专利名称：一种提高毕赤酵母重组蛋白表达量的方法
技术领域：
本发明涉及一种新的提高重组蛋白的表达的方法，属于生物工程领域。
背景技术：
巴斯德毕赤酵母表达系统是目前最优秀、应用最广泛的外源基因表达系统之一。 巴斯德毕赤酵母表达系统作为真核表达系统，有许多其它蛋白表达系统所不具备的优点。 可对表达的蛋白进行加工折叠和翻译后修饰，从而使表达出的蛋白具有生物活性，具有强 有力的乙醇氧化酶(AOXl)基因启动子，可严格调控外源蛋白的表达，营养要求低，培养基 廉价，生长快，与昆虫、哺乳动物等高等真核细胞相比，易于进行操作和培养。巴斯德毕赤酵 母对需氧生长有强的偏好，这一生理学特性使它能高密度发酵生长，表达量高，有利于工业 放大生产。巴斯德毕赤酵母自身分泌的蛋白(背景蛋白)非常少，有利于外源蛋白的分离和 纯化。表达的外源蛋白可分泌到胞外，分泌的内源蛋白少，外源蛋白分离纯化简便；外源基 因通过质粒整合到基因组上，基因工程菌株遗传稳定性好；胞内表达蛋白的分选和区域化， 增加了表达蛋白的稳定性，减少表达产物对宿主菌的毒害作用；糖基化程度低，与酿酒酵母 相比，巴斯德毕赤酵母不产生过度的糖基化；所分泌的糖蛋白的免疫原性较低，更利于临床 应用。高密度发酵是毕赤酵母提高蛋白表达量的一种重要策略，发酵工艺是高密度发酵 的一个重要因素。但是高密度发酵过程中，各种条件难以控制，酵母细胞内部自由基积累严 重，容易导致酵母死亡，进而影响了外源蛋白表达。褪黑激素(Melatonin)，又名黑素细胞凝集素，为脑白金的主要有效成分，是存在 于从藻类到人类等众多生物中的一种荷尔蒙，它在生物中的含量水平随每天的时间变化而 变化。褪黑素最大的特点应该是，它是迄今发现的最强的内源性自由基清除剂。褪黑素的 基本功能就是参与抗氧化系统，防止细胞产生氧化损伤。在这方面，它的功效超过了已知的 所有体内物质。所以通过褪黑激素的清除自由基功能作用于酵母细胞，使得酵母处于更优 状态，从而可以提高外源蛋白的表达量。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高重组蛋白表达的方法。从而可以使得通过高密度 发酵，生产外源蛋白的效率更高。本发明所述的提高重组蛋白表达的方法主要为在工程菌发酵表达外源重组蛋白 的过程中定时加入一定浓度的褪黑激素。本发明所说定时加入褪黑激素是指每隔一定的时间，其时间跨度可以为lh-Mh， 重复这一操作，周期性执行，直至发酵结束。本发明所说的一定浓度是指按发酵液的总量，褪黑激素在发酵液中的浓度为Ing/ ml-ΙΟΟμ g/ml，最佳的浓度为 lOng/ml-Ι μ g/ml。本发明的优点是利用了褪黑激素很强的自由基消除剂的优点，有效克服了毕赤酵
3母在高密度发酵时因环境胁迫导致的自由基积累以及进一步的对蛋白表达量的影响。
图1、IL2-HSA在不同溶度褪黑素诱导下蛋白表达量的SDS-PAGE分析M 低分子量标准；0:没有用褪黑激素处理的样品；1 0.001yg/ml褪黑激素处 理的样品；3 0.01 μ g/ml褪黑激素处理的样品；4 0.1 μ g/ml褪黑激素处理的样品； 5 1μ g/ml褪黑激素处理的样品；6 10 μ g/ml褪黑激素处理的样品；7 100 μ g/ml褪 黑激素处理的样品。图2、IFNii-HSA大瓶(500ml)不同溶度褪黑素诱导下蛋白表达量的SDS-PAGE分 析M 低分子量标准；0 没有用褪黑激素处理的样品；1 0. 001 μ g/ml褪黑激素处理的样 品；3 0.01 μ g/ml褪黑激素处理的样品；4 0. 1 μ g/ml褪黑激素处理的样品；5 Iyg/ ml褪黑激素处理的样品；6 10 μ g/ml褪黑激素处理的样品；7 100 μ g/ml褪黑激素处 理的样品。实施例1表达白介素2-人血清白蛋白融合蛋白的工程菌GSl 15/pPIC9K-IL2-HSA由本室构 建保存，该重组毕赤酵母甲醇利用表型为mut+。