专利名称：检测硫醇的方法和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及硫醇检测分析技术，具体属于一种快速、定量地检测硫醇的方法，以及检测硫醇的试剂盒。
背景技术：
硫醇在生物体系中起着关键作用。三种结构相似的小分子硫醇半胱氨酸(Cys)、 同型半胱氨酸(Hcy)和谷胱甘肽(GSH)在维持生物系统中扮演着至关紧要的的角色。细胞内硫醇浓度的改变与一些疾病紧密相连，如白血球降低、牛皮癣、肝脏损伤、癌症和艾滋病。 半胱氨酸(Cys)缺乏会引起很多综合疾病，如儿童生长缓慢、白化病、水肿、嗜睡症、肝脏损伤、肌肉和脂肪消损、皮肤损伤、虚弱。血浆中高水平的同型半胱氨酸(Hcy)是Alzheimer 症、叶酸和维生素B12缺乏症和心血管疾病的致病因素之一。血浆中总的同型半胱氨酸 (tHcy)浓度与出生缺陷、老年痴呆等疾病有关。谷胱甘肽(GSH)是细胞内含量最高的非蛋白质硫醇(1 lOmmol/L)，支持许多细胞功能，如维持细胞氧化还原动态平衡、异型生物质的新陈代谢、细胞内的信号传导以及基因调节。更为重要的是，谷胱甘肽能保持蛋白质中半胱氨酸巯基处于还原态，和通过俘获伤害DNA和RNA的自由基保护细胞免受氧化伤害。因此，定量检测生物体系中硫醇的浓度在科研和临床中具有重要意义，建立快速、准确、灵敏的硫醇检测方法，也是预防和监测硫醇所引发的疾病的重要措施之一。目前已报道的用于检测硫醇的检测方法有高效液相色谱法、毛细管电泳法、电化学法、傅里叶变换红外光谱、质谱法等。然而这些方法检测过程需要大型仪器、检测过程繁琐、耗时、设备和药品比较昂贵等。小型医院及诊所由于缺乏大型设备，而无法把测定病人体液中硫醇的含量作为临床上的一个常规检验。所以，发展一种检测过程简单、灵敏、成本低、适合临床、科研使用的的检测硫醇的方法非常必要。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术硫醇检测中存在的问题，提供一种体系简单、 操作方便、选择性高、灵敏度高的硫醇定量检测方法，并提供一种价格便宜、操作简单、检测过程迅速的硫醇检测试剂盒。本发明提供的检测硫醇的方法和试剂盒，是基于一种色烯衍生物NPC， 7-nitro_2,3-dihydro-ΙΗ-cyclopenta[b]chromen-l-one(F. J. Huo, C.X.Yin, P.Yang. ActaCryst. 2004，E60，o2087_o2089)，在HEPES缓冲溶液中定量地检测硫醇。所述的硫醇为半光氨酸、同型半胱氨酸或谷胱甘肽。本发明的技术方案是一种检测硫醇的方法(光谱法检测)，包括如下步骤(1)、配制pH = 7. 0-10. 0、浓度为I-IOOmM的HEPES缓冲溶液，配制浓度为2mM的 NPC乙醇溶液；(2)、把aiil的HEPES缓冲溶液和25 μ 1的NPC溶液加到干净的紫外比色皿中，在紫外可见分光光度仪上检测，随着待测样的加入，最大吸收峰由292nm逐渐变为405nm，当 405nm吸收峰达到最大值时，停止加待测样，此时加入待测样的体积计为Vit3w μ 1 ；、按25Χ2Χ10_7ν·,计算出待测样中硫醇的含量。另一种检测硫醇的方法(比色法)，包括如下步骤(1)、配制ρΗ= 7.0、浓度为IOmM的HEPES缓冲溶液，标记为R1，配制浓度为2mM的 NPC乙醇溶液，标记为& ；O)、按照礼、1 2体积比为100 1，加入比色管中，此时溶液为无色；(3)、取&体积1/5的待测样，用进样器加到上述比色管中，摇振20-30s后，与标准色阶进行对照，得出待测样中硫醇浓度范围；标准色阶的制定在含有100 μ M的NPC、pH = 7. 0且浓度为IOmM的HEPES缓冲溶液中，依次向六个比色管中分别加入硫醇溶液，使硫醇的浓度分别为0、15、30、50、80、 ΙΟΟμΜ，得到标准的色阶(见图4)，即从左到右的颜色依次为，无色、淡黄色、浅黄色、黄色、亮黄色、深黄，代表相应的硫醇浓度为0、15、30、50、80、ΙΟΟμΜ。本发明提供的一种检测硫醇的试剂盒，包括试剂瓶1、试剂瓶2、比色管、标准色阶；所述的试剂瓶1装有IOOmL浓度为IOmM的HEPES缓冲溶液，标记为试剂R1 ；所述的试剂瓶2装有5mL浓度为2mM的NPC乙醇溶液，标记为试剂& ；标准的色阶为从左到右的颜色依次为，无色、淡黄色、浅黄色、黄色、亮黄色、深黄，代表相应的硫醇浓度依次为0、15、30、50、80、10(^11(见图4)。