用于提取和储存核酸的方法和组合物的制作方法
【专利说明】用于提取和储存核酸的方法和组合物
[0001] 与相关申请的交叉引用 本申请为于2012年4月30日提交的标题为"用于提取和储存核酸的方法和组合物"的 美国专利申请号13/460076和于2012年12月20日提交的标题为"用于在固体基质上稳定 核酸的配方"的美国专利申请号13/721948的部分继续；所述两个申请通过引用结合到本 文中。 发明领域
[0002] 本发明涉及用于以干燥形式从生物样品环境提取和稳定核酸的固体基质和方法。 还描述了用于收集、提取、保存和从干燥固体基质回收核酸的方法。
[0003] 发明背景 从生物样品分离或纯化期间保持生物分子的结构和功能完整性对各种下游应用至关 重要。纯化的生物分子的下游应用可包括分析物检测、传感、法医、诊断或治疗应用、测序、 扩增等。这些下游应用的成功可依赖于维持靶生物分子的完整结构和功能。多种因素，例 如温度、压力、pH、化学或酶水解或污染物的存在可引起生物分子例如DNA、RNA或蛋白质的 降解。
[0004] 由于化学自我水解和酶介导的降解，RNA为最不稳定的生物分子之一。衍生自生 物样品的RNA的提取和稳定对许多环境因素敏感，包括，但不限于，用于提取或收集RNA的 缓冲剂、溶液pH、温度，和特别地无处不在的强健的核糖核酸酶（RNA酶）。RNA通常以纯化 和未纯化的形式二者在冷冻下（例如4°C、_20°C或_80°C)储存以防止水解和酶降解，并因 此保持RNA样品的完整性。为了避免与用于维持RNA样品完整性的冷冻相关的费用和空间 需求，用于在环境温度下提取和稳定RNA的方法和物品是期需的。
[0005] 当前用于在环境温度下稳定RNA的方法学集中于在过量，例如，去污剂、离液化合 物、还原剂、过渡金属、有机溶剂、螯合剂、蛋白酶、RNA酶肽抑制剂和抗-RNA酶抗体的液体 溶液中灭活RNA酶。另外的尝试集中于RNA的化学修饰以限制酯交换和自我水解。要求 以干燥形式成功收集和保存RNA的干燥-状态技术通常需要RNA在RNA储存前从样品"预 先纯化"和浓缩。其它用于以干燥形式保存RNA的干燥-状态技术需要另外的干燥设施 (例如强制空气流、冻干或热处理）。因此这些方法在无显著的样品处理下不可执行（not conductive to)从样品（例如，生物样品）直接收集RNA。
[0006] 因此，需要使在单个处理步骤内于环境条件下从生物样品的干燥-状态RNA提取 和稳定成为可能的组合物和方法。此外，在环境温度下将干燥的生物样品储存相当长一段 时间和其后回收完整的RNA用于进一步分析的能力是非常合乎需要的。
[0007] 发明概述 固体基质的一个实施方案包含至少一种蛋白变性剂和至少一种酸或酸-滴定的缓冲 试剂，其以干燥状态漫布于其中；其中所述基质配置为当水化时提供酸性PH、从样品提取 核酸和在环境温度下以基本上干燥的状态储存核酸。
[0008] 在另一个实施方案中，RNA提取基质包含包括离液剂、去污剂或其组合在内的蛋白 变性剂；和酸或酸-滴定的缓冲试剂，其以干燥状态漫布于其中，其中所述基质为多孔的不 可溶性干燥材料，其配制为当水化时提供2-7的pH，用于提取RNA和稳定所提取的RNA，所 述提取的RNA具有至少4的RNA完整性数值（RIN)。
[0009] 在一个实施方案中，RNA提取基质包含包括离液剂、去污剂或其组合在内的蛋白变 性剂；酸或酸-滴定的缓冲试剂；和包括三磷酸盐或焦磷酸盐在内的RNA酶抑制剂，其以干 燥状态漫布于其中，其中所述基质包括多孔的不可溶性干燥材料，其配制为当水化时提供 2-7的pH，和稳定RNA，该RNA具有至少4的RNA完整性数值（RIN)。
[0010] 用于从样品提取和储存核酸的方法的一个实例包括以下步骤：向包含蛋白变性剂 和酸或酸滴定的缓冲试剂的干燥固体基质提供样品；当水化时产生酸性pH用于从样品提 取核酸；干燥包含所提取的核酸的基质；和在环境温度下以基本上干燥的状态在基质上储 存提取的核酸。
