一种酯酶bse00077及其编码基因和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物化工和生物技术领域，具体设及一种醋酶BSE00077及其编码基因 和应用。
【背景技术】
[0002] 醋酶化C 3.1.1.1)广泛存在于动物、植物及微生物中，是一类催化水解或形成醋 键的酶，作用的底物通常是脂肪链小于十个碳原子的醋类。醋酶属于α/β折叠水解酶超家 族，催化中屯、由丝氨酸、天冬氨酸/谷氨酸和组氨酸组成，保守序列为丝氨酸附近的五肤 (GXSXG)序列。醋酶能催化水解、醋化、转醋化等多种化学反应，是一种很重要的工业生物催 化剂，被广泛运用于精细化工、洗涂、医药、食品、造纸、皮革加工、纺织、废水处理和饲料工 业等领域。从催化特性来看，醋酶具有高度的化学选择性和立体异构选择性，且反应不需要 辅酶、反应条件溫和、副产物少。在生产应用中的醋酶的另一显著特点是它能在异相系统 (即油-水界面)或有机相中作用。在水相中，醋酶通常催化水解反应，而在有机相中，它却能 催化醋化和转醋化反应。通过微生物醋酶的生物转化制备新型药物中间体或者去除药物消 旋体的非有效成分，是一种重要的手性技术，有着非常广阔的应用前景，它可W为合成手性 药物提供新的平台，为大量制备光学纯化合物提供新的方法。酶法选择性拆分消旋体化合 物，具有立体专一性高，副反应少，产率高，产物光学纯度好W及反应条件溫和的优点，所W 是一种被广泛认可的拆分方法。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供一种新的醋酶BSE00077及其编码基因和应用。
[0004] 本发明从一株来自海洋的芽抱杆菌(Bacillus sp.)SCSI0 15121中开发得到一种 醋酶BSE00077及其编码基因醋酶基因 bse00077,构建了含有醋酶基因 bse00077的重组表达 载体和基因工程菌，培养基因工程菌后获得醋酶BSE00077,其可应用于催化醋类水解反应。
[0005] 本发明的第一个目的是提供一种醋酶85600077，其氨基酸序列如56〇10^).2所 /J、- 〇
[0006] 本发明的第二个目的是提供一种编码所述的醋酶BSE00077的醋酶基因 bse00077。
[0007] 优选，所述的醋酶基因 bse00077的核巧酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[000引本发明还提供一种含有所述的醋酶基因 bse00077的重组表达载体。所述的重组表 达载体，优选祀T-28a (+)载体。
[0009] 本发明还提供一种含有所述的醋酶基因 bse00077的基因工程菌。所述的基因工程 菌，优选大肠杆菌化21 (DE3)。
[0010] 本发明的第Ξ个目的是提供所述的醋酶BSE00077在催化醋类水解中的应用。
[0011] 优选，所述的应用为醋酶BSE00077在催化乙酸苏合香醋水解生成(R)-1-苯乙醇中 的应用。
[0012] 本发明的第四个目的是提供所述的醋酶BSE00077在耐受正己烧和/或正庚烧环境 下进行催化的应用。
[0013] 本发明的醋酶基因 bse00077来自深海来源的芽抱杆菌（Bacillus SP. )SCSI0 15121(其来源为:89° 29.22'E，10°00.12'N，-3400m，pH7.8,2°C)，保存在中国科学院南海海 洋研究所。本发明利用生物信息学分析方法，从基因组测序的芽抱杆菌(Bacillus SP.) SCSI0 15121中克隆得到醋酶基因 bse00077,全长为74化p(从起始密码子到终止密码子）， 其编码的醋酶BSE00077含有246个氨基酸。将醋酶基因 bse00077与表达载体祀T-28a( + )连 接后转化大肠杆菌化2UDE3)，培养并诱导表达后，得到了重组醋酶BSE00077。将纯化的醋 酶BSE00077作为催化剂催化醋类水解反应，具有较好的稳定性，而且对部分表面活性剂及 有机溶剂的具有很好的耐受性。醋酶BSE00077的特性符合洗涂剂添加剂、绿色化工业上需 求，可用于洗涂剂、生物医药、化妆品和精细化工等领域。
【附图说明】
[0014] 图1是醋酶BSE00077的SDS-PAGE电泳图。其中，Μ为蛋白marker,泳道1为IPTG诱导 前的含有祀T-28a( + )-bse00077的大肠杆菌化2UDE3)粗蛋白，泳道2为IPTG诱导后的含有 祀T-28a( + )-bse00077的大肠杆菌化2UDE3)粗蛋白，泳道3为纯化的醋酶BSE00077蛋白。
