专利名称：混合微生物核酸的提取方法
技术领域：
本发明涉及一种生物技术领域，尤其涉及一种混合微生物核酸的提取方法。
背景技术：
近年来在医院内感染性疾病中不同类型病原体(如细菌与真菌、细菌与病毒、真菌或原虫与病毒)的多重感染趋于增加。多重感染严格地说，指多种病原体均是作为原发性的，且是同时发生的感染。多重感染性疾病在临床上相当常见，但由于病因复杂所以确诊甚为困难。随着分子诊断技术的发展，使聚合酶链式反应(PCR)和探针杂交等分子生物学方法以非培养方式直接检测病原体样品成为可能。分子诊断技术的第一步就是模板核酸的制 备，即样品中核酸的提取，这直接影响着检测的结果。长期以来，样品中核酸的提取和纯化一直是耗时，繁琐的过程，虽然目前病毒、细菌、支原体和衣原体等病原体的的核酸提取方法和商品化的试剂盒有很多，但是这些方法的原理和操作过程各不相同，没有一个公认的可以同时对多种病原体混合物进行核酸进行高效提取的方法。因此，如何从多种病原体混合物中高效、快捷的提取核酸进行检测反应已成为了目前分子诊断技术推广和应用的一个瓶颈。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种裂解混合微生物的试剂。本发明提供的试剂，由提取液A和提取液B组成；所述提取液A按照如下方法制备将Tris、EDTA, SDS、Tween 80、Triton X-100、Brij 58、3-[(3_胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-I-丙磺酸、十二烷基肌氨酸钠、￠-巯基乙醇和水混合，得到提取液A，所述Tris在所述提取液A中的浓度为5-20mM ;所述EDTA在所述提取液A中的浓度为5-20mM ;所述SDS、所述Tween 80、所述Triton X-100、所述Brij 58、所述3-[(3_胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-I-丙磺酸、所述十二烷基肌氨酸钠在所述提取液A中的浓度均为0. 05%-0. 2% (体积百分含量);所述P -巯基乙醇在所述提取液A中的浓度为0. 1-0. 5% (体积百分含量)；所述提取液B按照如下方法制备将水饱和酚、乙醇、吡咯烷酮混合，得到提取液B，所述水饱和酚、所述乙醇、所述吡咯烷酮的体积比为(99-98) : I: I。所述提取液A和所述提取液B均为独立包装；所述提取液A的pH值为7. 2-7. 8，所述提取液A的pH值具体为7. 5 ；所述提取液B的pH值为5-8，所述提取液B的pH值具体为7. 5。所述提取液A中，所述Tris在所述提取液A中的浓度为IOmM ；所述EDTA在所述提取液A中的浓度为IOmM ；所述SDS、所述Tween80、所述Triton X-100、所述Brij 58、所述3_[ (3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-I-丙磺酸、所述十二烷基肌氨酸钠在所述提取液A中的浓度均为0. 1%(体积百分含量)；所述￠-巯基乙醇在所述提取液A中的浓度为0. 1% (体积百分含量)；所述提取液B中，所述水饱和酚、所述乙醇、所述吡咯烷酮的体积比为98:1:1。所述混合微生物由细菌、病毒、支原体和/或衣原体组成；所述混合微生物具体由金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus Rosenbach)>柯萨奇病毒(Human coxsackievirus)A16 和解服支原体(Mycoplasma urealyticum)组成。本发明的另一个目的是提供一种裂解混合微生物提取核酸的方法，包括如下步骤先将所述的试剂中的所述提取液A、Carrier RNA和混合微生物混合，然后与所述的试剂中的所述提取液B混合，进行反应，得到反应液；离心收集上层水相，即得到混合微生物裂解液。