(1)从保存了高表达菌株的平板上挑取一单菌落，置于装有IOmLYPD培养基的 50mL摇瓶中，于30°C、200rpm培养24h。(2)将YPD培养基中培养了 24h的菌体以1 100 的比例接种于装有200mL BMGY培养基的IOOOmL摇瓶中，30°C、200rpm培养48h。期间每4h 取ImL菌悬液，用紫外分光光度计检测菌浓(菌浓以A_为计数单位)，绘制生长曲线。(3)重复步骤(1)和(2)，待菌体长至36h的时候，将200mL BMGY培养基中的菌体 静置4 6h，待菌体沉淀至瓶底，缓缓倒掉上清。加入灭菌过的BMMY培养基IOOmL,充分振 荡均勻，按每瓶15ml分成8瓶，加入1.5%甲醇(ν/ν)进行诱导表达，同时加入不同浓度的 褪黑激素(0. 001 μ g/ml、0· 01 μ g/ml、0· 1 μ g/ml、1 μ g/ml、10 μ g/ml、100 μ g/ml、1000 μ g/ ml。)，一瓶不加褪黑激素，其他后处理相同。其后每24h再加入相应浓度的褪黑激素。诱 导表达3d。SDS-PAGE电泳检测不同处理的表达情况(图1)。实施例2表达β干扰素-人血清白蛋白融合蛋白的工程菌GS115/pPIC9K-IFNi3_HSA由本 室构建保存，该重组毕赤酵母甲醇利用表型为mut+。(1)从保存了高表达菌株的平板上挑取一单菌落，置于装有IOmLYPD培养基的 50mL摇瓶中，于30°C、200rpm培养24h。(2)将YPD培养基中培养了 24h的菌体以1 100 的比例接种于装有200mLBMGY培养基的IOOOmL摇瓶中，30°C、200rpm培养48h。期间每4h 取ImL菌悬液，用紫外分光光度计检测菌浓(菌浓以A_为计数单位)，绘制生长曲线。(3)重复步骤(1)和(2)，待菌体长至36h的时候，将200mL BMGY培养基中的菌体 静置4 6h，待菌体沉淀至瓶底，缓缓倒掉上清。加入灭菌过的BMMY培养基IOOmL,充分振 荡均勻，按每瓶15ml分成8瓶，加入1.5%甲醇(ν/ν)进行诱导表达，同时加入不同浓度的 褪黑激素(0. 001 μ g/ml、0· 01 μ g/ml、0· 1 μ g/ml、1 μ g/ml、10 μ g/ml、100 μ g/ml、1000 μ g/ ml。)，一瓶不加褪黑激素，其他后处理相同。其后每24h再加入相应浓度的褪黑激素。诱 导表达3d。SDS-PAGE电泳检测不同处理的表达情况(图2)。
权利要求
1.一种新的提高重组蛋白的表达的方法，该方法为在利用酵母表达外源蛋白的过程中 定时加入微量的褪黑激素。其特征在于，在毕赤酵母高密度发酵过程中加入了低浓度的褪黑激素。
2.如权利要求1所述方法，其特征在于，其中所说的定时加入微量的褪黑激素是在毕 赤酵母发酵液中每隔一定时间(Ih-Mh)加入，周期性执行这一操作直至发酵结束。
3.如权利要求2所述，其特征在于，设定的褪黑激素浓度范围为Ing/ml-lOOyg/ml。
4.如权利要求3所述，其特征在于，设定的褪黑激素最佳浓度为lOng/ml-lyg/ml。
全文摘要
本发明涉及一种新的提高重组蛋白的表达的方法。在正常重组毕赤酵母的工艺流程的基础上，加入微量的退黑激素可以大大提高重组蛋白的表达。该方法使得重组酵母菌高密度发酵时由于供氧不均衡等胁迫带来的酵母内部自由基积累得到降低，改善了高密度发酵过程中因自由基带来的对酵母本身的损伤，从而改善了酵母本身的生理状况。使用退黑激素后，重组蛋白的表达量得到了很大程度的提高。
文档编号C12N1/19GK102120979SQ201010580240
公开日2011年7月13日 申请日期2010年12月9日 优先权日2010年12月9日
发明者张大成, 朱瑞宇, 辛鑫, 金坚, 陈蕴, 雷楗勇 申请人:江南大学