一种通过镁离子诱导大肠杆菌裂解的重组载体及应用
【专利摘要】本发明公开了一种通过镁离子诱导大肠杆菌裂解的重组载体及应用，属于基因工程技术领域。本发明所提供的重组载体包括连接在原始质粒上的裂解基因和插入在裂解基因之前的启动子PmgtA或同时含有启动子PmgtA和5’?URT的片段；所述裂解基因来SRRZ来源于大肠杆菌，基因S的GenbanK ID为8182761,基因R的GenbanK ID为8182762,基因RZ的GenbanKID为8182763；所述PmgtA启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述同时含有启动子PmgtA和5’?URT的片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。同时，本发明还提供了该重组载体的构建和使用方法。本发明的重组载体及含有该重载载体的重组细胞具有裂解效率高，成本低，能耗低的特点；在低镁离子条件下，1h内可实现100％裂解且不需要昂贵的诱导剂。
【专利说明】
一种通过镆离子诱导大肠杆菌裂解的重组载体及应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种通过镁离子诱导大肠杆菌裂解的重组载体及应用，属于基因工程
技术领域。
【背景技术】
[0002] 随着基因工程技术的发展，重组蛋白的体外表达已经成为较成熟的体系，用于工 业、医学等领域的重组蛋白商业生产也越来越受到重视。随着人们对环境及可再生资源等 方面的重视不断加深，微生物也越来越广泛的应用于各种生物化工产品的生产。在众多生 物化学品中，除一些小分子及部分蛋白质产物等可被细胞分泌到胞外，还有很多如聚羟基 脂肪酸脂等属于胞内产物。作为生产过程必不可少的重要环节，高效、经济、环保的微生物 产物回收方法对提高微生物合成产业的发展至关重要。
[0003] 传统的细胞产物的回收方法主要分为化学法和生物法两类。化学法主要包括有机 溶剂萃取法、碱处理法等，这些方法简单、快速，但存在有机溶剂污染、能耗高、效率低等问 题，且化学法反应剧烈，不适用于易变性产物的回收。物理法主要通过高速搅拌或高压是产 物从细胞中释放，如实验室中常用的超声波破碎法。物理法可以有效地避免细胞与外界环 境的接触，但存在耗能高、效率低等问题。除化学法和物理法为，酶处理法也可以用于细胞 产物的释放。与化学发和物理法相比，此方法条件温和，但价格昂贵，目前尚不能应用于大 规模的工业生产。
[0004] 来自于大肠杆菌的λ噬菌体裂解基因 SRRz由S、R和Rz三个亚基组成，λ噬菌体裂解 基因的S基因具有双起始基序特征，可编码S107和S105两种功能相反的蛋白。将S亚基前的 三个碱基ATG去除后表达的蛋白，具有裂解效果，可使细菌具体破裂，细菌胞内产物得以释 放。目前，虽然有一些关于细胞自裂解技术的报道，但现有技术往往都需要添加价格昂贵的 裂解诱导试剂，或者采用能耗较高的方式实现细胞裂解，细胞裂解的成本较高，操作复杂。
【发明内容】
[0005] 为解决上述技术问题，本发明提供了一种通过镁离子诱导大肠杆菌裂解的重组载 体以及该重组载体的构建和应用方法，所采取的技术方案如下：
[0006] 本发明的一个目的在于提供一种通过镁离子诱导大肠杆菌裂解的重组载体，该重 组载体包括连接在原始质粒上的λ噬菌体裂解基因和插入在裂解基因之前的启动子P mgtA或 同时含有启动子PmgtA和5'_URT的片段;所述λ噬菌体裂解基因 SRRz来源于大肠杆菌，其中，基 因 S的GenbanK ID为8182761，基因 R的GenbanK ID为8182762,基因 Rz的GenbanK ID为 8182763;所述PmgtA启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示;所述同时含有启动子PmgtA和 5'_URT的片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0007] 含有所述重组载体的基因工程菌也在本发明的保护范围之内。
[0008] 本发明的另一目的在于提供一种所述重组载体的构建方法，该构建方法是以大肠 杆菌基因组为模板，通过PCR反应扩增裂解基因，再将获得的扩增产物后连接到质粒载体 PBAD18I，再通过PCR反应扩增启动子PmgtA或同时含有启动子PmgtA和5'-URT的片段后，将所 得片段插入在裂解基因之前。
[0009] 优选地，所述启动子PmgtA或同时含有启动子PmgtA和5 ' -URT的片段，来自大肠杆菌 E.coli BL21(DE3)。
[0010] 优选地，所述扩增裂解基因所用引物序列如SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.4所示;所述 扩增启动子PmgtA所用引物序列如SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.6所示;所述扩增同时含有启动 子PmgtA和5'-URT的片段所用引物序列如SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.8所示。
