一种从含植物油的微生物发酵液中提取脂肪酶的方法
【专利说明】
【技术领域】
[0001]本发明属于酶分离技术领域。更具体地，本发明涉及一种从含植物油的微生物发酵液中提取脂肪酶的方法。
【【背景技术】】
[0002]脂肪酶(又称三酰基甘油酯水解酶)是一类可催化三酰甘油酯及其他水不溶性酯类的水解、酯化、转酯化等反应的酶类的总称;脂肪酶可广泛地应用于食品、皮革制造、生物柴油、医疗医药和洗涤剂等多个生产领域。许多动物、植物和微生物都可产脂肪酶，由于微生物易于培养、产脂肪酶种类繁多，并可通过微生物育种手段提高脂肪酶的产量，因此微生物产脂肪酶成为科研工作者的研究热点。
[0003]许多研究证实了油可作为产脂肪酶微生物的碳源及酶表达诱导剂，这些诱导剂包括植物油(橄榄油、棕榈油等)和动物油脂(三酰甘油、油酸等)。Gerardo等利用橄榄油或玉米油为碳源及诱导剂，在培养基中添加吐温并在低通气条件下培养解脂亚罗酵母合成脂肪酶；Venkatesagowda等以提取挪子油后的糟柏为原料发酵Lasiddiplodia theobromaeVBE-1，发现椰子油可增强脂肪酶的活性;Patrick以橄榄油作为Yarrowia Iipolytica培养的碳源，采用补料分批发酵所得酶活比分批发酵提高了 6倍，因此植物油或动物油的添加提高脂肪酶的活性在许多微生物发酵生产脂肪酶的工艺中普遍存在。作为碳源或诱导剂的油在微生物发酵脂肪酶的过程中发生乳化，使发酵液粘度增加，同时在发酵体系中必须存在一定浓度的油脂为微生物提供维持能一直到发酵结束;乳化油使发酵液粘度增加，难以通过离心、过滤等方式除去发酵液中的杂质，因此乳化油的存在影响了后续酶的提取工艺和干燥工艺。本发明基于此，发明了含油发酵液提取脂肪酶提的预处理工艺。
【
【发明内容】
】
[0004][要解决的技术问题]
[0005]本发明的目的是提供一种从含植物油的微生物发酵液中提取脂肪酶的方法。
[0006][技术方案]
[0007]本发明是通过下述技术方案实现的。
[0008]本发明涉及一种从含植物油的微生物发酵液中提取脂肪酶的方法。
[0009 ]该提取方法的步骤如下:
[0010]往含植物油的微生物发酵液中加入为发酵液体积35?50%的正丙醇，搅拌均匀，接着采用离心分离法分离成固相、重相与轻相;所述的固相与轻液弃去；
[0011]所述的重相转移到一种容器中，按照以克计载体重量与以毫升计重相的比是7?10: 100，往所述重相中加入玉米芯粉或花生壳粉载体，同时加入磷酸钙pH调节剂以达到pH6.5?7.5，然后进行喷雾干燥，得到脂肪酶粉末。
[0012]根据本发明的一种优选实施方式，所述的微生物发酵液是采用常规发酵方法获得的解脂亚罗酵母含量为16?17CFU的发酵液。
[0013]根据本发明的另一种优选实施方式，在所述微生物发酵液中的脂肪酶酶活性是5100U/ml 以上。
[0014]根据本发明的另一种优选实施方式，所述的植物油是豆油、花生油或菜籽油;所述植物油的含量是以微生物发酵液重量计0.1?1.0%。
[0015]根据本发明的另一种优选实施方式，从加入正丙醇起至离心分离止的时间是小于Ih0
[0016]根据本发明的另一种优选实施方式，所述离心分离是在室温与离心力6000g以上的条件下进行的。
[0017]根据本发明的另一种优选实施方式，在重相中的脂肪酶活性是所述微生物发酵液活性的80?92 %。
[0018]根据本发明的另一种优选实施方式，磷酸钙pH调节剂的添加量是载体重量的30?45%。
[0019]根据本发明的另一种优选实施方式，所述载体的粒度是60?80目。
[0020]本发明涉及采用所述方法得到的脂肪酶。它的酶活性为20400?25500U/g。
[0021 ]下面将更详细地描述本发明。
[0022]本发明涉及一种从含植物油的微生物发酵液中提取脂肪酶的方法。
[0023]该提取方法的步骤如下:
[0024]往含植物油的微生物发酵液中加入为发酵液体积35?50%的正丙醇，搅拌均匀，接着采用离心分离法分离成固相、重相与轻相;所述的固相与轻液弃去。
[0025]根据本发明，所述的微生物发酵液是采用常规发酵方法获得的解脂亚罗酵母含量为16?17CFU的发酵液。在本发明中，如果所述微生物发酵液的解脂亚罗酵母含量小于16CFU，则会脂肪酶活性较低;如果解脂亚罗酵母含量高于17CFU，则会脂肪酶产量较低；因此，解脂亚罗酵母含量为16?17CFU是合理的。
