专利名称：检测结核病治疗效果的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测结核病治疗效果的试剂盒。
背景技术：
结核病治疗需要多种抗生素联合使用，用药时间至少为6个月，由于毒副作用大， 病人依从性较差，耐药结核病可导致治疗失败。目前结核病治疗效果监测主要依靠抗酸染 色或结核菌培养转阴(Holtz TH, Sternberg Μ, Kammerer S, Laserson KF, Riekstina V, Zarovska Ε, Skripconoka V, Wells CD, Leimane V. Time to sputum culture conversion in multidrug-resistant tuberculosis -predictors and relationship to treatment outcome. Ann Intern Med 2006 ; 144 :650-659)，或X线胸片检查病变的改善。抗酸染色虽 然简单易行，特异性也比较高，但敏感性较低，而结核分枝杆菌培养需要4到8周的时间。X 线胸片检查缺乏特异性。
发明内容
本发明的目的是提供一种结核病治疗效果监测的试剂盒。本发明所提供的结核病治疗效果监测试剂盒，它包括如下试剂1)荧光标记的抗人⑶4抗体；2)荧光标记的抗人⑶巧4抗体；幻荧光标记的抗人⑶27抗体。所述试剂盒还包括结核分枝杆菌抗原。结核分枝杆菌抗原可以为BCG(BacillUS Galmette Gu6rin)(卡介苗)，也可以是结核分枝杆菌蛋白抗原ESAT-6蛋白或结核分枝杆 菌蛋白抗原38kD蛋白等。利用上述试剂盒进行结核病疗效鉴定，与现有的抗酸染色或结核菌培养相比，该 检测具有快速简单的优点，只需要从病人采2ml血，2天就可以获得结核病治疗结果，敏感 性高。该检测对结核病(特别是耐药结核病)的临床治疗具有指导作用。该方法在国内外 尚未见报道。
具体实施例方式下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。实施例1、结核病特异性免疫分子标识用于结核病治疗效果监测发明人发现一种新的可用于结核病治疗效果监测的免疫分子标识，用于指导结核 病(特别是耐药结核病)的临床治疗。CD27在细胞免疫中发挥了非常重要的作用。在前期 研究中，通过对结核病人和正常对照者的对比研究，发现结核抗原特异性CD4T细胞CD27表 达减低与结核病治疗失败相关，有希望作为结核病治疗效果监测的免疫分子标识。根据上述发现，我们设计了结核病治疗效果监测的方法，它包括获得外周血单个 核白细胞，标记结核抗原特异性CD4T细胞，检测CD27在结核抗原特异性CD4T细胞上的表达等步骤。我们制备了结核病治疗效果监测的试剂盒，方便实施上述的方法，该试剂盒为检 测⑶27在结核抗原特异性⑶4T细胞上表达的试剂，即主要包括如下试剂1)荧光标记的抗人⑶4抗体；2)荧光标记的抗人⑶巧4抗体；3)荧光标记的抗人⑶27抗体；4)结核分枝杆菌抗原。其中，结核分枝杆菌抗原为BCG(Bacillus Galmette Guerin)(卡介苗)。利用上述结核病治疗效果监测的试剂盒检测了 45例肺结核病人治疗效果，其中 初治结核病人31例，治疗失败结核病人14例；同时设置正常对照33人。45例肺结核病人 通过痰菌涂片抗酸染色或细菌培养、X线胸片、临床表现、对抗痨药物治疗的反应确诊。所 有结核病人均采用标准的抗痨方案治疗。14例结核病人在按照标准的抗痨方案治疗后痰菌 持续阳性或仍然有结核病变，确诊为治疗失败的结核病人。具体结核病治疗效果监测方法 如下所述1)从结核病人及对照者抽取2ml外周血，肝素抗凝；2)用Ficoll-Paque (GE Healthcare, USA)梯度离心法获得外周血单个核白细胞；3)单个核白细胞悬浮于含10% (体积比)胎牛血清的RPMI 1640培养基 (Invitrogen, USA)中，2X IO6 细胞/ml ；4)加入2. 5 X 104CFU/ml BCG刺激单个核白细胞，在37°C CO2孵箱中培养16-20小 时；在刺激的同时加入5 μ 1荧光标记的抗人CD154抗体(Beckman Coulter, USA)，以及共 刺激抗人⑶观抗体和抗人CD49抗体(最终浓度均为lmg/ml) (BDBiosciences, USA)。