专利名称：高效裂解大肠杆菌的裂菌制剂及其裂解方法、用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物技术领域的裂菌制剂的制备方法，具体涉及一种高效裂解大肠杆菌的裂菌制剂及其裂解方法、用途。
背景技术：
大肠杆菌主要寄生在人和动物的肠道内，大多数是肠道的正常菌群，但在特定的条件下可成为致病菌，致肠道内致病和肠道外致病，表现为腹泻、出血性肠炎、败血症、禽类的气囊炎、关节滑膜炎和肉芽肿等。其中肠道内致病的典型血清型代表是0157，它是肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli, EHEC)的一个主要血清型，是食源性人兽共患病原菌，它可通过污染的食品而引起人的食物中毒，严重的可致人死亡，因此研制杀灭大肠杆菌的高效制剂在公共卫生方面具有重要的意义。目前能够杀灭细菌的主要包括多种消毒剂、防腐剂、抗生素、抗代谢物等。然而，随着这些药物的广泛应用，不但产生了大量的药物残留，细菌的多重耐药、高剂量耐药等也越来越严重，且细菌的耐药菌株的传播进一步加剧，从而增加了对环境和人类的威胁。因此科学家们一直在探索新的杀灭细菌的制剂。噬菌体是侵害细菌的病毒，不但能够介导宿主菌生物学特性的改变，还能够影响宿主菌的繁殖周期，决定宿主菌的溶原和裂解状态。裂解性噬菌体中裂解酶具有特异性水解宿主细菌细胞壁，破坏细菌细胞壁的完整性，从而杀灭细菌。噬菌体编码的裂解酶像噬菌体一样只能攻击特定的细菌，具有较高的特异性。而且裂解酶作用于细菌的速度极快，以致于细菌不会对该酶产生抗性，且噬菌体的裂解酶有比噬菌体更为广泛的抗菌谱，因此从噬菌体裂解酶的角度来筛选杀灭细菌的制剂，是目前抗菌制剂中的新方向。迄今噬菌体裂解酶的研究主要集中在对革兰氏阳性菌的裂菌作用，例如链球菌、炭疽杆菌、结核分枝杆菌等的裂解酶的研究相对较多，而对革兰氏阴性菌，特别是大肠杆菌噬菌体裂解酶的研究尚未有报道。由于不同的噬菌体具有不同的裂解酶序列，即使是相同的基因序列在不同的噬菌体也会发挥不同的作用，且有的基因在体外表达还会受到很多条件的限制，从而阻碍了筛选真正具有裂菌作用的裂菌剂。本发明通过比较大肠杆菌0157噬菌体Min27的基因组系列，筛选多个特定的序列片段，通过修饰，进行原核表达、诱导和纯化，获得了有活性的裂菌制剂，可对多种血清型的大肠杆菌具有裂解作用。
发明内容
本发明的目的在于筛选具有特定的裂菌作用的基因，通过构建原核表达系统，筛选到具有裂解活性的重组表达产物，确定影响表达产物活性的最优裂解条件，提供一种能够裂解多种血清型大肠杆菌的裂菌制剂及其裂解方法、用途。本发明的目的是通过以下的技术方案实现的 本发明涉及一种高效裂解大肠杆菌的裂菌制剂，所述裂菌制剂是通过如下方法制备而得的
步骤一，通过噬菌体诱导的方法，诱导大肠杆菌溶原菌株，获得裂解性噬菌体颗粒，纯化得到噬菌体，提取噬菌体的DNA ；步骤二，设计引物，以步骤一所得DNA为模板，应用PCR扩增相应的基因片段；步骤三，采用原核表达系统pET_28a ( + )，将步骤二扩增所得DNA构建重组质粒；步骤四，将步骤三的重组质粒转化到表达菌BL2KDE3)，筛选阳性转化子进行蛋白的诱导表达和鉴定，获得重组蛋白；步骤五，纯化诱导表达的重组蛋白，筛选具有裂解活性的重组表达蛋白，得到蛋白制剂，即高效裂解大肠杆菌的裂菌制剂。优选地，步骤二中所述引物的核苷酸序列为，上游CGCGGATCCATGAGCAGGAAACTCCG,下游CCCAAGCTTTTATCTGTCGATTCCCC。