所述混合微生物由细菌、病毒、支原体和/或衣原体组成；所述混合微生物具体由金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus Rosenbach)>柯萨奇病毒(Human coxsackievirus)A16 和解服支原体(Mycoplasma urealyticum)组成。所述提取液A、Carrier RNA和所述提取液B的配比为(200-500) y I (5-20) U g (200-500) u I，所述提取液A、Carrier RNA和所述提取液B的配比具体为200^1 :5y g :200 u I。上述然后与所述的试剂中的所述提取液B混合的时间为2分钟，混合的方式为震荡混匀。所述反应时间为15分钟-60分钟；所述反应时间具体为60分钟；所述反应温度为55_80°C ;所述反应温度具体为65°C ；所述反应的方式为每间隔5-15秒震荡10-30秒钟；所述反应的方式具体为每间隔15秒震荡30秒钟。所述离心的温度为0_4°C ;所述离心的温度具体为4°C ；所述离心的时间为5-10分钟；所述离心的时间具体为5、8或10分钟；所述离心的转速为10000-15000rpm,所述离心的转速具体为12000rpm,离心半径为10厘米。在所述反应后和所述离心前，还包括如下步骤将所述反应液静置的步骤；所述静置温度为0-4°C，所述静置时间为2-5分钟；所述静置温度具体为4°C，所述静置时间具体为5分钟。在所述离心收集上层水相的步骤后，还包括将所述上层水相与氯仿混匀，得到混合液，离心收集上清液，得到混合微生物裂解液。所述上层水相与所述氯仿的体积比为I : (0. 8-1. 5)，所述上层水相与所述氯仿的体积比具体为1:1。所述离心的温度为0-4°C，所述离心的温度具体为4°C ；所述离心的时间为5-10分钟；所述离心的时间具体为5、8或10分钟；所述离心的转速为10000-15000rpm，所述离心的转速具体为12000rpm，离心半径为10厘米。本发明的第三个目的是提供一种混合微生物核酸的提取方法。本发明提供的方法，包括如下步骤
I)将所述的方法得到的混合微生物裂解液、浓度为3M、pH值为5. 2的NaAC水溶液、无水乙醇混匀，得到混合液，2)将步骤I)得到的混合液离心收集沉淀、75%的乙醇水溶液洗涤，干燥、得到混合微生物的核酸。步骤I)中，所述混合微生物裂解液、所述浓度为3M、pH值为5. 2的NaAC水溶液、所述无水乙醇的体积比为1:0. 1:2.5 ；步骤2)中，所述离心的转速为10000-15000rpm，离心半径为10厘米，所述离心的温度为0-4°C，所述离心的时间为10-20分钟；所述离心的转速具体为12000rpm，所述离心的温度具体为4°C，所述离心的时间具体为15分钟。步骤I)中，所述浓度为3M、pH值为5. 2的NaAC水溶液的溶剂为DEPC水。 在步骤I)后和步骤2)前还包括如下步骤将所述混合液静置的步骤；所述静置的时间为不低于30分钟，所述静置的时间具体为30分钟，所述静置的温度为不高于-15°C，所述静置的温度具体为-15°C。所述混合微生物由细菌、病毒、支原体和/或衣原体组成；所述混合微生物具体由金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus Rosenbach)>柯萨奇病毒(Human coxsackievirus)A16 和解服支原体(Mycoplasma urealyticum)组成。所述的方法在制备分子诊断产品中的应用也是本发明保护的范围。本发明的实验证明，本发明提供了一种混合微生物核酸的提取方法，能够同时从病毒、革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌、支原体和衣原体混合样品中提取核酸，其主要特定是操作简单，成本非常低，提取效果好，已经优于目前被广泛使用的市售试剂盒。
图I为甲醛变性胶电泳检测提取的核酸图2为柯萨奇病毒核酸的实时定量PCR检测图3为解脲支原体核酸的实时定量PCR检测
