Rv3121蛋白在检测结核分枝杆菌感染中的应用
【专利摘要】本发明涉及Rv3121蛋白在检测结核分枝杆菌感染中的应用，所述抗原氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述的蛋白抗原的制备方法包括如下步骤：步骤(1)以催化Rv3121的入门载体(美国Craig Ventor Institute下设的PFGRC所免费提供)和载体重组生成Rv3121的表达载体；步骤(2)将步骤(1)所述Rv3121的表达载体转化目标表达宿主，表达目标Rv3121蛋白；步骤(3)破碎细胞收集蛋白包涵体并复性目标蛋白。
【专利说明】
Rv3121蛋白在检测结核分枝杆菌感染中的应用
技术领域
[0001] 本发明属于医疗产品技术领域，具体而言，涉及一种Rv3121蛋白在检测结核分枝 杆菌感染中的应用。
【背景技术】
[0002] 我国体外诊断产业现正处于快速增长时期。然而巨大的市场需求与我国诊断试剂 行业相对落后的自主研发能力的存明显的差距。如何从源头上开展自主创新，如何在诊断 试剂原材料供应上不受制于个别境外医药巨头，如何将现有的生物医药领域的科研成果转 化为产品是我国政府、科研院所和医药行业在近年来都非常关注的热点。并且现今市场上 对更灵敏、高效的诊断试剂提出了刚性需求，能够快速准确的确诊结核病患者对于医务工 作者和病人本人都具有重要意义。
[0003] 近年来数据调查结果显示，有结核病症状的患者76. 6%接受过结核病病前相关检 查，但是仅有35. 8%被诊断为肺结核患者，提高病人发现率仍是当前结核病防治工作的重 点也是难点。
[0004] 利用抗原特异性T细胞的细胞免疫反应进行病原微生物感染的体外诊断，是今年 发展起来的一种新的检测方法。我们通过分离新鲜全血中的外周血单核细胞并进行刺激培 养，然后利用ELISP0T检测能够分泌IFN-γ的细胞的数量。该方法目前主要应用于结核分 枝杆菌感染的诊断。目前临床普遍采用的结核诊断主要依赖于临床症状、影响学诊断和病 原学诊断，对结核分枝杆菌潜伏性感染的诊断不敏感。同时，在结核病筛查过程中，直接检 测病原体或检测结核分枝杆菌抗体的灵敏度和特异性也不理想。
【发明内容】
[0005] 针对上述临床实际工作情况，我们筛选了已知的结核分枝杆菌来源的蛋白片段， 结合现有的阳性检测参照物，提供了一种提高结核病诊断准确性的结核分枝杆菌标识物抗 原，通过该抗原来体外检测特异性T细胞免疫反应，可以作为诊断结核病患者的参照，用于 诊断患者是否被结核分枝杆菌感染。
[0006] 具体而言，本发明首先涉及一种结核分枝杆菌的特异性蛋白抗原Rv3121，所述抗 原的序列如SEQ ID NO. 2所示，其序列结构为：
[0007] Met ttr Ser Thr S&r lie Pro Thr Phe Pro i%:e Asp jk'g fr.Q y赶I Pro I 5 IQ 1_5 Tiir Glu Pro Ser Pro let Leu Ser Glu Le.u. A：r.g Asn- S.er Cys- Pro Val 20 25 30 Ala Pro Il.e. Glu Leu Pro. Ser Giy .His Thr Ala； Trp Leu Va；l Thr Arg 35： 40 4.5 Phe· A；sp Asp Ial Lys· Gly ￥al Leu Sex- Asp L：y.s Arg Pha -S：ex 'Cjs:· Arg· :m so so Ala Ala Ala 'His, Pro Ser' Ser' Pro Fro Flie ￥al Ρ?? Fh.e ￥ial Gln Leti 65 70 75 80 Cys Pro Ser Leu Leu 、丄丄e .A:s-p Gly .Pro. Gln His Thr Ala, Ala, Arg 85 90 95 Arg Leu Leu Ala Gln (Jlj Leti Asn Pro Gly Phe He Ala Arg Me1 Arg
