利用提供理论依据，并最终发挥生物防治在病虫害综合治理中的重要作用。
发明内容
本发明的目的在于通过大豆胞囊线虫生防菌M-14菌株的特异性分子标记及其检测，提供一种快速鉴别和检测生防菌M-14菌株的方法。
本发明采用的真菌是淡紫拟青霉Paecilomyces lilacinus M-14，由该菌株生产的大豆胞囊线虫抑制剂已获国家发明专利“防治大豆胞囊线虫病的菌株及其制剂”，专利号95121114。该菌株已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号CGMCC NO.0241。
本发明是这样实现的通过随机扩增DNA多态性(RAPD)PCR扩增技术对M-14菌株和用为对照的同种不同菌株及土壤中常见真菌进行分子指纹分析。对M-14菌株和对照菌株的分子指纹进行分析比较，获得M-14菌株的RAPD特异性DNA片段P850和P1400，将该DNA片段进行回收、纯化，克隆和测序。具体特征为通过引物OPC-11(5′-AAA GCT GCG G-3′)扩增出一条大小约为P850bp的M-14菌株特有的DNA片段，该片段命名为P850；通过引物OPD-05(5′-TGA GCG GAC A-3′)扩增出一条大小约为P1400bp的M-14菌株特有的DNA片段，该片段命名为P1400。特异性DNA片段P850碱基序列长度为853bp(附图1)，特异性DNA片段P1400碱基序列长度为1429bp(附图2)。扩增DNA片段P850的特异性引物及碱基序列为FP850(5′→3′)AAA GCT GCG GGT CGT TGG TRP850(5′→3′)AAA GCT GCG GAC CAC GGC CA扩增DNA片段P1400的特异性引物及碱基序列为FP1400(5′→3′)TGA GCG GAC AGG AAC AGG CRP1400(5′→3′)TGA GCG GAC ACC AAT CTC TC根据该特异性DNA片段序列设计特异性SCAR-PCR引物，对施用M-14菌株的自然环境土壤提取的DNA进行PCR扩增，特异性检测M-14菌株在自然环境土壤中的存在与否及其种群数量。同时将扩增出的M-14菌株特异性DNA片段P850和P1400进行地高辛标记制成杂交探针，利用标记探针对施用M-14菌株的自然环境土壤提取的DNA进行斑点杂交，特异性检测M-14菌株在自然环境土壤中的存在与否及其种群数量。
本发明具有能对DNA分子进行快速鉴别和检测的功能，为该菌株的生态学研究提供科学、高效研究手段。此外，当该菌株被非法使用和生产时，可利用该特异性引物进行准确鉴别，成为解决法律纠纷的有力证据。
图1为特异性DNA片段P850的测序碱基序列。
图2为特异性DNA片段P1400的测序碱基序列。
图3为特异性引物FP850和RP850对M-14菌株的PCR检测结果。
图4为特异性引物FP1400和RP1400对M-14菌株的PCR检测结果。
图5为特异性DNA片段P850标记探针对M-14菌株斑点杂交检测结果。
图6为特异性DNA片段P1400标记探针对M-14菌株斑点杂交检测结果。
具体实施例方式下面用实例来进一步详述本发明，但本发明的内容并不局限于此。
1、特异性DNA片段的获得通过培养M-14菌株和对照菌株纯培养物菌丝体，分别提取其基因组DNA，用通用引物进行PCR扩增，筛选出对所有供试菌株具有DNA多态性的引物。对扩增出的DNA多态性进行比较，其中引物OPC-11(5′-AAA GCT GCG G 3′)扩增出一条大小约为P850bp的M-14菌株特有的DNA片段，该片段命名为P850；引物OPD-05(5′-TGA GCG GAC A-3′)扩增出一条大小约为P1400bp的M-14菌株特有的DNA片段，该片段命名为P1400。
2、特异性DNA片段序列测定在紫外观察仪下分别切取电泳后琼脂糖凝胶上特异性DNA片段P850和P1400，用QIAquick Gel Extraction Kit回收纯化该DNA片段。将该片段分别用pGEM-T-EasyVector Systems试剂盒进行克隆，通过蓝白斑平板筛选重组克隆菌落，并制备重组克隆质粒DNA，电泳检测其分子量大小，确定特异性DNA片段单拷贝插入的重组质粒后，将该重组质粒送商业测序公司测序。测序结果表明，特异性DNA片段P850碱基序列长度为853bp(附图1)，特异性DNA片段P1400碱基序列长度为1429bp(附图2)。