该 步骤的原理是标记结核抗原特异性T细胞。⑶IM在静止期⑶4阳性T细胞表达很低，在抗 原激活后表达显著上调，根据这一原理可以用于检测抗原特异性的T细胞。由于本检测方 法采用了短时间抗原刺激T细胞，在刺激的同时加入抗CD^和CD49d共刺激抗体可以显著 提高抗原特异性T细胞的阳性率。上述方法也可以改为用结核抗原负载的抗原提呈细胞直 接刺激T细胞。5)将步骤4得到的单个核白细胞用含3% (体积比)胎牛血清的无菌 PBS (PBS-FBS)洗一次；6)在每4X IO5细胞中分别加入10 μ 1荧光标记的抗人CD4抗体(BD Biosciences, USA)和10 μ 1荧光标记的抗人CD27抗体(BD Biosciences, USA)，在冰上染色30分钟；7)流式细胞术检测以⑶4、⑶IM双阳区设门，检测⑶27在结核抗原特异性⑶4T 细胞上的表达，确定阳性与阴性的比例，记录结果。与初治结核病人相比，治疗失败结核病人抗原特异性CD4T细胞CD27表达显著降 低(P值分别为0. 005)。Logistics回归显示，抗原特异性⑶4T细胞⑶27表达减低与治疗 失败结核病相关(P值分别为0. 005，OR值为25. 375)。该结果表明，结核抗原特异性CD4T细胞CD27表达降低与治疗失败相关，通过分析 抗原特异性CD4T细胞CD27表达就可以确定结核病人的治疗效果，达到对结核病治疗效果 监测的目的。在结核病人治疗时，按照上述方法检测其结核抗原特异性CD4T细胞中CD27 阴性比例，超过60%时即可判断其治疗失败，在50-60%之间提示可能会出现治疗失败。出现治疗失败时需要调整治疗方案。 上述方法也表明，利用上述试剂盒进行结核病疗效鉴定，与现有的抗酸染色或结 核菌培养相比，该检测具有快速简单的优点，只需要从病人采2ml血，2天就可以获得结核 病治疗结果，敏感性高。该检测对结核病(特别是耐药结核病)的临床治疗具有指导作用。 该方法在国内外尚未见报道。
权利要求
1.结核病治疗效果监测的试剂盒，它包括如下试剂1)荧光标记的抗人CD4抗体；和2)荧光标记的抗人CDlM抗体；和3)荧光标记的抗人⑶27抗体。
2.根据权利要求1所述的结核病治疗效果监测的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还 包括结核分枝杆菌抗原。
3.根据权利要求2所述的结核病治疗效果监测的试剂盒，其特征在于所述结核分枝 杆菌抗原为卡介苗、结核分枝杆菌蛋白抗原ESAT-6蛋白或结核分枝杆菌蛋白抗原38kD蛋白。
4.检测结核抗原特异性CD4T细胞CD27表达的试剂在制备结核病治疗效果监测的试剂 盒中的应用；所述检测结核抗原特异性CD4T细胞CD27表达的试剂包括1)荧光标记的抗人CD4抗体；和2)荧光标记的抗人CDlM抗体；和3)荧光标记的抗人⑶27抗体。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述检测结核抗原特异性CD4T细胞CD27 表达的试剂还包括结核分枝杆菌抗原。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述检测结核抗原特异性CD4T细胞CD27 表达的试剂由下述试剂组成1)荧光标记的抗人CD4抗体；和2)荧光标记的抗人CDlM抗体；和3)荧光标记的抗人CD27抗体；和4)结核分枝杆菌抗原。
7.根据权利要求1-6中任意一项所述的应用，其特征在于所述结核分枝杆菌抗原为 卡介苗、结核分枝杆菌蛋白抗原ESAT-6蛋白或结核分枝杆菌蛋白抗原38kD蛋白。
全文摘要
本发明公开了一种结核病治疗效果监测的试剂盒。该试剂盒，它包括如下试剂1)荧光标记的抗人CD4抗体；2)荧光标记的抗人CD154抗体；3)荧光标记的抗人CD27抗体。利用该试剂盒进行结核病疗效鉴定，与现有的抗酸染色或结核菌培养相比，该检测具有快速简单的优点，只需要从病人采2ml血，2天就可以获得结核病治疗结果，敏感性高。该检测对结核病(特别是耐药结核病)的临床治疗具有指导作用。
文档编号G01N33/533GK102062774SQ20091023766
公开日2011年5月18日 申请日期2009年11月13日 优先权日2009年11月13日
发明者曹志红, 王心静, 程小星, 蒋静 申请人:曹志红, 王心静, 程小星, 蒋静