[0008] 100 105 HO 技.1 GI.r Gln I:le Va"! Asp Asti Ala Lpu Asp Asp Lpii Al月：A.].a IL5" im- .1.25 Ala -Glu Pm-Pro： Va.l Asp Phe Γτ?η. G1i.l Tie ￥a.1. Ser Yal Pro T.1.e' Gly 130 135 140 GitrGln Leu. Met Ma Lys Lcti Leu Gly fal Glit .Pro Lys Thr Yal His 1:4:5. 150 155. 160 Glu Leu Ala Ala His Val Asp Ala Ala Met Ser Val Cys Glu He Gly 165 1.70- 1,75 ,Asp -Glti： Glu Val Ser Arg Atg Trp Se:r Ala Leti Cys Thr Met Val I]e 180 1.8:5 Γ90 .Asp lie Lea His Arg Lys Leu. Ala Glu· Pro Gly Asp Asp Leu Leu Ser ms 2:00 205 Tht. lie Ala Gln Ala Asn Arg G丄n Gln Ser Thr Met Thr Asp Glu Gln .210 215 22Q Y：al Ial Gly Met Leu Leu Thr Yal Val lie Gly Gly ￥al Asp Thr Pro 225' 2m 235 240 Ilc Ala Val lie Thr Asn Gly Lcu Ala Scr Lcu Lcu His His Arg Asp 245 25Q 255· Gin； Tyr Glu Arg Lcu Val Glu Asp Pro Gly Arg Val Ala Arg Ala V^] 260 265 270 Glu:：Glu Hg Val Arg· Phe· Asn Pro Ala Thr Glu. lie Glu His Leu Arg 275： 280' 285 ￥al ￥al Thr' 'Glu Asp： Val Val lie Ala GIy Thr Ala Leu Ser Ala GIy 290 295 300 Sex· P.rQ 41在 Phe Thr Ser lie Th:r Se:r A]-a As:ft Ar:g Asp Ser Asp Gln 305： 310 315: 320 P:he Leu Asp Pro： Asp. Glu Phe Asp ?al Glu. Arg Asn Pro Asn Glu Eis 3部 330 He Ala 'Phe- GI:y' Tyr Gly Pro- His Ala :Gy's Pro Ala Sex Ala Tyr Ser 340 345 3H0 Arg Mel Cys Leu Tlir Thr Phe Phe Thr Ser Leu Gln Arg Pbe· Ftq 355 360 365 Gln Leu Gln Leu Ala Arg Pro Phe Glu Asp L-e.u. -Glu Arg Arg Gly .Lys' 370 375 3:80 Gly Leu His- Ser Val Gly Tie Glxi LeU Letl VaI Thr Trp Pro T}ir 3:85 390 395 400
[0009] 所述的抗原的DNA表达序列如SEQ ID NO. I所示，序列结构为：
[0010] atgacaagca cctcgattcc gacgttcccg ttcgaccggc cggtcccgac ggagccgtcc 60 ccaatgctgt cggaactgag aaacagctgt ccggtagccc cgatagagtt gccctcgggg 120 cacacagcal ggctcgtcac tcgctttgac galgtaaagg gagtgclgtc cgacaagcgt 180 ttcagctgca gggcggcagc gcacccgtcg tcgcccccgt tcgtgccgtt cgtgcagctt 240 tgccccagct tgttgagcat cgatgggccc caacacaccg cggcccgccg tctgctcgcg 300 cagggcctaa atcccggctt catcgcacgc atgcggcccg ttgtccaaca gatcgtcgac 360 aatgcgctcg acgatctggc agccgcggaa ccaccggtgg acttccagga aatagtaagt 420 gtccctatcg gagaacagct catggccaag ctactcgggg tcgagcccaa aaccgtgcac 480 gagctcgcgg cgcacgtgga tgcggcgatg tccgtgtgtg agatcggcga cgaggaggtg 540 agccggcggt ggtcagcact gtgcacgatg gtcatcgaca tactgcaccg caagctcgcc 600 gaaccgggtg atgacctact