麦角硫因的提取及纯化方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生化制品、食品及医药技术领域，涉及一种麦角硫因的分离精制方法，尤其涉及一种从菌丝体中提取及纯化麦角硫因的方法。
【背景技术】
[0002]麦角硫因(L-Ergoth1neine，EGT)是一种稀有的天然手性氨基酸，是生物体内重要的生理活性物质，具有清除自由基、解毒、维持DNA的生物合成、细胞的正常生长、细胞免疫、抗福射、美白及抗衰老等功能，被认定是一种特有的、多功能的细胞生理保护剂，尤其在抗氧化和能量调节等方面起着重要的作用，因此麦角硫因在食品、化妆品及生物医药等行业具有广阔的应用前景。
[0003]全球营养学会首席执行官Marvin S.Hausman MD指出:由于麦角硫因能够抑制多种疾病对人体细胞和组织造成的伤害，可以视之为人体内一种重要的维生素，并可以作为膳食功能食品的一种成分(Grigat S,Harlfinger S’Pal S,et al.Probing the substratespecificity of the ergoth1neine transporter with methimazole， hercynine， andorganic cat1ns.B1chemPharmacol，2007，74:309-316.)。
[0004]实验证明，人和动物摄入麦角硫因后不会产生任何毒副作用，是通常认为安全的(generally recognized as safe, GRAS)。基于麦角硫因特殊的生物学功能和药理活性，美国OXIS国际公司推出了一款以麦角硫因制成的膳食补充剂ErgoFlex，具有缓解慢性关节疼痛、促进软骨健康、减轻炎症、改善体质和补充能量等的作用(Benson KF, AgerDM, Landes B, et al.1mprovement of joint range of mot1n(ROM)and reduct1n ofchronic pain after consumpt1n of an ergoth1neine-containing nutrit1nalsupplement.Prev Med,2012, 54:S83_S89.)。
[0005]与化学合成法和天然生物提取法相比，蕈菌深层发酵生物合成麦角硫因具有产量高、成本低、易实现规模化生产及产品安全等优势，是合成麦角硫因的技术发展方向。蕈菌生物合成的麦角硫因绝大部分积累于菌丝体内，因此，以蕈菌深层发酵制备麦角硫因产品，必须具备从菌丝体中提取和纯化麦角硫因的技术。
[0006]Mitsubishi用丙酮或乙醇溶液萃取杯伞属子实体的干燥粉末，再利用柱层析、薄层层析、离子交换层析及纸电泳技术进一步纯化麦角硫因(Mitsubishi, Chem Ind.JP58057365-A) ；Harada E利用乙酸乙酯浸提茶树菇子实体，再通过阳离子交换树脂和硅胶色谱层析进一步分离提取，冷冻干燥后，经葡聚糖凝胶过滤和反相高压液相色谱纯化得高纯度的麦角硫因(Univ Nagoya, Iwade Kingaku Kenkyusho Kk, Daicel Chem.Method for producing ergoth1neine[P].JP:JP2009161498A) ；Nukina M 等从人工栽培的蘑菇子实体中提取麦角硫因，首先将蘑菇干燥粉碎，热水浸提，过滤后再用乙醇溶解，使用阳离子交换树脂、硅胶薄层层析分离提取，后经高压液相色谱和冷冻干燥制备高纯度麦角硫因(Nukina M.Preparat1n of ergoth1neine useful in pharmaceuticals,by fract1nating mushroom extract containing ergoth1neine, with solvent,separating the ergoth1neine， and purifying the fract1n liquid containing theergoth1neine[P], JP JP2008110988-A);国内未见关于麦角硫因的纯化研究，仅有报导周念波等从双孢菇菇柄中提取麦角硫因，先将菇柄粉碎，利用热的NaOH溶液浸提，离心去除固形物，上清液减压浓缩，再使用氧化铝层析分离提取，麦角硫因回收率为91.2%，纯度达25.6%。(周念波，李轶群，殷勤红，氧化铝柱层析从双孢菇菇柄中提取麦角硫因[J].安徽农业科学，2010，38 (27): 14842 ?14843.)。
[0007]上述纯化方法步骤多，程序复杂；浸提溶剂大多采用有机溶剂或添加化学试剂，进一步纯化时必须去除额外添加的有机溶剂或其他试剂；采用离子交换层析、氧化铝层析等常压层析法虽然可以实现大规模制备，但分离效率和产品纯度低，操作复杂，尤其不适用于成分较复杂的样品的分离；利用高效液相色谱法(HPLC^i)虽然能纯化得到高纯度的麦角硫因，但成本高，制备量小，仅能得毫克级产品，只限于实验室研究应用。