优选地，步骤二中所述扩增基因片段为534bp。优选地，步骤四中获得的重组蛋白为23kDa。优选地，步骤五中所述筛选具有裂解活性的重组表达蛋白具体为将获得的纯化的重组蛋白、阳性转化子的细菌裂解液进行平板裂解实验，比较裂菌效果，从而筛选具有裂解活性的重组表达蛋白。本发明还涉及一种前述的高效裂解大肠杆菌的裂菌制剂的裂解方法，所述裂解方法采用的还原剂为质量百分比浓度为0. 8%的P -巯基乙醇或IOmM的半胱氨酸，缓冲液为20mM pH5. 2醋酸钠缓冲液，裂解菌液的pH值为8. 0，反应温度为37°C。本发明还涉及一种前述的高效裂解大肠杆菌的裂菌制剂的用途，所述裂解制剂用作裂解不同血清型大肠杆菌菌株的裂解制剂。优选地，所述血清型大肠杆菌菌株为大肠杆菌046、0118、0138、0157和MC1061菌株。本发明的原理在于通过序列比对，设计2对可能的引物，采用PCR扩增溶原性大肠杆菌Min27中诱导的裂解性噬菌体Min27的可能的裂解酶基因，获得目的片段，再将目的片段与pET-28a ( + )载体连接，得到重组表达质粒pET-28a ( + )，导入大肠杆菌BL21 (DE3)表达，获得阳性转化子 BL21 (DE3) /pET-28a ( + )_P1 和 BL21 (DE3)/pET_28a ( + )_P2，通过诱导，表达重组的融合蛋白，经过Ni柱纯化和加入还原剂复性，获得纯化的重组蛋白，具有裂菌活性，命名为LysEC，该制剂可以裂解多种不同血清型的大肠杆菌，而不裂解其他肠道菌，且裂解活性高。与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果本发明通过原核表达系统和平板裂菌实验，筛选出具有裂菌活性的重组表达蛋白LysEC，可在体外高效、特异性裂解多种血清型的大肠杆菌。
图I为采用SDS-PAGE鉴定纯化的重组表达蛋白LysEC的示意图；图2为纯化的重组蛋白LysEC平板裂解实验示意图。
具体实施例方式下面结合附图对本发明的实施例作详细说明本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下面实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook 等分子克隆实验室手册(New York Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例I、噬菌体的诱导和噬菌体DNA的制各通过噬菌体诱导的方法，诱导大肠杆菌溶原菌株，获得裂解性噬菌体颗粒，纯化得到噬菌体，提取噬菌体的DNA ;具体操作如下将大肠杆菌0157Min27株接种5mL LB液体培养基，37°C振荡过夜后，以I : 4的体积比加入新鲜LB液体培养基中，再加入丝裂霉素C至终浓度I. 0 ii g/mL,继续振摇14h后，加入0. 1%的氯仿后再振摇15min,4000g离心IOmin,上清液过滤除菌,滤液中即含Stx2曬菌。将MC1061加入LB培养基中进行倍比稀释lO'lO'lO—6，分别取200 ill噬菌体稀释液% 200 u I宿主菌混匀，并加入lmol/L CaCl2至终浓度0. lmol/L，37。。孵育15min后，将混 合液加入与己熔化的顶层琼脂中混匀，倒入含有底层琼脂的平板上，待上层琼脂凝固后，置于37°C温箱培养10_12h，观察噬菌斑形态。