其制备方法同上。试剂盒的使用方法(比色法)(1)、按照礼、1 2体积比为100 1，加入比色管中，此时溶液为无色；O)、取&体积1/5的待测样，用进样器加到上述比色管中，摇振20-30s后，与标准色阶进行对照，得出待测样中硫醇浓度。所述的HEPES缓冲溶液可以用醋酸-醋酸钠缓冲溶液、Tris_HCl、柠檬酸、磷酸缓冲溶液等代替。与现有技术相比，本发明具有如下优点和效果1、检测体系成本低廉，试剂由 5-硝基水杨醛和2-环戊烯酮，在室温下一步制得，原料便宜，反应条件简单，易于大规模生产；2、本发明的检测方法，对硫醇显示了极高的灵敏性和选择性，其它非巯基氨基酸和体液中的各种阴离子不干扰检测结果；3、检测过程简便、灵敏、快速，有很低的检测限和宽的线性范围，检测结果准确；4、检测手段简单，只需要借助紫外分光光度计或目视比色即可进行，并不需要任何大型仪器配套，克服了大型仪器和试剂盒配套的昂贵和不便，使得中小型的乡镇卫生院、诊所乃至家庭都可使用该试剂盒进行病情的检测，有很广的应用范围。
图1 在含有25 μ M NPC和pH7. OHEPES (IOmM)缓冲溶液中逐渐加入半胱氨酸的紫外可见吸收图。图2 在含有25 μ M NPC和pH7. OHEPES (IOmM)缓冲溶液中逐渐加入同型半胱氨酸的紫外可见吸收图。图3 在含有25 μ M NPC和pH7. OHEPES (IOmM)缓冲溶液中逐渐加入谷胱甘肽的紫外可见吸收图。图4 本发明试剂盒标准色阶图。图5 比色法检测待测样中半胱氨酸浓度的颜色图。
具体实施例方式实施例1光谱法检测半胱氨酸配制pH = 7.0的的HEPES(IOmM)缓冲溶液，并用乙醇配制2mM的NPC溶液；把2ml 的HEPES缓冲溶液和25 μ 1的NPC溶液加到干净的紫外比色皿中，在紫外可见分光光度仪上检测，292nm有最大吸收；取半胱氨酸待测样，逐渐用微量进样器加到此比色皿中，边加样边在紫外可见分光光度仪上检测，随着半胱氨酸待测样的加入，最大吸收峰由292nm逐渐变为405nm，当405nm吸收峰达到最大值时，此时加入半胱氨酸待测样的体积计为25 μ 1 ； 按25 X 2 X 10_5/25计算出半胱氨酸的含量为20 μ Μ。紫外可见吸收图见图1.实施例2光谱法检测同型半胱氨酸配制pH = 7. 0的的HEPES (IOmM)缓冲溶液，并用乙醇配制2mM的NPC溶液；把2ml 的HEPES缓冲溶液和25 μ 1的NPC溶液加到干净的紫外比色皿中，在紫外可见分光光度仪上检测，292nm有最大吸收；取同型半胱氨酸待测样，逐渐用微量进样器加到此比色皿中， 边加样边在紫外可见分光光度仪上检测，随着同型半胱氨酸的加入，最大吸收峰由292nm 逐渐变为405nm，当405nm吸收峰达到最大值时，此时加入同型半胱氨酸待测样的体积计为 20 μ 1 ；按25Χ2Χ10_5/20计算出同型半胱氨酸的含量为25 μ Μ。紫外可见吸收图见图2.实施例3光谱法检测谷胱甘肽配制pH = 7. 0的的HEPES (IOmM)缓冲溶液，并用乙醇配制2mM的NPC溶液；把2ml 的HEPES缓冲溶液和25 μ 1的NPC溶液加到干净的紫外比色皿中，在紫外可见分光光度仪上检测，292nm有最大吸收；取谷胱甘肽待测样，逐渐用微量进样器加到此比色皿中，边加样边在紫外可见分光光度仪上检测，随着谷胱甘肽待测样的加入，最大吸收峰由292nm逐渐变为405nm，当405nm吸收峰达到最大值时，此时加入谷胱甘肽待测样的体积计为50 μ 1 ； 按25X2X10_s/50计算出谷胱甘肽的含量为ΙΟμΜ。紫外可见吸收图见图3.实施例4比色法检测半胱氨酸制备标准色阶在含有100 μ M的NPC、pH = 7.0且浓度为IOmM的HEPES缓冲溶液中，依此向六个比色管中分别加入半胱氨酸溶液，使半胱氨酸的浓度分别为0、15、30、50、80、10(^11，得到标准的色阶图，即从左到右的颜色依次为无色、淡黄色、浅黄色、黄色、亮黄，深黄，代表相应的待测样半胱氨酸浓度为0、15、30、50、80、100μΜ。标准色阶见图4。未知浓度半胱氨酸的测定(1)、配制pH = 7. 0、浓度为IOmM的HEPES缓冲溶液，标记为R1,配制2mM的NPC溶液，标记为R2 ；0)、取队2000 μ UR2 20 μ 1，加入比色管中，此时溶液为无色；(3)、取半胱氨酸待测样4μ 1，用进样器加到上述比色管中，摇振30s后，与标准色阶进行对照，得出待测样中半胱氨酸浓度在30-50 μ M之间，约为43 μ Μ。比色图见图5。实施例5试剂盒法检测谷胱甘肽