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。提取液A 按照如下方法制备将 Tris、EDTA, SDS、Tween 80、Triton X-100, Brij58、3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-I-丙磺酸、十二烷基肌氨酸钠、￠-巯基乙醇和水混合，得到提取液A，所述Tris在所述提取液A中的浓度为IOmM ;所述EDTA在所述提取液A中的浓度为IOmM ;所述SDS、所述Tween 80、所述Triton X-100、所述Brij 58、所述3- [ (3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-I-丙磺酸、所述十二烷基肌氨酸钠在所述提取液A中的浓度均为0. 1% (体积百分含量);所述P -巯基乙醇在所述提取液A中的浓度为0. 1% (体积百分含量);提取液B按照如下方法制备将水饱和酚、乙醇和吡咯烷酮混合，得到提取液B，所述水饱和酚、所述乙醇和所述吡咯烷酮的体积比为98:1: I。
提取液A的pH值具体为7. 5 ;提取液B的pH值具体为7. 5。实施例I、金黄色葡萄球菌、柯萨奇病毒A16和解脲支原体混合物提取核酸许多临床症状有可能是多种微生物感染甚至共感染所引起的，例如呼吸道疾病有可能是由肺炎链球菌等细菌、流感病毒等病毒、肺炎支原体/衣原体感染甚至是共感染所引起的。微生物样本金黄色葡萄球菌、柯萨奇病毒A16、解脲支原体混合样品试剂提取液A，提取液B，Carrier RNA (购自QIAGEN，产品目录号74004)，氯仿，无水乙醇，75%乙醇，pH5. 2的3M醋酸钠水溶液(NaAC)，DEPC水，灭菌水，甲醛，溴酚蓝，MOPs(出售公司 Amresco,产品目录号 Amresco M215), TBE buffer (配方 0. 09mol/L Tris-硼酸0. 002mol/L EDTA)
引物
柯萨奇病毒上游引物5’ -ACC ATG ATG GGC ACT TTT AGC A-3’
A16下游引物5’ -GGT GCA CTT GAT ATC ATT TCC-3’--
解脲支原体上游引物:5’ -GTATTTGCAATCTTTATATGTTTTCG 3,_
__下游引物5 ’ -CAGCTGATGTAAGTGCAGCATTAAATTC-3，一、核酸的提取I、微生物混合样本的获得在ImL金黄色葡萄球菌培养菌液(将金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus),购自美国ATCC，菌株号25923。)接种在脑心浸出液培养基中，培养条件为37°C过夜培养，得到金黄色葡萄球菌培养菌液)中加入ImL柯萨奇病毒A16标准毒株培养物(购买自武汉菌种保存中心)和ImL解脲支原体阳性患者脑脊液(来源于卫生部临床检验中心(NCCL)，患者知情)，得到3mL的微生物混合样本。2、混合样品核酸的提取I)裂解A、裂解取320ul的微生物混合样本，先加入200ul的提取液A和5iig Carrier RNA混合，然后再加入200ul的提取液B，在涡旋器上剧烈震荡2分钟，在震荡过程中按紧离心管的盖子，防止菌液混合物漏出。剧烈震荡结束后，将离心管放置于65°C的震荡仪中，温育I个小时，在此期间每间隔15秒剧烈震荡30秒钟。将装有裂解液离心管在冰上进行冰浴5分钟(静置温度为0°C)，然后将离心管在4°C的条件下，12000rpm进行离心5分钟。离心结束后，离心管中溶液自然分层，小心将上层水相用移液枪吸出转移至新的1.5ml的离心管中，尽量避免吸入中间的蛋白层和下层有机相溶剂。B、氯仿抽提在吸出的装有水相离心管中加入400ul的氯仿(上层水相与氯仿的体积比为I: I )，将其在涡旋震荡仪上剧烈震荡，使水相与氯仿充分混匀。将装有混合物的离心管在在4°C的条件下，12000rpm进行离心5分钟，离心半径为10厘米。离心结束后，离心管中的溶液自然分层，小心将上层水相用移液枪吸出转移至新的1.5ml的离心管中，尽量避免吸入中间的蛋白层和下层有机相溶剂，得到纯化的裂解液。2 )回收核酸(基因组DNA和RNA)将纯化的裂解液(氯仿抽提得到的溶液)转移至新的I. 5ml的离心管中，确定好溶液的体积(约300uL)，然后加入1/10体积的DEPC水配制的NaAC (3M，pH5. 2)以及2. 5倍体积的无水乙醇，在-15°C的条件下静置30分钟。