tagcacgatc gcccaggcga accggcaaca gtccaccatg 680 accgacgagc aggttgtcgg catgctcctc accgtcgtga tcggaggagt cgacacaccg 720 atcgccgtga tcacaaacgg gctggcgagc ctgctgcacc accgcgatca atatgaacgg 780 ctcgttgaag acccaggccg tgtcgctcgt gcggttgaag aaatagtccg gtttaatccg 840 gcaactgaaa ttgagcactt gcgagttgtc accgaggatg tcgtcattgc cggaaccgcg 900 ctatcggcgg ggagcccagc atttacctcl atcacttcgg ctaaccgcga ctccgaccaa 960 ttcctggacc ccgatgagtt tgatgtcgaa cgtaatccga acgaacacat agcatttgga 1020 tatggtccac atgcttgccc ggcctcagcg tattcacgca tgtgcttgac gacgttcttc 1080 acctcgctta cccagcgatt tccgcaactt caactcgcaa gaccgtttga ggatttggaa 1140 cgacggggta agggcctaca ttcggtgggg atcaaggaac tccttgttac ctggccgacg 1200
[0011] 本发明还涉及所述的抗原的制备方法，包括如下步骤
[0012] 步骤⑴以GatewayiLRClona.se? Enzyme mix催化Rv3121 的入门裁体(美国 Craig Ventor Institute下设的PFGRC所免费提供）和。Gateway? pDEST?17载体重组生成Rv3121 的表达载体；
[0013] 步骤（2)将步骤（1)所述Rv3121的表达载体转化目标表达宿主，表达目标Rv3121 蛋白；
[0014] 步骤（3)破碎细胞收集蛋白包涵体并复性目标蛋白。
[0015] 所述的步骤（1)的具体方法是：
[0016] a.克隆反应体系：Rv3121的入门载体2. 5yL，PDEST?17载体I yL， Gateway? SPClcmase? Π Enzyme mix 2.5 yL;反应条件：25°C，过夜反应；
[0017] b.转化方法：反应体系中加入100 μ L大肠杆菌DH5 α感受态（自制），冰浴30min 后，42°C热激90s，体系冰上放置lOmin，加入200 μ L LB培养基复性后，涂布在含氨苄青霉 素（100mg/l)的LB固体培养基上，37°C培养20h ;
[0018] c.质粒提取：以N96高纯度质粒小提试剂盒（DP114)提取质粒，获得Rv3121的表 达载体。
[0019] 所述的步骤（2)的具体方法是：
[0020] a.取1 μ L步骤（1)获得的质粒溶液加入100 μ 1大肠杆菌rosetta(DE3)感受态， 冰浴30min后，42°C热激90s ;
[0021] b.体系冰上放置lOmin，加入200 μ L LB培养基复性后，涂布在含氨苄青霉素 (100mg/l)的LB固体培养基上，37°C培养12h ;
[0022] c.以 0· 75mM IPTG 诱导 Rv3121 蛋白表达。
[0023] 所述的步骤（3)的具体方法是：
[0024] a.以重悬液：60mM tris PH 9. 0,0· 15M EDTA重悬细菌，在4°C条件下使用超声波 破碎仪超声破碎细菌，
[0025] b. 4°C，1000 Orpm离心20min收集沉淀即为固体形态包涵体，结果如图2所示。
[0026] c.以溶解液（60mM Tris-HCl PH7. 0, IOM 尿素，15mM DTT，ImM EDTA)溶解包涵 体；第一次透析：以截留分子量为3K的透析袋过夜透析将蛋白透析，透析液成分为：20mM Tris-HCl PH 9.0, IM 尿素，3mM L-Argine ;
[0027] d.再透析第二次，透析液成分为：20mM Tris-HCl PH 9.0, IOmM NaCl，第二次透 析：以截留分子量为3K的透析袋过夜透析将蛋白透析至透析液，即可获得可直接用于免疫 原筛选的蛋白。
[0028] 本发明还涉及所述的Rv3121抗原作为检测结核分枝杆菌免疫原的应用。所述的 应用包括将该Rv3121蛋白抗原单独用于检测结核分枝杆菌；或将该Rv3121抗原与现有结 核分枝杆菌检测抗原联用，用于检测结核分枝杆菌。