试剂盒的构成试剂瓶1 白色塑料瓶，瓶内封闭包装HEPES缓冲溶液。准确称取0. 238g的HEPES， 溶于IOOmL蒸馏水中，调节溶液pH = 7. 0，得到IOmM的HEPES缓冲溶液，此试剂为R1。试剂瓶2 无色玻璃瓶，瓶内封闭包装NPC溶液。准确称取0. 0022g的NPC，用乙醇为溶剂配制成5mL溶液，得到2mM的NPC乙醇溶液，此试剂为&。以上两个试剂瓶、比色管、试剂盒说明书和标准色阶(同实施例4) 一同放入一个盒子中，并用带有圆孔的塑料泡沫板固定各试剂瓶。试剂盒的使用方法(比色法)(1)、取礼2000 μ 1、R2 20 μ 1，加入比色管中，此时溶液为无色;⑵、取4μ 1的谷胱甘肽待测样，用进样器加到上述比色管中，摇振30s后，与标准色阶进行对照，得出待测样中谷胱甘肽浓度约43 μ M。
权利要求
1.一种检测硫醇的方法，其特征在于，包括如下步骤(1)、配制pH= 7. 0-10. 0、浓度为I-IOOmM的HEPES缓冲溶液，配制浓度为2mM的NPC 乙醇溶液；所述的 NPC 代表 7-nitro_2, 3-dihydro-lH_cyclopenta[b] chromen-l-one ；(2)、把2ml的HEPES缓冲溶液和25μ 1的NPC乙醇溶液加到干净的紫外比色皿中，在紫外可见分光光度仪上检测，随着待测样的加入，最大吸收峰由292nm逐渐变为405nm，当 405nm吸收峰达到最大值时，停止加待测样，此时加入待测样的体积计为Vit3w μ 1 ；、按25X2X10_7VOTt^算出待测样中硫醇的含量。
2.一种检测硫醇的方法，其特征在于，包括如下步骤(1)、配制PH = 7. 0、浓度为IOmM的HEPES缓冲溶液，标记为队，配制浓度为2mM的NPC 乙醇溶液，标记为O)、按照‘Ι体积比为100 1，加入比色管中，此时溶液为无色；(3)、取&体积1/5的待测样，用进样器加到上述比色管中，摇振20-30S后，与标准色阶进行对照，得出待测样中硫醇浓度；所述的标准色阶，即从左到右的颜色依次为无色、淡黄色、浅黄色、黄色、亮黄色、深黄，代表相应的硫醇浓度为:0、15、30、50、80、100μΜ。
3.—种检测硫醇的试剂盒，其特征在于，包括试剂瓶1、试剂瓶2、比色管、标准色阶；所述的试剂瓶1装有IOOmL浓度为IOmM的HEPES缓冲溶液，标记为试剂R1 ；所述的试剂瓶2装有5mL浓度为2mM的NPC乙醇溶液，标记为试剂& ；所述的标准的色阶从左到右的颜色依次为无色、淡黄色、浅黄色、黄色、亮黄色、深黄， 代表相应的硫醇浓度依次为0、15、30、50、80、100μΜ。
4.如权利要求1或2所述的检测硫醇的方法，其特征在于，所述的HEPES缓冲溶液用醋酸-醋酸钠缓冲溶液、Tris-HCl、柠檬酸、磷酸缓冲溶液代替。
5.如权利要求1或2所述的检测硫醇的方法，其特征在于，所述的硫醇为半光氨酸、同型半胱氨酸或谷胱甘肽。
6.如权利要求3所述的检测硫醇的试剂盒，其特征在于，所述的HEPES缓冲溶液用醋酸-醋酸钠缓冲溶液、Tris-HCl、柠檬酸、磷酸缓冲溶液代替。
7.如权利要求3所述的检测硫醇的试剂盒，其特征在于，所述的硫醇为半光氨酸、同型半胱氨酸或谷胱甘肽。
全文摘要
本发明提供了一种硫醇的定量检测方法和试剂盒。该方法和试剂盒基于一种色烯衍生物NPC7-nitro-2，3-dihydro-1H-cyclopenta[b]chromen-1-one，在pH为7.0的缓冲溶液中定量地检测硫醇的含量。硫醇检测方法包括光谱法和比色法；试剂盒，包括装有10mM的HEPES缓冲溶液的试剂瓶1、装有2mM的NPC溶液的试剂瓶2和标准色阶。本方法和试剂盒可应用于临床、食品、生物样品中硫醇的检测。检测过程简单，方便，易于普及推广。
文档编号G01N21/27GK102183471SQ20111000884
公开日2011年9月14日 申请日期2011年1月11日 优先权日2011年1月11日
发明者孙远强, 张建刚, 阴彩霞, 霍方俊 申请人:山西大学