将离心管立刻在4°C的条件下，12000rpm进行离心15分钟，离心半径为10厘米，用移液枪将废液全部吸走弃掉，小心避免将离心管底部的核酸吸走。加入Iml 75%的乙醇冲洗一次(用移液枪反复吹打几次)，在4°C的条件下，12000rpm进行离心5分钟。离心结束后，用移液枪将75%的乙醇全部吸走弃掉，小心避免将离心管底部的核酸吸走，从而导致实验失败。将离心沉淀至于室温(25°C)晾干，然后加入50-100uL的DEPC水使基因组DNA和·RNA充分溶解，得到核酸。但是切忌晾干之前加入DEPC水溶解基因组DNA和RNA，因为残存的乙醇可能会影响后续实验。3、试剂盒提取采用目前被广泛使用的Qiagen RNeasy Micro试剂盒(公司名称QIAGEN，产品目录号74004)提取微生物混合样本的RNA,按照Qiagen RNeasy Micro试剂盒的说明书,得到RNA。二、检测I、甲醛变性胶电泳检测提取的核酸为了提高临床样品中微量病毒或支原体的核酸回收率，因此在本发明所述方法中加入了 Carrier RNA。这些Carrier RNA有可能伴随病原体核酸被共同提取出来,因此无法通过对核酸提取产物进行吸光度测定进行定量，只能通过凝胶电泳进行初步检测和定量。A、甲醛变性胶的配置称0. 4克琼脂糖,加入30ml TBE buffer中，微波炉融化，肉眼观察无颗粒状悬浮物。冷却至约50-60°C，再加入600ul甲醛，倒入7. 5X5. Ocm的凝胶模具中。插入合适长度和宽度的梳子，室温(25 °C)放置约30min后即可使用。B、电泳检测提取的核酸取0. 3u g总量的核酸(本发明所述方法提取混合样品核酸或Qiagen RNeasyMicro试剂盒提取RNA)，加入3ul的加样缓冲液，65°C加热5min，冰上骤冷，以消除RNA的二级结构。建议上样前在加样缓冲液中加入的溴化乙锭(EtBr，浓度1.0mg/mL)，而不在胶中加EtBr，这样电泳后的背景较低。配好的I. 3%的甲醛变性胶先在I X甲醛变性胶电泳缓冲液中电泳15min。结果如图I所示，泳道I为本发明所述方法提取混合样品核酸结果，泳道2为Qiagen RNeasy Micro试剂盒提取RNA结果,可以看出利用本发明所述的方法提取的核酸的条带清晰，未发生降解现象，说明该方法提取效果良好。2、用实时定量PCR方法检测核酸提取效果因为本实验所使用的临床样品中病毒和支原体含量很低，因此提取出的病毒和支原体核酸也是微量的，无法利用传统的紫外分光光度法和凝胶电泳法检测病毒和支原体的核酸提取效果。因此，采用了更灵敏的实时定量PCR来对取出的病毒和支原体核酸进行定量。根据实时定量PCR的Ct值可以推算出样本中核酸的量，从而判断出该方法是否已经成功提取出病毒和支原体核酸。I)柯萨奇病毒核酸的实时定量PCR检测柯萨奇病毒是一种RNA病毒，因此首先将RNA通过逆转录成为cDNA,反应体系如下上述一的2提取核酸或Iul上述一的3提取的RNA特异性上游引物Iul
DEPC 水8ul特异性上游引物5’-ACC ATG ATG GGC ACT TTT AGC A-3’将其在65 °C条件下反应5分钟，立刻进行冰浴5分钟。然后进行cDNA —链的合
成,反应体系如下
BXfisrt buffer4ul
0. IM DTT2ul
dNTP (IOuM)0. 5ul
Rnasin0.2ul
DEPC 水2. 3ul
M-MLVIul将其在25°C条件下反应10分钟，然后37°C反应一个半小时，最后70V反应10分
钟反应结束。实时定量PCR反应体系如下
上述实验所得的的cDNA~ 3ul柯萨奇病毒引物上下游分别为0. 5ul
dNTP0.4ul
IOxbuffer2ul
Taq0. 2ul
灭菌水13. 4ul柯萨奇病毒引物上游引物:5，-ACCATG ATG GGC ACT TTT AGC A-3’下游引物5，-GGT GCA CTT GAT ATC ATT TCC-3’特异性引物PCR反应程序如下1940C10 min
294°C10 s
350 0C5 s
472 0C30 s
5Go to 229个循环
672°C10 min结果如表2和图2所示，表2为柯萨奇病毒核酸提取产物进行实时定量PCR检测所得到的Ct值