[0015] 图2是醋酶BSE00077对不同侧链长度酷基的对硝基苯酪醋的特异性。
[0016] 图3是抑对醋酶BSE00077活性的影响。
[0017]图4是不同抑对醋酶BSE00077的稳定性影响。
[0018] 图5是溫度对醋酶BSE00077活性的影响。
[0019] 图6是不同溫度对醋酶BSE00077稳定性的影响。
[0020] 图7是醋酶BSE00077拆分乙酸苏合香醋的GC图。
[0021] 图8是底物浓度对醋酶BSE00077拆分的影响。
[0022] 图9是醋酶BSE00077拆分乙酸苏合香醋反应随反应时间的变化曲线。
【具体实施方式】
[0023] W下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0024] 实施例1:醋酶基因 bse00077开放阅读框边界确定及引物设计
[00巧]提取芽抱杆菌(Bacillus sp.)SCSI0 15121的基因组DNA，经全基因组测序后，利 用生物信息学手段对基因组进行基因注释，分析其中的醋酶基因，确定了其中醋酶基因 bse00077的开放阅读框，其基因序列如SEQ ID NO. 1所示，全长为74化P(从起始密码子到终 止密码子），其编码的醋酶85600077的氨基酸序列如56〇10^.2所示，共246个氨基酸。根 据分析得到的醋酶基因 bse00077序列，设计全长扩增引物如下：上游引物：5^ - TGCTAGCCATATGAAAGTTGTGACACCAAAACC-3^ (下划线为Ndel酶切位点）；下游引物：5'- AGGAAGCTTTTACCAATCGAGCTTCTCTAAAA-3^ (下划线为HindllI酶切位点）。
[00%] 实施例2:醋酶基因 bse00077的克隆及载体构建
[0027] 2.1PCR 扩增
[0028] 将实施例 1 设计的引物（上游引物：5' -TGCTAGCCATATGAAAGTTGTGACAC-CAAAACC- 3^ ;下游引物:5^ -AGGAAGCTTTTACCAATCGAGCTTCTCTAAAA-3^ )送至上海生物工程有限公司合 成，合成的引物使用TE缓冲液溶解成终浓度为ΙΟμΜ，W提取的芽抱杆菌(Baci 1 lus SP .) SCSIO 15121总DM作为DM模板，建立如表1所示反应体系：
[0029] 表1 PCR反应体系
[0030]
[0031] 使用W下PCR扩增程序扩增醋酶基因 bse00077:94°C变性5min; 94°C变性Imin，62 °C退火30s，72°C延伸1.5min，进行30个循环;72°C延伸lOmin，冷却到18°C。
[0032] 将PCR产物在0.8 %琼脂糖凝胶中，120V电压下电泳20min，置于凝胶成像系统中观 察，回收75化P左右的条带。PCR产物按照胶回收试剂盒的方法进行回收，使用20化无菌水洗 脱，得到纯化回收的PCR产物。
[0033] 2.2 酶切
[0034] PCR产物使用W下体系进行酶切，酶切时间1.化。酶切体系为:NdeI化L，化nd III 1化，DNA<0.3yg，灭菌的双蒸水加至50化。酶切后按照胶回收试剂盒方法回收得到经过双酶 切的PCR产物。
[0035] 质粒祀T-28a( + )的双酶切:挑取含有该质粒的大肠杆菌D册α单菌落，过夜培养。使 用质粒提取试剂盒提取质粒，用NdeI和化nd III按W下体系双酶切，酶切时间1.化。酶切体 系为:Ndel化L，化nd III 1化，DNA<0.3yg，灭菌的双蒸水加至50化。酶切后在0.8%琼脂糖 凝胶中电泳，按照胶回收试剂盒方法回收得到经过双酶切的线性祀T-28a( + )载体。
[0036] 上述双酶切使用的限制性内切酶为化ermo公司生产的快速内切酶，酶切后的纯化 回收使用核酸纯化回收试剂盒(Magen，Hipure Gel化re DNA Micro Kit),质粒提取试剂 盒为上海捷瑞生物工程有限公司的质粒小量制备试剂盒，操作方法按其使用说明书。
[0037] 2.3 连接
[0038] 将经过双酶切的PCR产物和双酶切的线性pET-28a( + )载体按W下体系进行连接： 双酶切PCR产物扣L，双酶切的线性祀T-28a(+)载体0.扣L，T4连接酶(5UAiL)0.5化，连接缓 冲液X5 X )