[0011] 本发明的另一目的在于提供一种利用所述重组载体控制大肠杆菌自裂解的方法， 该方法是构建所述重组载体后，将所得的重组载体导入到宿主细胞中获得重组细胞，培养 重组细胞并通过控制培养基中Mg 2+离子浓度来控制重组细胞的裂解。
[0012] 所述方法的步骤如下：
[0013] 1)以大肠杆菌E.coli BL21(DE3)的基因组为模板，通过PCR反应扩增裂解基因 SRRz，并将所得的基因 SRRz扩增产物连接到质粒载体pBAD18上，获得包含裂解基因质粒；
[0014] 2)扩增启动子PmgtA或同时含有启动子PmgtA和5 ' -URT的片段，获得启动子片段；
[0015] 3)将步骤2)所得的启动子片段插入到步骤1)所得的包含裂解基因质粒中裂解基 因之前，获得重组载体；
[0016] 4)将步骤3)所得重组载体导入到宿主细胞中，获得重组细胞；
[0017] 5)利用含有Mg2+的培养基培养步骤4)所得的重组细胞，通过降低培养基中Mg 2+浓 度诱导细胞裂解，或通过提高或保持培养基中Mg2+浓度，防止细胞裂解。
[0018] 优选地，步骤1)所述扩增裂解基因 SRRz，所用引物序列如SEQ ID NO. 3-SEQ ID NO.4所示；步骤2)所述扩增启动子PmgtA所用引物序列如SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.6所示;所 述扩增同时含有启动子PmgtA和5'-URT的片段所用引物序列如SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.8所 /Jn 〇
[0019] 优选地，步骤4)所述降低培养基中Mg2+浓度诱导细胞裂解，使用启动子PmgtA时，是 将培养基中的Mg 2+浓度控制在0.5mM以下，使用启动子PmgtA-UTR时，是将培养基中的Mg2+浓度 控制在10μΜ以下;所述提高或保持培养基中Mg 2+浓度，使用启动子PmgtA时，是将培养基中的 Mg2+浓度控制在0.5mM以上，使用启动子PmgtA-UTR时，是将培养基中的Mg 2+浓度控制在10μΜ以 上。
[0020] 所述重组载体在细胞产物回收过程中的应用。
[0021] 本发明获得的有益效果：
[0022] 1.本发明提供的大肠杆菌低Mg2+诱导的重组载体及其构建方法和使用方法，该方 法首次利用启动子P mgtA或启动子PmgtA和5'_URT，在不同的Mg2+浓度条件下诱导裂解基因的 表达。
[0023] 2.本发明提供的基因改造方法构建的重组载体和重组菌在低Mg2+条件下，裂解效 率可以1小时内达到100 %。
[0024] 3.本发明构建的低Mg2+诱导裂解大肠杆菌的重组载体的裂解过程受环境中Mg 2+的 控制，避免了使用昂贵的诱导剂，降低了实验成本。
[0025] 定义和缩写
[0026] 在本文中使用下列的缩写或简称：
[0027] 异丙基硫代半乳糖苷：IPTG
[0028] λ噬菌体裂解基因 ：SRRz
[0029] 大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli) :E.coli
[0030] 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction) :PCR
【具体实施方式】
[0031] 下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
[0032] 以下实施例中所用材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域中的常规 材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得。
[0033] 所用限制性内切酶及T4DNA连接酶均购自MBI Fermentas公司，质粒提取及胶回收 所用试剂盒购自美国OMEGA公司，操作步骤按照产品说明书进行;所有培养基如无特别说明 均用去离子水配制。
[0034]培养基配方：
[0035] I) LB液体培养基：1 %胰蛋白胨，0.5 %酵母提取物，1 % NaCl。
[0036] 2) LB固体培养基：1 %胰蛋白胨，0.5 %酵母提取物，1 % NaCl，1.5 %琼脂粉。
[0037] 3 )M9培养基：1.0g/L氯化铵，15.2g/L磷酸氢二钠，3g/L磷酸二氢钾，0.5g/L氯化 钠，20g/L葡萄糖。
[0038] 4)微量元素：（NH4)6M〇7〇24.4H2〇:3.7g/L H3B03:24.7g/L MnCl2.4H2〇: 15.8g/L ZnS〇4 · 7H20:2 · 9g/L CuS〇4 · 5H20:2 · 5g/L。
[0039] 实施例1重组菌株的构建
[0040] 本发明利用分子克隆转导技术，构建重组质粒PBAD18-SRRz，PBAD18-P mgtA-SRRz， PBADi8-PmgtA-UTR-SRRz，构建突变菌株 Q2537、Q2582和 Q2549.