将单个噬菌斑扩大培养后，收集噬菌体悬液。噬菌体悬液中入加蛋白酶K至终浓度50 U g/ml，37°C温育30分钟，再加入SDS至终浓度0. 5%，混匀，56°C温育I小时。用等体积Tris平衡酚(pH8. 0)进行抽提，4000g离心10分钟，收集上层水相。用等体积氯仿再次抽提，5000g离心10分钟，收集上层水相，并转移至另一个离心管中。在回收的水相中加入3mol/L乙酸钠至终浓度0. 3mol/L，再加两倍体积的无水乙醇轻轻洗涤，12000g离心10分钟，弃上清，用适量TE溶解沉淀，获得噬菌体DNA。实施例2，设计2对引物引物，PCR扩增目的基因片段设计2对引物Pl和P2，以实施例I所得DNA为模板，应用PCR扩增相应的基因片段，确定基因的扩增片段为534bp和501bp ;具体操作如下根据GenBank中大肠杆菌0157Min27噬菌体的DNA序列(NC_010237)，设计2对引物引物，引物序列见表1，分别扩增2个基因区段，引物I扩增的位置在1-534，引物2扩增的位置34-534位氨基酸处，在上下游引物的5’端分别引入BamH I和Hind III酶切位点。以噬菌体DNA为模板，按照常规方法进行目的基因片段的扩增，反应结束后，取5 u L产物进行琼脂糖凝胶电泳。利用PCR产物回收试剂盒回收PCR产物。表IPCR引物序列
物名称处物序列(5'-3 T傷巧川途
Pl CGCGG^CCATGAGCAGGAAACTCCG1-17扩 Jfl 片段 534bp
P2 CGCGGATCCGCCGTTCTGGCGCTGAT34-50纩增片段501 bp
h■游引物 CCCAAGCTTTTATCTGTCGATTCCCC526-534通丨Tl 卜—游实施例3,重组质粒的构津采用原核表达系统pET_28a ( + )，将实施例2扩增所得DNA构建重组质粒，进行序列分析和比对，确定获得正确序列的重组质粒pET-28a ( + )-Pl和pET-28a ( + )P2 ;具体操作如下
将实施例2的PCR扩增产物连接到pMD-18T载体(Takara公司)上测序。所设计的引物上游包含BamH I限制性酶切位点，下游包含Hind III限制性酶切位点。将BamHI和Hind III酶切PCR产物和pET-28a ( + )，T4DNA连接酶(Takara公司)10 16°C过夜连接。连接产物转入大肠杆菌DH5 a中，37°C过夜培养，提取质粒。用BamH I和Hind III酶切鉴定，鉴定的阳性重组质粒测序，分别获得阳性重组质粒pET-28a ( + )-Pl和pET-28a ( + )_P2。实施例4，重组质粒的原核表达将实施例3的重组质粒pET_28a ( + ) -Pl和pET_28a ( + ) _P2转化到表达菌BL21(DE3 )，筛选阳性转化子 BL21 (DE3) /pET_28a (+ ) -PI 和 BL21 (DE3) /pET_28a (+ ) -P2 进行蛋白的诱导表达和鉴定，获得的重组蛋白，确定其蛋白分子量分别为23kDa和22kDa ;具体操作如下提取阳性重组质粒DNA，转入大肠杆菌BL21 (DE3)中。分别获得阳性转化子BL21 (DE3) /pET-28a ( + ) -Pl 和 BL21 (DE3) /pET_28a ( + ) -P2,分别挑取 I 个菌落接种 2ml 卡那霉素LB培养基过夜培养。取5mL过夜培养菌液接种IL卡那霉素LB培养基，37°C 140rpm振荡培养3至4小时，至OD6tltl约为I. O。