[0029] 本发明还涉及所述的Rv3121蛋白抗原在制备结核分枝杆菌检测试剂盒中的应 用，所述的应用具体为，将所述的Rv3121蛋白抗原单独作为检测抗原制备检测试剂盒；或 将所述Rv3121蛋白抗原和现有结核分枝杆菌检测抗原协同联用，增加现有抗原免疫检测 准确度。
[0030] 所述的现有结核分枝杆菌检测抗原包括但不限于结核分枝杆菌来源的ESAT-6抗 原、CFPlO抗原、PH)抗原、BCG抗原、LAM抗原、ES-31抗原。
[0031] 本发明还涉及由所述的Rv3121蛋白抗原制备的单一抗原型结核分枝杆菌检测试 剂盒，所述试剂盒包含，
[0032] (1)检测有效量浓度（优选浓度为60ug/ml)的Rv3121蛋白抗原；
[0033] (2)必要的检测试剂及显色试剂。
[0034] 本发明还涉及包含所述的Rv3121蛋白抗原的多抗原联用型结核分枝杆菌检测试 剂盒，所述试剂盒包含，
[0035] (1)检测有效量浓度（优选浓度为60ug/ml)的Rv3121蛋白抗原，以及检测有效量 的其他抗原；
[0036] (2)必要的检测试剂及显色试剂。
[0037] 本发明还涉及所述的由Rv3121蛋白抗原制备的单一抗原型或多抗原联用型结核 分枝杆菌检测试剂盒的检测方法，所述的检测方法的步骤为，
[0038] (1)检测样品为由待测患者血样制备得到的抗凝全血或PBMC细胞；
[0039] ⑵Rv3121蛋白抗原作为免疫原与抗凝全血或者PBMC细胞孵育20-30个小时，优 选20-24个小时
[0040] (3)检测受到Rv3121蛋白抗原刺激分泌的细胞因子，与阳性参照对比确定检测 结果，所述的细胞因子为 IFN-gamma、IFN-alpha、TNF-alpha、IL-2、IL-13、IP-10、IL-lra、 GM-CSF、MIP-lbetta、IL-6、IL-8、MCP-l、IL-10 和 IL-12,优选 IFN-gamma、TNF-alpha、IL-2、 IL-13、IP-10、IL-lra、GM-CSF、MIP-lbetta，进一步优选 IFN-gamma、TNF-alpha、IL-2、 IL-13,最优选 IFN-gamma。
【附图说明】
[0041] 图L pDEST17-Rv3121表达载体酶切验证结果：B2泳道为Rv3121的DNA片段。
[0042] 图2.蛋白质纯化SDS-PAGE检测图，A.包涵体样品，M.蛋白质Marker，B.包涵体 溶解样品，C. 一次透析样品，D.二次透析样品。
【具体实施方式】
[0043] 实施例1. Rv3121-pDEST17表达载体构建基础流程
[0044] 以Gateway? LR Cjonase* Enzyme mix 催化 Rv3121 的入门裁体（美国 Craig Ventor Institute下设的PFGRC所免费提供）和Gateway? pDEST?17载体重组生成Rv3121的表达 载体。
[0045] 具体方法：
[0046] A.克隆反应体系：Rv3121 的入门载体 L 5 μ L，Gateway* pDEST?17 载体 1 μ L， Gateway1^ BP Clona.se?. II Enzyme mix 2· 5 μ L ;反应条件：25°C，过夜反应。
[0047] B.转化方法：反应体系中加入100 μ L大肠杆菌DH5 α感受态（自制），冰浴30min 后，42°C热激90s，体系冰上放置lOmin，加入200 μ L LB培养基复性后，涂布在含氨苄青霉 素（100mg/l)的LB固体培养基上，37°C培养20h。
[0048] C.质粒提取：以N96高纯度质粒小提试剂盒（DP114)提取质粒，获得Rv3121的表 达载体。
[0049] D.酶切验证：以BsrGl酶切试剂盒（R0575S NEB)酶切质粒验证克隆是否完成，结 果如图1所示结果显示，酶切片段大小约为1200bp，质粒构建成功。
[0050] 实施例2.目标蛋白Rv3121的表达及复性
[0051] 1.将实施例1获得的Rv3121的表达载体导入rosetta(DE3)表达载体中，具体方 法为：
[0052] a.取1 μ L质粒溶液加入100 μ rosetta (DE3)感受态（自制），冰浴30min后，42。。 热激90s，
[0053] b.体系冰上放置lOmin，加入200 μ L LB培养基复性后，涂布在含氨苄青霉素 (100mg/l)的LB固体培养基上，37°C培养12h ;
[0054] c.以 0· 75mM IPTG 诱导 Rv3121 蛋白表达。