权利要求
1.一种裂解混合微生物的试剂，由提取液A和提取液B组成； 所述提取液A按照如下方法制备将Tris、EDTA, SDS、Tween 80、Triton X-100、Brij58、3-[(3_胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-I-丙磺酸、十二烷基肌氨酸钠、￠-巯基乙醇和水混合，得到提取液A，所述Tris在所述提取液A中的浓度为5-20mM ;所述EDTA在所述提取液A中的浓度为5-20mM;所述SDS、所述Tween 80、所述Triton X-100、所述Brij 58、所述3-[(3_胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-I-丙磺酸、所述十二烷基肌氨酸钠在所述提取液A中的浓度均为0. 05%-0. 2% (体积百分含量);所述P -巯基乙醇在所述提取液A中的浓度为0. 1-0. 5% (体积百分含量)； 所述提取液B按照如下方法制备将水饱和酚、乙醇、吡咯烷酮混合，得到提取液B，所述水饱和酚、所述乙醇、所述吡咯烷酮的体积比为(99-98 ) : I: I。
2.根据权利要求I所述的试剂，其特征在于 所述提取液A和所述提取液B均为独立包装； 所述提取液A的pH值为7. 2-7. 8，所述提取液A的pH值具体为7. 5 ； 所述提取液B的pH值为5-8，所述提取液B的pH值具体为7. 5。
3.根据权利要求I或2所述的试剂，其特征在于 所述提取液A中，所述Tris在所述提取液A中的浓度为IOmM ； 所述EDTA在所述提取液A中的浓度为IOmM ； 所述SDS、所述Tween 80、所述Triton X-100、所述Brij 58、所述3_[ (3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-I-丙磺酸、所述十二烷基肌氨酸钠在所述提取液A中的浓度均为0. 1%(体积百分含量)；所述P -巯基乙醇在所述提取液A中的浓度为0. 1% (体积百分含量)； 所述提取液B中，所述水饱和酚、所述乙醇、所述吡咯烷酮的体积比为98:1:1。
4.根据权利要求1-3中任一所述的试剂，其特征在于 所述混合微生物由细菌、病毒、支原体和/或衣原体组成； 所述混合微生物具体由金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus Rosenbach)、柯萨奇病毒(Human coxsackievirus) A16 和解服支原体(Mycoplasma urealyticum)组成。
5.一种裂解混合微生物提取核酸的方法，包括如下步骤 先将权利要求1-4中任一所述的试剂中的所述提取液A、Carrier RNA和混合微生物混合，然后与权利要求1-4中任一所述的试剂中的所述提取液B混合，进行反应，得到反应液；离心收集上层水相，即得到混合微生物裂解液。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于 所述混合微生物由细菌、病毒、支原体和/或衣原体组成； 所述混合微生物具体由金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus Rosenbach)、柯萨奇病毒(Human coxsackievirus) A16 和解服支原体(Mycoplasma urealyticum)组成。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于 所述提取液A、Carrier RNA和所述提取液B的配比为(200-500) U I (5-20) u g (200-500) u I，所述提取液A、Carrier RNA和所述提取液B的配比具体为200^1 :5y g :200 u I。
8.根据权利要求5-7中任一所述的方法,其特征在于 所述反应时间为15分钟-60分钟；所述反应时间具体为60分钟；所述反应温度为55-80°C ;所述反应温度具体为65°C ； 所述反应的方式为每间隔5-15秒震荡10-30秒钟；所述反应的方式具体为每间隔15秒震荡30秒钟。
