麦角硫因的检测方法
【专利摘要】本发明涉及一种菌丝体中或发酵液中的麦角硫因的高压液相色谱检测方法，包括对菌丝体或发酵液的预处理步骤和高压液相色谱检测步骤。对菌丝体的预处理步骤包括将发酵液固液分离，收集菌丝体，再加入纯水溶解并进行浸提而得到浸提液，然后经过超滤膜超滤，得到含有麦角硫因样品的透过液。对发酵液的预处理步骤包括对发酵液直接进行浸提，然后经过超滤膜超滤，得到含有麦角硫因样品的透过液。本发明的方法先经过简单的预处理，再利用高压液相色谱进行检测，去除了发酵液和菌丝体中的大部分杂质，提高了色谱柱的使用寿命和样品的分离度，使检测结果更精确稳定，降低了检测的成本。
【专利说明】麦角硫因的检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及化学分析领域，特别是涉及发酵液和菌丝体中麦角硫因的检测方法。【背景技术】
[0002]麦角硫因(L-Ergothioneine，EGT)，化学名为2_巯基组氨酸三甲基内盐，是一种稀有的天然手性氨基酸，它是至今唯一为人们所知的天然2-硫代咪唑氨基酸(2-thio-1midazole),化学结构式如下:
[0003]
【权利要求】
1.一种菌丝体中的麦角硫因的高压液相色谱检测方法，包括以下步骤: 1)菌丝体的预处理步骤，包括将发酵液固液分离，收集菌丝体，再加入纯水悬浮并进行浸提而得到浸提液，然后经过超滤膜超滤，得到含有麦角硫因样品的超滤透过液； 2)高压液相色谱检测步骤，对含有麦角硫因待测样品的透过液进行高压液相色谱分析。
2.如权利要求1所述的方法，其中在所述的菌丝体的预处理步骤中，发酵液固液分离的方法选自离心、过滤和抽滤中的一种或多种。
3.如权利要求1所述的方法，其中在所述的菌丝体的预处理步骤中，浸提方法包括水浴浸提和/或磁力搅拌浸提。
4.如权利要求1所述的方法，其中在所述的菌丝体的预处理步骤中，浸提方法包括一次性浸提或反复浸提，浸提温度为50~100°C，浸提总时间为10~90min。
5.如权利要求4所述的方法，其中在所述的菌丝体的预处理步骤中，浸提温度为80~90℃。
6.如权利要求4所述的方法，其中在所述的菌丝体的预处理步骤中，浸提总时间为60 ~90mino
7.如权利要求1所述的方法，其中在所述的菌丝体的预处理步骤中，搅拌转数为O~600rpmo
8.如权利要求1所述的方法，其中在所述的菌丝体的预处理步骤中，超滤过程中用到的超滤膜的截留分子量为1.5kDa~30kDa。
9.如权利要求8所述的方法，其中在所述的菌丝体的预处理步骤中，超滤过程中用到的超滤膜的截留分子量为3kDa。
10.一种发酵液中的麦角硫因的高压液相色谱检测方法，包括以下步骤: 1)发酵液的预处理步骤，包括对发酵液直接进行浸提，然后经过超滤膜超滤，得到含有麦角硫因样品的透过液； 2)高压液相色谱检测步骤，对含有麦角硫因样品的透过液进行高压液相色谱分析。
11.如权利要求10所述的方法，其中在所述的发酵液的预处理步骤中，浸提方法包括水浴浸提和/或磁力搅拌浸提。
12.如权利要求10所述的方法，其中在所述的发酵液的预处理步骤中，浸提温度为50~100°C，浸提时间为10~90min。
13.如权利要求12所述的方法，其中在所述的发酵液的预处理步骤中，浸提温度为80 ~90?。
14.如权利要求12所述的方法，其中在所述的发酵液的预处理步骤中，浸提时间为60 ~90min。
15.如权利要求10所述的方法，其中在所述的发酵液的预处理步骤中，搅拌转数为O~600rpm。
16.如权利要求10所述的方法，其中在所述的发酵液的预处理步骤中，超滤过程中用到的超滤膜的截留分子量为1.5kDa~30kDa。
17.如权利要求10所述的方法，其中在所述的发酵液的预处理步骤中，超滤过程中用到的超滤膜的截留分子量为3kDa。
18.如权利要求1~17中任一项所述的方法，其中在所述的高压液相色谱检测步骤中，高压液相色谱检测的条件如下:色谱柱为反相碳十八柱，采取两根柱子串联的连接方式进行检测；流动相溶液成分以体积分数计为甲醇/乙腈-纯水=(O~10): (90~100);流动相的pH范围为4.0~6.5 ;用于调节pH的酸或盐选自乙酸、乙酸钠、硼酸、甲酸、丁酸、乙二酸、和丙酮酸中的一种或多种；检测波长为250~260nm ;柱温为15~40°C ;流动相的流速为0.3~1.3mL/min ;色谱图的记录时间为40min以下；麦角硫因的出峰时间为3~18min。
19.如权利要求18所述的方法，其中在所述的高压液相色谱检测步骤中，流动相溶液成分以体积分数计为甲醇/乙腈-纯水=(O~5): (95~100)。
20.如权利要求18所述的方法，其中在所述的高压液相色谱检测步骤中，流动相的pH范围为4.0~5.0。
21.如权利要求18所述的方法，其中在所述的高压液相色谱检测步骤中，用于调节pH的酸或盐为硼酸。
22.如权利要求18所述的方法，其中在所述的高压液相色谱检测步骤中，麦角硫因的出峰时间为5~8min。
23.如权利要求22所述的方法，其中在所述的高压液相色谱检测步骤中，麦角硫因的出峰时间为7~8min。
24.如权利要求18所述的方法，还包括对麦角硫因进行定量的步骤，所述的定量步骤包括: 1)麦角硫因标准品的预处理步骤，包括制备含不同浓度的麦角硫因标准品的溶液； 2)对含不同浓度的麦角硫因标准品的溶液分别进行高压液相色谱检测； 3)根据麦角硫因标准品的浓度与相应的高压液相色谱峰面积绘制标准线； 4)根据麦角硫因待测样品的高压液相色谱出峰时间和峰面积，比照标准品的出峰时间和标准曲线，对待测样品中的麦角硫因进行定量。
25.如权利要求24所述的方法，其中对含不同浓度的麦角硫因标准品的溶液进行高压液相色谱检测的条件，与权利要求18所述的方法中所使用的高压液相色谱检测的条件相同。
【文档编号】G01N30/02GK103743825SQ201210392294
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2012年10月16日 优先权日:2012年10月16日
【发明者】姜文侠, 刘琦, 周涛 申请人:中国科学院天津工业生物技术研究所