加入1000mmol/L的异丙基-P -D-硫代半乳糖苷(IPTG) 100 u L至终浓度为lmmol/L, 27°C 80rpm振荡培养4h。取Iml菌液12000rpm离心Imin,弃上清，沉淀加入20 ii L蒸馏水重悬，再加入20 y L 2 X SDS-PAGE上样缓冲液混匀，100°C沸水浴IOmin后进行SDS-PAGE凝胶电泳，通过SDS-PAGE电泳检测重组蛋白表达情况。诱导的含pET-28a空载体菌做如上处理后作为对照进行SDS-PAGE电泳，获得的融合重组蛋白分别为23kDa和22kDa。实施例5,融合蛋白的纯化纯化诱导表达的重组蛋白，得到蛋白制剂；具体操作如下IPTG诱导的细菌IL溶于25mL预冷的裂解缓冲液(含50mM磷酸钠缓冲液，pH8. 0)，超声破碎。8000g离心取上清。以8个柱体积的裂解缓冲液洗Ni柱，将样品上至柱内，再用预冷的裂解缓冲液洗柱，直至OD28tl < 0. I。用预冷的清洗缓冲液A (裂解缓冲液加5mM咪唑)洗柱，直至OD28tl < 0. I。用预冷的清洗缓冲液B (裂解缓冲液加20mM咪唑)洗柱，直至OD280 < 0. I。最后用溶出液(裂解缓冲液加250mM咪唑)洗柱，收集洗脱液，即为纯化的重组蛋白。图I为采用SDS-PAGE鉴定纯化的重组表达蛋白LysEC的示意图，由图I可知1是诱导的细菌的表达产物；2是标准Marker蛋白；3是未诱导的细菌产物；4是细菌诱导产物的纯化获得重组蛋白，由图可以看出阳性转化子BL21 (DE3)/pET-28a ( + )P1的诱导产物纯化后可以得到纯度很高的纯化重组蛋白。实施例6,平板裂菌实验将实施例5获得的纯化的重组蛋白、阳性转化子BL21 (DE3)/pET_28a ( + )P1和BL21 (DE3)/pET-28a ( + )_P2的细菌裂解液进行平板裂解实验，比较裂菌效果，筛选具有裂解活性的重组表达蛋白，确定BL21 (DE3)/pET-28a ( + )_P1的表达产物具有裂菌活性，将其命名为LysEC ;具体操作如下200ml 表达菌 BL21/pET28a-Pl、BL21/pET28aP2 以及空载体菌 BL21/pET28a 在27°C诱导4小时后离心，用5ml IOmM的无菌PBS缓冲液(pH 7. 2)重悬后超声破碎。超声功率为300-400W，工作5s，间隔15s，120个循环。获得裂解液做平板裂解试验。将新鲜培养的大肠杆菌MC1061菌清洗后的细菌加入0. 65%融化的琼脂糖中混匀，混合物倒入平皿中，冷却后在平皿上打孔，每孔直径10mm。分别滴加50iU空载体裂解液、50 引物I的细菌裂解液、引物2的细菌裂解液，37°C温箱培养直至观察到培养基上出现的透明抑菌圈。结果显示BL21 (DE3)/pET-28a ( + )-Pl的原核表达产物显示有裂菌效果，而BL21 (DE3)/pET-28a ( + )_P2的原核表达没有裂菌效果，将BL21 (DE3)/pET_28a ( + )-Pl的重组表达产物命名为LysEC，即为裂菌制剂。图2为纯化的重组蛋白LysEC平板裂解实验示意图，由图2可知A BL21 (DE3)/pET-28a ( + )-P2的细菌裂解液对大肠杆菌指示剂菌没有裂解作用；B BL21 (DE3)/pET_28a( + )-Pl的细菌裂解液对大肠杆菌指示剂菌有裂解作用；B:BL21 (DE3)/pET-28a ( + )_P1的诱导表达产物的纯化物对大肠杆菌指示剂菌的裂解作用最强。实施例7，裂菌制剂LysEC最佳裂解条件的确定探索实施例5获得的纯化重组蛋白LysEC发挥活性的最佳条件；具体操作如下 最佳裂解条件的测定包括还原剂浓度、缓冲液成分、pH值、裂解温度等测定方法采用池度递减试验，确定最佳裂解条件。lmg/ml LysEC纯化蛋白，分别加入0. 5%、0. 8%、