9.根据权利要求5-8任一所述的方法,其特征在于 所述离心的温度为0-4°C ;所述离心的温度具体为4°C ； 所述离心的时间为5-10分钟；所述离心的时间具体为5、8或10分钟； 所述离心的转速为10000-15000rpm，所述离心的转速具体为12000rpm，离心半径为10厘米。
10.根据权利要求5-9中任一所述的方法，其特征在于在所述反应后和所述离心前，还包括如下步骤将所述反应液静置的步骤；所述静置温度为0-4°C，所述静置时间为2-5分钟；所述静置温度具体为4°C，所述静置时间具体为5分钟。
11.根据权利要求5-10中任一所述的方法，其特征在于在所述离心收集上层水相的步骤后，还包括将所述上层水相与氯仿混匀，得到混合液，离心收集上清液，得到混合微生物裂解液。
12.根据权利要求5-11中任一所述的方法,其特征在于 所述上层水相与所述氯仿的体积比为I :(0. 8-1. 5)，所述上层水相与所述氯仿的体积比具体为1:1。
13.根据权利要求5-12中任一所述的方法,其特征在于 所述离心的温度为0-4°C，所述离心的温度具体为4°C ； 所述离心的时间为5-10分钟；所述离心的时间具体为5、8或10分钟； 所述离心的转速为10000-15000rpm，所述离心的转速具体为12000rpm，离心半径为10厘米。
14.一种混合微生物核酸的提取方法，包括如下步骤 1)将权利要求5-13中任一所述的方法得到的混合微生物裂解液、浓度为3M、pH值为.5.2的NaAC水溶液、无水乙醇混匀，得到混合液， 2)将步骤I)得到的混合液离心收集沉淀、75%的乙醇水溶液洗涤，干燥、得到混合微生物的核酸。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于 步骤I)中，所述混合微生物裂解液、所述浓度为3M、pH值为5. 2的NaAC水溶液、所述无水乙醇的体积比为1:0. 1:2.5 ； 步骤2)中，所述离心的转速为10000-15000rpm，离心半径为10厘米，所述离心的温度为0-4°C，所述离心的时间为10-20分钟； 所述离心的转速具体为12000rpm，所述离心的温度具体为4°C，所述离心的时间具体为15分钟。
16.根据权利要求14或15所述的方法，其特征在于 步骤I)中，所述浓度为3M、pH值为5. 2的NaAC水溶液的溶剂为DEPC水。
17.根据权利要求14-16中任一所述的方法,其特征在于 在步骤I)后和步骤2)前还包括如下步骤将所述混合液静置的步骤； 所述静置的时间为不低于30分钟，所述静置的时间具体为30分钟，所述静置的温度为不高于-15°C，所述静置的温度具体为-15°C。
18.根据权利要求14-17中任一所述的方法，其特征在于 所述混合微生物由细菌、病毒、支原体和/或衣原体组成； 所述混合微生物具体由金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus Rosenbach)、柯萨奇病毒(Human coxsackievirus) A16 和解服支原体(Mycoplasma urealyticum)组成。
19.权利要求14-18中任一所述的方法在制备分子诊断产品中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种混合微生物核酸的提取方法。本发明提供的裂解混合微生物样本的试剂，由提取液A和提取液B组成。本发明的实验证明，本发明提供了一种混合微生物核酸的提取方法，能够同时从病毒、革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌、支原体和衣原体混合样品中提取核酸，其主要特定是操作简单，成本非常低，提取效果好，已经优于目前被广泛使用的市售试剂盒。
文档编号C12R1/93GK102796726SQ20121016234
公开日2012年11月28日 申请日期2012年5月23日 优先权日2011年5月24日
发明者张岩, 孙义民, 杨萍, 张亮 申请人:博奥生物有限公司, 清华大学