[0041]本领域技术人员应该理解，上述各个步骤均按照标准的分子克隆技术进行。
[0042] 1.1重组菌株Q2537的构建
[0043] 1)以大肠杆菌E. Co I i BL21 (DE3)基因组为模板，设计引物扩增SRRz基因，引物序 列如下:SRRz-5' ：
[0044] 5 '-CGAGCTCAAGGAGATATAATGCCAGAAAAACATGACCT-3 '
[0045] SRRz-3，：
[0046] 5 '-AAAACTGCAGCTATCTGCACTGCTCATTAAT-3 '
[0047] 2)利用SacI、PstI分别双酶切基因 SRRz和载体PBAD18，酶切片段回收后，T4DNA连接 酶连接，转化DH5a感受态后过夜培养，筛选含有重组质粒PBAD 18-SRRz的阳性克隆，将该阳性 重组菌命名为Q2537.
[0048] 1.2重组菌株Q2582的构建
[0049] 1)以大肠杆菌E.coli(DE3)基因组为模板，设计引物扩增基因片段PmgtA，引物序列 如下：PmgtA -5 ' ：
[0050] 5 '-CGAGCTCCATAGATGCTACGAATATTATTG-3 '
[0051] pMgtA-3'：
[0052] 5'-CGAGCTC GCGATATAATACCTGCTGGC-3'
[0053] 2)利用SacI分别酶切基因 PmgtA和载体PBAD18- SRRz，酶切片段回收后，T4DNA连接酶 连接，转化DH5a感受态后过夜培养，筛选含有重组质粒pBAD18-PmgtA-SRRz的阳性克隆，将该 阳性重组菌命名为Q2582.
[0054] 1.3重组菌株Q2549的构建
[0055] 1)以大肠杆菌E. coli(DE3)基因组为模板，设计引物扩增基因片段PmgtA_UTR，引物 序列如下：
[0056] pMgtA-5'：
[0057] 5 '-CGAGCTCCATAGATGCTACGAATATTATTG-3 '
[0058] pMgtA-UTR-3'：
[0059] 5'-CGAGCTC AAGGAGTCCCTCCGCACTGT-3'
[0060] 2)利用SacI分别酶切基因 PmgtA和载体PBAD18- SRRz，酶切片段回收后，T4DNA连接酶 连接，转化DH5a感受态后过夜培养，筛选含有重组质粒pBAD18-PmgtA-UTR-SRR z的阳性克隆， 将该阳性重组菌命名为Q2549.
[0061 ] 实施例2
[0062] 2.1重组菌裂解效率的检测
[0063] 1)将对照菌株大肠杆菌DH5a、工程菌株Q2537、Q2582和Q2549分别接种至3mL LB液 体培养基中，菌株Q2537的试管中加入50yg/mL卡那霉素3yL，菌株Q2582和Q2549的试管中加 入 50yg/mL 卡那霉素 3yL 和 lmol/L 的 MgS〇4 溶液 30yL，37°C 生长 8-12h。
[0064] 2)收集菌液，分别加入1.5mL无菌水洗两遍。
[0065] 3)使用M9培养基重悬菌液，将两株菌的重悬菌液分别取500yL，置于不同离心管 中。其中，对照菌株大肠杆菌DH5a、工程菌株Q2537、Q2582和Q2549，四株菌按照低浓度、中浓 度和高浓度实验组添加 MgSO4溶液，其中，低浓度实验组中Mg2+的终浓度控制在ΙΟμΜ;中浓度 实验组中Mg 2+的终浓度控制在0.5mM，高浓度实验组中Mg2+的终浓度控制在0.5mM以上。其 中，每个实验组菌设有不添加 MgSO4溶液的空白对照组。
[0066] 4)将所有离心管置于37°C摇床培养lh，在培养过程中，高浓度浓度实验组的镁离 子浓度始终高于0.5mM，中浓度实验组的镁离子浓度下降并保持在10μΜ-0.5mM之间，而低浓 度实验组在培养过程中不对镁离子浓度进行控制，镁离子浓度始终在1〇μΜ以下；
[0067] 5)取步骤4)所得培养液，重悬后取菌液IOOyL分别稀释至HT6倍，各取30yL涂布在 含有IOmM Mg2+的LB平板，37°C过夜培养后单克隆计数。
[0068] 6)根据平板上生长出的菌落数，计算裂解效率。
[0069] 裂解效率=菌体诱导后平板菌落数/菌体未诱导平板菌落数
[0070] 在的M9基本培养基中培养Ih后，重组菌株Q2537最佳的裂解率为91.3%~92.5%， 菌株Q2582的在中浓度实验组中的裂解率最优，为94.2%~97.1 %，菌株Q2549在低浓度实 验组中的裂解率最优，为98.3%~100%，大肠杆菌E. coli DH5a未表现出裂解性。而在其他 没有添加镁离子的空白对照组中，菌株Q2549的裂解率达到90%，其余空白对照组的裂解率 均低于50%。