I.0%、3. 0% 和 5. 0% (V/V) ^ -巯基乙醇；lmg/ml LysEC 纯化蛋白分别加入 lmM、2mM、4mM、5mM、8mM、10mM、15mM 半胱氨酸；或用 20mM/L 为 pH4. O、pH6. O、pH8. O、pH10. O、pH12. 0 和PH14. 0磷酸钠缓冲液进行重悬菌液，并调成OD6tltl约为I. 0 ;或用20mMpH5. 2醋酸钠缓冲液、IOmM pH6. 8磷酸盐缓冲液、IOmM pH7. 2磷酸盐缓冲液、20mM pH8. 5Tris-Cl缓冲液重悬菌液；或将细菌悬液IOOiU与100 ill纯化后的裂解剂混合，分别放置在4°C、18°C、25°C、37°C、42°C。每个实验各做3个重复，裂解缓冲液作为空白对照。室温下反应30min后，在600nm处读取吸光度。取吸光度减少最大的作为最佳裂解最佳条件。P _巯基乙醇浓度为0. 8% ;半胱氨酸最佳浓度为IOmM ;最佳反应缓冲液为20mM pH5. 2醋酸钠缓冲液；最佳裂解效果的为裂解菌液的PH值为8. 0 ;裂解酶最佳反应温度为37°C。实施例8,裂菌制剂LysEC裂解活件测定实施例5获得的纯化重组蛋白LysEC的酶活性；具体操作如下以新鲜培养的大肠杆菌12000rmp离心2min,弃上清,预冷的IOmM PBS (pH7. 2)洗两遍后重悬，调OD6tltl为I. O。纯化重组蛋白的浓度为lmg/ml的LysEC，用IOmM PBS(pH7. 2)在96孔板中进行倍比稀释，终体积为100 yl，每个稀释孔中加入IOOiU细菌悬液，每个稀释度3个重复，细菌悬液加IOmM PBS (pH7. 2)作为空白对照，在600nm处读取吸光度，记录初始值。96孔板置37°C，放置50min，600nm处读取吸光度，记录反应后的吸光值，计算浊度下降，可使细菌浊度下降50%的酶的最高稀释度的倒数即定义为该蛋白酶的活性(unit/mg)。在37°C条件下，当原浓度为lmg/ml的LysEC稀释倍数为I :3200时，大肠杆菌0157的0D600值下降50%，因此，LysEC的活性为3200u/mg，每单位所含的LysEC量为0. 31 y g。实施例9,裂菌制剂LysEC裂菌谱测定实施例5获得的纯化重组蛋白LysEC的裂菌谱的范围；具体操作如下将生长至对数生长期的沙门氏菌、金黄色葡萄球、链球菌、大肠杆菌046、0118、0138、0157和MC1061等菌株离心后分别用20mM pH7. 2PBS (磷酸钠)缓冲液重悬，调节成OD600为I. O。稀释后的细菌悬液分别加入96孔板中，每孔100 iil，做四个重复。将终浓度为I. 25 ii g/ml的LysEC裂菌制剂100 U I加入细菌混悬液中。每株细菌各做3个重复，剩下一孔加入20mM pH7. 2磷酸钠缓冲液IOOul作为空白对照。37°C下震荡反应50min后，在吸光波长600nm处读取吸光度值。以细菌浊度下降50%为裂解阳性标准，检测LysEC对沙门氏菌、金黄色葡萄球、链球菌、大肠杆菌046、0118、0138、0157和MC1061等菌株的裂解作用。结果裂解酶LysECl只对不同血清型的大肠杆菌菌株具有裂解作用，对革兰氏阴性菌如沙门氏菌、3种革兰氏阳性菌包括金黄色葡萄球和链球菌均无裂解活性(见表2)。LysEC对6株大肠杆菌的裂解效率可以达到51% 73%，而对于其它菌株裂解效率均不高于10%。表2LysEC的裂菌谱测定