[0055] 2.超声破碎细菌后超速离心，获取包涵体固体沉淀并收集蛋白及复性步骤具体方 法为：
[0056] a.以重悬液：60mM tris PH 9. 0,0· 15M EDTA重悬细菌，在4°C条件下使用超声波 破碎仪超声破碎细菌；
[0057] b. 4°C，1000 Orpm离心20min收集沉淀即为固体形态包涵体，结果如图2所示。
[0058] c.以溶解液（60mM Tris-HCl PH7. 0, IOM 尿素，15mM DTT，ImM EDTA)溶解包涵 体；第一次透析：以截留分子量为3K的透析袋过夜透析将蛋白透析，透析液成分为：20mM Tris-HCl PH 9.0, IM 尿素，3mM L-Argine ;
[0059] d.再透析第二次，透析液成分为：20mM Tris-HCl PH 9.0, IOmM NaCl，第二次透 析：以截留分子量为3K的透析袋过夜透析将蛋白透析至透析液，即可获得可直接用于免疫 原筛选的蛋白。
[0060] 实施例3.目标蛋白Rv3121的免疫原性测试
[0061] 为了检测Rv3121的免疫原性及其对于现有抗原检测试剂盒的增强效果，对于来 自北京胸科医院临床确诊的多个病例进行了进一步的抗原检测筛选。
[0062] 测试血样：来自北京胸科医院就诊患者
[0063] 试剂与耗材：T-SPOT试剂盒，Oxford immunotec (英国）产品
[0064] T-SPOT 实验：
[0065] 用Oxford immunotec的T-SPOT试剂盒，检测细胞因子为IFN-γ。
[0066] 1)肝素抗凝血，抗凝血样本按体积1:1与RPMI1640混匀；按2-3:1比例小心将血 样加在Ficoll淋巴细胞分离液上层；
[0067] 2) 1000 g离心22分钟；水平转子，缓升缓降；
[0068] 3)将单核细胞层（位于离心管中间层，为一层较薄的白膜状）从Ficoll分离管中 转移到已加 IOmlA頂-V培养液的无菌15ml离心管，轻轻混匀，室温600g离心7min ;
[0069] 4)小心去除上清，加入1ml A頂-V，轻缓重悬细胞，加入A頂-V培养液至10ml，350g 离心7min ;
[0070] 5)小心弃上清，加入1ml A頂-V培养液重悬细胞；
[0071] 6)细胞计数及稀释，取10 μ 1细胞悬液加入40 μ 1的1 % trypan blue，制备1 : 5细胞稀释液，进行活细胞计数，计算细胞稀释需要的体积并加入相应的AIM-V无血清培养 液制备细胞稀释液，试剂盒检测要求加入每孔（24孔PVDF膜板）细胞数量2. 5 X IO5;
[0072] 7)将培养板从铝封袋中取出，按顺序加入：
[0073] 50 μ I AIM V至阴性对照孔；50 μ 1抗原ESAT-6至抗原A孔；50 μ 1抗原CFP 10 至抗原B孔；50 μ 1阳性对照至阳性对照孔；在上述4孔中分别加入已制备细胞稀释工作液 100 μ 1。50 μ 1实施例2制备获得的Sample protein (初始浓度为60ug/ml)加入到样品孔 中，随后加入培养基和细胞，样品孔中Sample protein的终浓度为初始浓度的1/3。
[0074] 8)将培养板放入37°C，5% C02培养箱孵育16-20hrs。
[0075] 9)用无菌PBS按1:200制备新鲜酶标抗体工作液。从培养箱取出培养板，弃去孔 内液体。以200 μ Ι/well无菌PBS洗涤4遍。
[0076] 10)加入50 μ Ι/well酶标抗体工作液，将培养板在2-8°C孵育1小时。用PBS洗 涤4遍去除未结合酶标抗体。
[0077] 11)每孔加入室温平衡过的底物工作液50 μ 1，室温反应7分钟。以蒸馏水冲洗终 止反应，在37°C 2-3hrs或室温过夜干燥培养板。
[0078] 免疫原测试结果和分析：
[0079] 免疫原性测试在胸科医院分子生物学实验室进行。测试选用一定数量的已临床 确诊的结核病患者，通过使用各种蛋白抗原检测上述已确诊患者的血样，并由此结果分析 Rv3121蛋白抗原的免疫原性及应用方向，具体的检测结果统计见下表1所示，
[0080] 表1. RV3121抗原对住院已确诊结核病患者的结核分枝杆菌检测结果
[0082] *注：T-SPOT双抗原检测结果，高低应答同时存在
[0083] 通过上表中的数据可以看出，
[0084] (l)Rv3121蛋白抗原单独使用时，具有一定的检测结核分枝杆菌的效果；
[0085] (2)针对使用ESAT-6、CFPlO抗原联合检测时无法确诊的假阴性检测结果，配合 Rv3121的抗原进行联合免疫检测，能够获得更为准确的检测结果，提高病症检出率；