[0008]中压制备色谱是天然产物、生物制品纯化和精制的新型分离纯化系统，具有分离过程压力恒定，中压制备，流速快，处理量大，柱效高，产品纯度高，适合于工业化生产等优点。现有技术中未见有采用中压制备色谱纯化麦角硫因的报道。
【发明内容】
[0009]本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，提供一种从菌丝体中快速大量提取及纯化麦角硫因的方法，从而为食品、保健、医药等行业提供所需纯度的麦角硫因产品，该方法简单易行，尤其适用于麦角硫因的规模化生产。
[0010]本发明的目的通过以下技术方案实现。
[0011]1、热水浸提:蕈菌菌丝体深层发酵结束后，菌丝体发酵液经固液分离，收集菌丝体，按湿菌丝体重:水(g: mL)加入1: 0.5?1: 40的水，制成菌丝体的水悬液。将菌丝体水悬液升温至70?100°C,以O?600rpm搅拌浸提I?60min,麦角硫因从菌丝体的细胞内被浸提到细胞外的水溶液中。固液分离，分别收集菌丝体和麦角硫因水溶液，菌丝体可以按上述方法重复浸提，对于多次浸提的，合并浸提后的麦角硫因水溶液。
[0012]所述的固液分离方法可以是离心、过滤或自然沉降。
[0013]2、超滤:将步骤I所得的麦角硫因水溶液采用超滤膜过滤，去除蛋白、多糖等的大分子杂质。收集超滤透过液，根据实际需要进行干燥或浓缩，得到干燥粗品或浓缩液。麦角硫因可干燥为固体粗品或浓缩至含量高于0.1g / L0
[0014]超滤所用的超滤膜可以是陶瓷膜或高分子材料的膜。超滤膜的截留分子量选择IkDa ?30kDa,优选 4kDa ?6kDa。
[0015]超滤前可以先微滤。微滤膜可以是陶瓷膜、金属膜或高分子材料的膜。微滤膜的孔径0.01?5 μ m,优选0.1?0.5 μ m。
[0016]所述的干燥方法可以是但不限于喷雾干燥、真空干燥或冷冻干燥，干燥后得到麦角硫因粗广品。
[0017]所述的浓缩方法可以是但不限于蒸发或真空浓缩。
[0018]3、色谱纯化:将步骤2所得的粗产品或浓缩液加入0.5?5倍体积的乙腈溶解，超声处理I?30min，经0.1?0.5 μ m孔径的微滤膜过滤，浓缩至达到制备色谱系统的进样要求后进行色谱纯化，例如麦角硫因的浓度在6g / L?48g / L。
[0019]所述的纯化色谱柱可以是但不限于Flash色谱柱、动态轴向压缩柱等，色谱填料为HILIC(亲水作用色谱)填料。色谱柱规格根据实际处理量而定。
[0020]所述的流动相组成为乙腈-水，采用等度洗脱，流动相体积比选择80: 20?88: 12，优选88: 12?85: 15。所述的色谱检测波长为280nm，收集波长为254nm ;麦角硫因进样量为每10g填料0.0lg?0.323g，优选0.113g?0.225g，流速根据色谱柱的规格而定。
[0021]根据紫外检测光谱图，对分离的每个色谱峰的对应物进行收集，利用高压液相色谱(HPLC)检测，浓缩和干燥含有麦角硫因的组分，所得样品的麦角硫因纯度达96.6?99.0%。
[0022]所述的浓缩方法可以是但不限于蒸发或真空浓缩。
[0023]所述的干燥方法可以是但不限于喷雾干燥、真空干燥或冷冻干燥，干燥后得到高纯度的麦角硫因产品。
[0024]麦角硫因的检测方法:
[0025]高压液相色谱法(HPLC),色谱柱为HILIC分析柱(250mmX4.6mm, 5 μ m),流动相为乙腈-7jC，体积比为85: 15，使用20mmol / L乙酸-乙酸铵缓冲液调节流动相的pH至6.0，检测波长254nm，柱温40°C，流速ImL / min,进样量10 μ L。
[0026]本发明的优势在于:
[0027](I)步骤少，耗时短，操作简便，得率高，产品的纯度高，并且可以根据不同的应用需要，制备多种纯度的麦角硫因产品。
[0028](2)菌丝体内麦角硫因的浸提工艺仅以水为浸提溶剂，替代了低沸点的有机萃取溶液，在浸提过程中不添加任何无机化学品和石油化工类试剂；浸提剂的成本最低，避免了操作过程中大量使用有机溶剂可能带来的危险；没有增加杂质，后续工艺不必考虑去除人为添加的杂质。
[0029](3)采用超滤技术实现了麦角硫因与大分子杂质的分离，得到麦角硫因纯度达25.2%?34.7%的产品，适于纯度要求较低的应用。同时避免了大分子杂质对后续使用的色谱填料的危害，超滤工艺没有相变，操作简单，能耗低，成本低，不添加化学试，无污染。
[0030](4)进一步纯化采用中压色谱，相比于常压柱层析分离，本方法制备的麦角硫因纯度高，工艺及产品质量易控制，适合于成分复杂样品中的麦角硫因的分离纯化。与高压液相色谱技术相比，本发明能够大规模制备高纯度的麦角硫因，产量高，设备投资小，运行成本低，适合于工业化生产。
【附图说明】
[0031]图1是实施例2中的中压色谱分离图谱；
[0032]图2是实施例2中色谱纯化后的麦角硫因HPLC检测图谱；
[0033]图3是实施例3中的中压色谱分离图谱；
[0034]图4是实施例3中色谱纯化后的麦角硫因HPLC检测图谱；
[0035]图5是实施例4中的中压色谱分离图谱；
[0036]图6是实施例4中色谱纯化后的麦角硫因HPLC检测图谱。
【具体实施方式】
[0037]本发明