[0071] 虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此 技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保 护范围应该以权利要求书所界定的为准。
【主权项】
1. 一种通过镁离子诱导大肠杆菌裂解的重组载体，其特征在于，包括连接在原始质粒 上的λ噬菌体裂解基因 SRRz和插入在裂解基因之前的启动子PmgtA或同时含有启动子PmgtA和 5'_URT的片段;所述λ噬菌体裂解基因 SRRz来源于大肠杆菌，其中，基因 S的GenbanK ID为 8182761，基因 R的GenbanK ID为8182762,基因 Rz的GenbanK ID为8182763;所述Ρ_Α启动子 的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示;所述同时含有启动子PmgtA和5 ' -URT的片段的核苷酸序 列如SEQ ID NO.2所示。2. 含有权利要求1所述重组载体的基因工程菌。3. -种权利要求1所述重组载体的构建方法，其特征在于，以大肠杆菌基因组为模板， 通过PCR反应扩增λ噬菌体裂解基因 SRRz，再将获得的扩增产物后连接到质粒载体pBAD18上， 再通过PCR反应扩增启动子PmgtA或同时含有启动子P mgtA和5'-URT的片段后，将所得片段插入 在λ噬菌体裂解基因 SRRz之前。4. 如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述启动子PmgtA或同时含有启动子PmgtA 和5 '-URT的片段，来自大肠杆菌E · coli BL21 (DE3)。5. 如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述λ噬菌体裂解基因 SRRz所用引物序 列如SEQIDN0.3-SEQIDN0.4所示；所述扩增启动子PmgtA所用引物序列如SEQIDN0.5-SEQIDN0.6所示;所述扩增同时含有启动子P mgtA和5'-URT的片段所用引物序列如SEQID N0.7-SEQIDN0.8K*。6. -种利用权利要求1所述重组载体控制大肠杆菌自裂解的方法，其特征在于，构建权 利要求1所述的重组载体后，将所得的重组载体导入到宿主细胞中获得重组细胞，培养重组 细胞并通过培养基中Mg 2+离子浓度来控制重组细胞的裂解。7. 如权利要求6所述方法，其特征在于，步骤如下： 1) 以大肠杆菌E. coli BL21 (DE3)的基因组为模板，通过PCR反应扩增λ噬菌体裂解基因 SRRz，并将所得的λ噬菌体裂解基因 SRRz扩增产物连接到质粒载体pBAD18l，获得包含裂解 基因质粒； 2) 扩增启动子PmgtA或同时含有启动子PmgtA和5'-URT的片段，获得启动子片段； 3) 将步骤2)所得的启动子片段插入到步骤1)所得的包含裂解基因质粒中裂解基因之 前，获得重组载体； 4) 将步骤3)所得重组载体导入到宿主细胞中，获得重组细胞； 5) 利用含有Mg2+的培养基培养步骤4)所得的重组细胞，通过降低培养基中Mg2+浓度诱导 细胞裂解，或通过提高或保持培养基中Mg 2+浓度，防止细胞裂解。8. 如权利要求7所述方法，其特征在于，步骤1)所述扩增裂解基因，所用引物序列如SEQ IDN0.3-SEQIDN0.4所示;步骤2)所述扩增启动子PmgtA所用引物序列如SEQIDN0.5-SEQ IDN0.6所示；所述扩增同时含有启动子PmgtA和5'-URT的片段所用引物序列如SEQID N0.7-SEQIDN0.8K*。9. 如权利要求7所述方法，其特征在于，步骤5)所述降低培养基中Mg2+浓度诱导细胞裂 解，使用启动子Pm gtA时，是将培养基中的Mg2+浓度控制在0.5mM以下，使用启动子PmgtA-UTR时， 是将培养基中的Mg 2+浓度控制在ΙΟμΜ以下;所述提高或保持培养基中Mg2+浓度，使用启动子 PmgtA时，是将培养基中的Mg2+浓度控制在0.5mM以上，使用启动子PmgtA-UTR时，是将培养基中 的Mg 2+浓度控制在ΙΟμΜ以上。10.权利要求1所述重组载体在细胞产物回收过程中的应用。
【文档编号】C12N1/21GK105861533SQ201610224643
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月12日
【发明人】赵广, 姚岚, 冯新军, 咸漠, 刘会洲
【申请人】中国科学院青岛生物能源与过程研究所