[0086] (3)阴性对照（随机选取的另一段来源于结核分枝杆菌的已知蛋白片段Rv2327， 其核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO. 3及SEQ ID NO. 4所示）则几乎无法应用于 临床检测。
[0087] SEQ I:D. No. .4 Met Ser Fro. Ser· Pro. Ala Ala Ala A：sn Arg S'er Glu Yal Gly Gly Fro^ I 5 10 15 Leu Pro Gly Leu Gly Ala Asp Leu Leu Ala Val Val Ala Arg Leu Asn 20： 25 30 A.rg I」.e.u Ala. Thr Gln A'rg He Gln Met； Pro Leu Pro Ala. Ala Gln Ala 35 40 45 Ar-g. Leu. LeU Ala, T：hr lie GIii AIa .Gln .Gly Glii Ala Arg &ly Asp 50 55 60 Leu Ala Ala lal. Asp His Cys Ser Gln Pro Thr Met Thr THr Gln Val 65 70 75 80 Arg Arg Leu Glu Asp· Ala Gly Leu Val Thr Arg Thr Ala Asp Pro Gly 85 90 95 Asp Ala Arg Ala Val Arg He Arg Il：e Thr Pro Glu Gly Arg: 'Thr 100 105 HO L:e.u Thr: Ala Val Arg.Ha A:sp A.rg A.l:a Ala Ala 工丄-e Glu Pro: Gln Le:u li.5: 1.20· 12S Ala Leu Leu Pro Pro Ala Asp Arg Arg Val Leu Ala Asp Ala yal Asp ISO I3& 140 V：al .Leu· Arg： Arg： Leu Leu Asp- His· Ala, Ala Thr Thr Pro. Gly Ar：g Ala 145 ISO 155 160 Thr· Arg. Gln SEQ' ID No. 3· atgagtccct cccccgccgc cgccaaccgc agcgaggtcg gcgggccact accgggcctg 60 ggagcggatc tgttggcagt ggtcgcgcgg ctcaaccgcc togccacgca gcgcatccag 120 atgccactgc ccgcggctca agccagactg ctggccacca tcgaagccca gggggaagcc 180 cggatcggcg acttggccgc cgtcgatcac tgctcgcaac caacgatgac cacgcaggta 240 cgacgactcg aggacgctgg actggttacc cgaaccgccg acccgggaga cgcccgggcg 300 gtccgcatcc gcatcacgcc ggaaggcalc cgcacgttga ccgcggtgcg ggcagaccgc 360 gcggctgcga tcgagcctca gctggccctg ctcccaccgg cggaccgccg ggtgttggcg 420 gatgcggtag acgtgttgcg ccggctgctc gaccatgccg ccaccacgcc gggccgggcg 480 scgcggcaat ag 492
[0088] 最后需要说明的是，以上实施例仅供本领域技术人员理解本发明的实质，并不用 作对本法保护范围的限定。
【主权项】
1. 一种检测结核分枝杆菌的特异性蛋白抗原Rv3121，所述抗原的DNA序列如SEQ ID NO. 1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。2. 根据权利要求1所述的蛋白抗原的制备方法，包括如下步骤， 步骤⑴以（ktcmy'1-0 LR cl〇iiasc々_ Enzymc mix催化Rv3i2i的入门载体和 c;atcnv:丨y?pDEST.?!7载体重组生成RV3121的表达载体； 步骤（2)将步骤（1)所述Rv3121的表达载体转化目标表达宿主，表达目标Rv3121蛋 白； 步骤（3)破碎细胞收集蛋白包涵体并复性目标蛋白。3. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于， 所述的步骤（1)的具体方法是： a. 