[0026]所述的常规发酵方法例如是CN101440350 A、发明名称《一株高产脂肪酶的解脂亚罗酵母突变株、培养方法及其酶应用》描述的发酵方法。
[0027]根据本发明，在所述微生物发酵液中的脂肪酶酶活性是5100U/ml以上。在本发明中，脂肪酶酶活性定义为Ig固体酶粉(或ImL液体酶)，在37°CpH8.0缓冲体系中，Imin水解底物产生IM1l的可滴定的脂肪酸，即为一个酶活力单位，以U/g(U/mL)表示。在本发明中，如果脂肪酶酶活性小于5100U/ml是不可行的，这是因为脂肪酶发酵酶活越低，通过本方法预处理发酵液脂肪酶活性损失率越大。脂肪酶酶活性是根据文献产脂肪酶黑曲霉摇瓶发酵条件优化研究(《生物技术通讯》，2015，31: 227-233)描述的方法测定的。
[0028]在本发明中，所述微生物发酵液中的植物油是豆油、花生油或菜籽油;所述植物油的含量是以微生物发酵液重量计0.1?1.0 %。如果植物油的含量小于0.1 %，则影响脂肪酶的诱导表达;如果植物油的含量大于1.0%,则通过影响溶氧传递而影响脂肪酶活性；因此，植物油的含量为0.1?1.0 %是合理，优选地是0.3?0.8 %，更优选地是0.4?0.6 %。
[0029]在本发明中，往微生物发酵液中加入正丙醇的作用在于萃取发酵体系中的植物油。如果正丙醇体积比例小于35%，则会植物油萃取不完全影响后续喷雾干燥效果;如果正丙醇体积比例高于50%，则会在植物油萃取过程中使脂肪酶活性显著下降；因此，正丙醇体积比例为35?50%是恰当的。
[0030]优选地，从加入正丙醇起至离心分离止的时间是小于lh，因为这个时间超过Ih会出现脂肪酶活性显著下降问题。
[0031]根据本发明，所述离心分离是在室温与离心力6000g以上的条件下进行的。本发明进行离心分离使用的离心设备是目前市场上销售的产品，例如由sigma公司销售的台式高速离心机。
[0032]使用离心分离设备将含正丙醇的微生物发酵液分离成固相、重相与轻相。固相与轻液弃去。将重相转移到一种容器中，按照以克计载体重量与以毫升计重相的比是7?10:100，往所述重相中加入玉米芯粉或花生壳粉载体，同时加入磷酸钙pH调节剂以达到pH6.5?7.5，然后进行喷雾干燥，得到脂肪酶粉末。
[0033]在本发明使用微生物发酵液中的脂肪酶酶活性是5100U/ml以上。在重相中的脂肪酶活性是所述微生物发酵液活性的80?92%。
[0034]根据本发明，磷酸钙pH调节剂的添加量是载体重量的30?45%以达到重相的pH为6.5?7.5。所述玉米芯粉或花生壳粉载体的粒度是60?80目。
[0035]本发明涉及采用所述方法得到的脂肪酶。它的酶活性为20400?25500U/g。
[0036][有益效果]
[0037]本发明的有益效果是:本发明从含油发酵液中提取脂肪酶的方法操作简单，本发明方法得到的脂肪酶的酶活损失〈20%;与现有乙醇-丙酮提取技术提取脂肪酶相比，脂肪酶活性损失降低30%。
【【具体实施方式】】
[0038]通过下述实施例将能够更好地理解本发明。
[0039]实施例1:从含植物油的微生物发酵液中提取脂肪酶
[0040]该实施例的实施步骤如下:
[0041]往解脂亚罗酵母含量106CFU、脂肪酶酶活性5100U/ml、豆油植物油含量以重量计
0.3%的发酵液中加入为发酵液体积40%的正丙醇，搅拌均匀，接着使用由sigma公司台式离心机，在室温与离心力6000g的条件下进行离心分离5min，分离成固相、重相与轻相。所述的固相与轻液弃去。从加入正丙醇起至离心分离止的时间是0.8h。
[0042]将其重相转移到一种容器中，按照以克计载体重量与以毫升计重相的比是10:100，往所述重相中加入60目玉米芯粉载体，同时加入为载体重量38%的磷酸钙pH调节剂，以达到pH 7.2，然后使用由无锡市现代喷雾干燥设备有限公司销售的喷雾干燥设备在其进出口温度分别为140°C与100°C的条件下进行干燥，于是得到酶活性为22399U/g的脂肪酶粉末，酶活性损失率=(理论酶活-喷雾干燥后酶活性)/理论酶活，本实施例中脂肪酶的酶活损失率为 12.1 % (理论酶活计算为5100U/ml X 1000^200 = 25500U/g)。
[0043]实施例:2:从含植物油的微生物发酵液中提取脂肪酶
[0044]该实施例的实施步骤如下:
[0045]往解脂亚罗酵母含