权利要求
1.一种高效裂解大肠杆菌的裂菌制剂，其特征在于，所述裂菌制剂是通过如下方法制备而得的 步骤一，通过噬菌体诱导的方法，诱导大肠杆菌溶原菌株，获得裂解性噬菌体颗粒，纯化得到噬菌体，提取噬菌体的DNA ； 步骤二，设计引物，以步骤一所得DNA为模板，应用PCR扩增相应的基因片段； 步骤三，采用原核表达系统pET-28a ( + )，将步骤二扩增所得DNA构建重组质粒； 步骤四，将步骤三的重组质粒转化到表达菌BL2KDE3)，筛选阳性转化子进行蛋白的诱导表达和鉴定，获得重组蛋白； 步骤五，纯化诱导表达的重组蛋白，筛选具有裂解活性的重组表达蛋白，得到蛋白制齐U，即高效裂解大肠杆菌的裂菌制剂。
2.根据权利要求I所述的高效裂解大肠杆菌的裂菌制剂，其特征在于，步骤二中所述引物的核苷酸序列为，上游CGCGGATCCATGAGCAGGAAACTCCG，下游CCCAAGCTTTTATCTGTCGATTCCCC。
3.根据权利要求2所述的高效裂解大肠杆菌的裂菌制剂，其特征在于，步骤二中所述扩增基因片段为534bp。
4.根据权利要求I和2所述的高效裂解大肠杆菌的裂菌制剂，其特征在于，步骤四中获得的重组蛋白为23kDa。
5.根据权利要求I所述的高效裂解大肠杆菌的裂菌制剂，其特征在于，步骤五中所述筛选具有裂解活性的重组表达蛋白具体为将获得的纯化的重组蛋白、阳性转化子的细菌裂解液进行平板裂解实验，比较裂菌效果，从而筛选具有裂解活性的重组表达蛋白。
6.一种根据权利要求I所述的高效裂解大肠杆菌的裂菌制剂的裂解方法，其特征在于，所述裂解方法采用的还原剂为质量百分比浓度为0. 8%的P -巯基乙醇或IOmM的半胱氨酸，缓冲液为20mM pH5. 2醋酸钠缓冲液，裂解菌液的pH值为8. 0，反应温度为37°C。
7.一种根据权利要求I所述的高效裂解大肠杆菌的裂菌制剂的用途，其特征在于，所述裂解制剂用作裂解不同血清型大肠杆菌菌株的裂解制剂。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述血清型大肠杆菌菌株为大肠杆菌·046、0118、0138、0157 和 MC1061 菌株。
全文摘要
本发明公开了一种高效裂解大肠杆菌的裂菌制剂及其裂解方法、用途。设计引物，采用PCR扩增溶原性大肠杆菌中诱导的裂解性噬菌体的裂解酶基因，获得目的片段，再将目的片段与pET-28a(+)载体连接，得到重组表达质粒，导入大肠杆菌BL21(DE3)表达，获得阳性转化子，通过诱导，表达重组的融合蛋白，纯化诱导得纯化的重组蛋白，筛选具有裂解活性的重组表达蛋白，即得所述裂菌制剂。所述裂解方法为pH 8.0，37℃，采用的还原剂为质量百分比浓度为0.8%的β-巯基乙醇或10mM的半胱氨酸，缓冲液为20mM pH5.2醋酸钠缓冲液。本发明获得的裂菌制剂对多种血清型大肠杆菌的裂解特异性强、裂解效率高，可有效杀灭大肠杆菌。
文档编号C12N15/70GK102703491SQ201210162640
公开日2012年10月3日 申请日期2012年5月23日 优先权日2012年5月23日
发明者严亚贤, 孙建和, 杨曦 申请人:上海交通大学