克隆反应体系：Rv3121的入门载体1. 5 μ L，Gateway? pDEST_''"l7载体！ μ L， Gatewny? BPCbnasc? 丨丨:Enzyme mix 2· 5 μ L ;反应条件：25°C，过夜反应； b. 转化方法：反应体系中加入100 μ L大肠杆菌DH5 α感受态，冰浴30min后，42°C热 激90s，体系冰上放置lOmin，加入200 μ L LB培养基复性后，涂布在含100mg/l氨苄青霉素 的LB固体培养基上，37°C培养20h ; c. 质粒提取：以N96高纯度质粒小提试剂盒DP114提取质粒，获得Rv3121的表达载 体； 所述的步骤（2)的具体方法是： a. 取1 μ L步骤（1)获得的质粒溶液加入100 μ 1大肠杆菌rosetta (DE3)感受态，冰浴 30min 后，42°C热激 90s ; b. 体系冰上放置lOmin，加入200 μ L LB培养基复性后，涂布在含100mg/l氨苄青霉素 的LB固体培养基上，37°C培养12h ; c. 以0. 75mM IPTG诱导Rv3121蛋白表达； 所述的步骤（3)的具体方法是： a. 以重悬液：60mM tris PH 9. 0,0. 15M EDTA重悬细菌，在4°C条件下使用超声波破碎 仪超声破碎细菌； b. 4°C，lOOOOrpm离心15min收集沉淀即为固体形态包涵体； c. 以溶解液溶解包涵体；第一次透析：以截留分子量为3K的透析袋过夜透析将蛋白透 析，透析液成分为：20mM Tris-HCl ΡΗ 9·0，1Μ 尿素，3mM L-Argine ; d. 再透析第二次，透析液成分为：20mM Tris-HCl PH 9. 0，10mM NaCl，第二次透析：以 截留分子量为3K的透析袋过夜透析将蛋白透析至透析液，即可获得可直接用于免疫原筛 选的蛋白。4. 权利要求1所述的Rv3121蛋白抗原作为检测结核分枝杆菌免疫原的应用，所述的应 用包括， (1)将该Rv3121蛋白抗原单独用于检测结核分枝杆菌； 或（2)将该Rv3121抗原与现有结核分枝杆菌检测抗原联用，用于检测结核分枝杆菌。5. 权利要求1所述的Rv3121蛋白抗原在制备结核分枝杆菌检测试剂盒中的应用，所述 的应用为， (1)将所述的RV3121蛋白抗原单独作为检测抗原制备检测试剂盒； 或（2)将所述Rv3121蛋白抗原和现有结核分枝杆菌检测抗原协同联用，增加现有抗原 免疫检测准确度。6. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的现有结核分枝杆菌检测抗原为结 核分枝杆菌来源的ESAT-6抗原、CFP10抗原、PH)抗原、BCG抗原、LAM抗原、ES-31抗原。7. 由权利要求1所述的Rv3121蛋白抗原制备的单一抗原型结核分枝杆菌检测试剂盒， 所述试剂盒包含， (1) 检测有效量浓度（优选浓度为60ug/ml)的Rv3121蛋白抗原； (2) 必要的检测试剂及显色试剂。8. 包含权利要求1所述的Rv3121蛋白抗原的多抗原联用型结核分枝杆菌检测试剂盒， 所述试剂盒包含， (1) 检测有效量浓度（优选浓度为60ug/ml)的Rv3121蛋白抗原，以及检测有效量的其 他抗原； (2) 必要的检测试剂及显色试剂。9. 权利要求7、8所述的试剂盒的应用，其特征在于，所述的检测方法为， (1) 检测样品为由待测患者血样制备得到的抗凝全血或PBMC细胞； (2) Rv3121蛋白抗原作为免疫原与抗凝全血或者PBMC细胞孵育20-30个小时，优选 20-24个小时 (3) 检测受到Rv3121蛋白抗原刺激分泌的细胞因子，与阳性参照对比确定检测结果， 所述的细胞因子为 IFN-gamma、IFN-alpha、TNF-alpha、IL-2、IL-13、IP-10、IL-lra、GM-CSF、 MIP-lbetta、IL-6、IL-8、MCP-1、IL-10 和 IL-12,优选 IFN-gamma、TNF-alpha、IL-2、IL-13、 1卩-10、几-1抑、61-〇5卩、]\〇?-1匕6?3，进一步优选正~131111^、了陬-31?1^、11^-2、比-13，最优 选 IFN-gamma〇
【文档编号】G01N33/569GK105861520SQ201510028750
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2015年1月20日
【发明人】毕利军, 张先恩, 朱国峰, 邓教宇, 陶生策, 侯剑, 王雅果
【申请人】广东体必康生物科技有限公司