3、特异性引物设计根据SCAR-PCR技术原理，分别以特异性DNA片段P850和P1400的两端碱基序列作为特异性引物的上游引物和下游引物。
扩增DNA片段P850的特异性引物及碱基序列为FP850(5′→3′)AAA GCT GCG GGT CGT TGG TRP850(5′→3′)AAA GCT GCG GAC CAC GGC CA扩增DNA片段P1400的特异性引物及碱基序列为FP1400(5′→3′)TGA GCG GAC AGG AAC AGG CRP1400(5′→3′)TGA GCG GAC ACC AAT CTC TC4、M-14菌株的特异性PCR检测提取施用M-14菌株土壤DNA，以未施用M-14菌株土壤DNA为对照，分别用特异性引物FP850/RP850和FP1400/RP1400进行PCR扩增。扩增结果表明，施用M-14菌株的土样能分别扩增出特异性DNA片段P850和P1400，而未施用M-14菌株的土壤DNA无任何扩增产物(附图3和附图4)。
5、M-14菌株的核酸探针检测将特异性引物扩增的DNA片段分别用地高辛标记成探针，用提取施用M-14菌株的土壤DNA作为模板进行斑点杂交，以未施用M-14菌株土壤DNA为对照。杂交结果表明，施用M-14菌株的土样DNA出现杂交信号，而未施用M-14菌株的土壤DNA无任何杂交信号(附图5和附图6)。
根据以上研究结果，由M-14菌株特异性DNA片段P850和P1400的碱基序列设计的特异性引物FP850/RP850和FP1400/RP1400可以对该菌株进行特异性快速PCR检测和斑点杂交检测。同时还可以利用该引物进行PCR扩增确定M-14菌株在土壤环境中的种群数量。
权利要求
1.淡紫拟青霉M-14菌株的特异性分子标记，包括特异性DNA片段的获得、特异性DNA片段序列测定、特异性引物设计、地高辛标记制成杂交探针，其特征在于1.1采用真菌淡紫拟青霉Paecilomyces lilacinus M-14菌株为培养物菌丝体；1.2引物OPC-11(5′-AAA GCT GCG G-3′)扩增出一条大小约为850bp的M-14菌株特有的DNA片段，该片段命名为P850；引物OPD-05(5′-TGA GCGGAC A-3′)扩增出一条大小约为1400bp的M-14菌株特有的DNA片段，该片段命名为P1400；1.3特异性DNA片段P850碱基序列长度为853bp，特异性DNA片段P1400碱基序列长度为1429bp；1.4扩增DNA片段P850的特异性引物及碱基序列为FP850(5′→3′)AAA GCT GCG GGT CGT TGG TRP850(5′→3′)AAA GCT GCG GAC CAC GGC CA；1.5扩增DNA片段P1400的特异性引物及碱基序列为FP1400(5′→3′)TGA GCG GAC AGG AAC AGG CRP1400(5′→3′)TGA GCG GAC ACC AAT CTC TC。
2.淡紫拟青霉M-14菌株的特异性分子标记的应用，其特征在于该特异性分子标记标记可作为分子鉴别和检测的应用。
全文摘要
本发明涉及淡紫拟青霉M－14菌株的特异性分子标记及其应用，属生物技术领域。本发明通过随机扩增DNA多态性技术对M－14菌株和作为对照的土壤中常见真菌进行分子指纹分析，获得M－14菌株的RAPD特异性DNA片段P850和P1400，将该DNA片段进行回收、纯化，克隆和测序。根据该特异性DNA片段序列设计特异性SCAR－PCR引物，对施用M－14菌株的自然环境土壤提取的DNA进行PCR扩增，同时将扩增出的M－14菌株特异性DNA片段P850和P1400进行地高辛标记制成杂交探针，利用标记探针对施用M－14菌株的自然环境土壤提取的DNA进行斑点杂交，特异性检测M－14菌株在自然环境土壤中的存在与否及其种群数量。本发明可对M－14菌株DNA分子进行快速鉴别和检测，为该菌株的生态学研究提供高效、科学研究手段。
文档编号C12Q1/68GK1514007SQ0313531
公开日2004年7月21日 申请日期2003年6月27日 优先权日2003年6月27日
发明者祝明亮, 夏振远, 张克勤, 刘杏忠 申请人:云南烟草科学研究院