[0011] 附图 当参考附图阅读下列详述时将更好地理解本发明的这些及其它特征、方面和优点，在 整个附图中相似的字符代表相似的部分，其中： 图1为P31 NMR谱，其显示三（2-羧乙基）膦（TCEP)的氧化和TCEP氧化物（TCEP-0) 的制备。
[0012] 图2显示衍生自TCEP和TCEP-0对纤维素样品的还原活性的5, 5' -二硫双-(2-硝 基苯甲酸）（DTNB)比色测定法的条形图。
[0013] 图3显示在包含TCEP或TCEP-0的化学处理的纤维素纸上收集的干燥血斑的RNA 完整性数值（RIN)。
[0014] 图4显示在多种化学处理的纤维素基质上收集并在Agilent 2100 Bioanalyzer 上分析RNA之前于环境温度下储存5、6或12天的干燥血斑的RNA完整性数值（RIN)。
[0015] 发明详述 本发明的实施方案提供用于环境提取和保存核酸，例如RNA的合适的基质和方法。RNA 一般被认为是难以以完整形式保存的不稳定分子。本发明的一个或多个实施方案涉及一种 核酸提取基质，其中所述基质配置为在单个处理步骤内从生物样品收集、提取和储存核酸 达很长的时间，随后在各种应用中使用。所述基质配置为在环境温度下以基本上干燥的状 态储存核酸和基本上保留核酸的完整性。
[0016] 为了更清楚和简明地描述所要求发明的主题，针对在下面的描述和所附权利要求 中使用的特殊术语提供下列定义。在整个说明书中，特殊术语的例示应被视为为非-限制 性的实例。
[0017] 单数形式"一个"、"一种"和"所述"包括复数提及物，除非上下文另外清楚指示。近 似的语言，如本文遍及说明书和权利要求所使用的，可应用于修饰任何数量表述，所述数量 表述可在不导致与其相关的基本功能的改变的情况下获准变化。相应地，由术语例如"约" 所修饰的值不限于所指定的精确值。在一些情况下，近似的语言可相应于用于测量该值的 仪器的精密度。必要时，提供范围，并且那些范围包含其间的所有亚范围。
[0018] 如本文所提及的术语"核酸"包括所有形式的RNA (例如，mRNA、miRNA、rRNA、tRNA、 piRNA、ncRNA)、DNA (例如基因组DNA、mtDNA)，以及重组RNA和DNA分子或使用核苷酸类似 物产生的DNA或RNA的类似物。核酸可为单链的或双链的。核酸可包含编码或非编码链。 该术语还包括核酸的片段，例如可使用所公开的提取方法回收的天然存在的RNA或DNA。 "片段"指核酸（例如，RNA或DNA)的一部分。
[0019] 如本文所提及的术语"生物样品"包括，但不限于，从任何生物体，包括人，获得的 血液、血清、组织和唾液。生物样品可由经受自我-诊断测试（例如，血糖监测）的个体或 由受过培训的医学专业人员通过包括，例如，使用针吸血或刮或拭抹特定区域如患者皮肤 上的损伤在内的多种技术获得。用于收集各种生物样品的方法为本领域所熟知。术语"样 品"包括如上所定义的生物样品，但还包括，例如，组织培养的细胞和纯化的核酸。
[0020] 如本文所提及的术语"还原剂"包括向另一种化学物类提供电子的任何化学物类。 本领域已知多种还原剂。示例性的还原剂包括二硫苏糖醇（DTT)、2-巯基乙醇（2-ME)和三 (2-羧乙基）膦（TCEP)。此外，可使用这些或其它还原剂的任何组合。在具体的实施方案 中，还原剂为TCEP。
[0021] 如本文所使用的术语"缓冲剂"包括，例如2-氨基-2-羟甲基-丙烷-1，3-二醇 (Tris)、2-(A吗啉代）乙磺酸（MES)、3-(A吗啉代）丙磺酸（M0PS)、柠檬酸盐缓冲剂、 4-(2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸（HEPES)，和磷酸盐缓冲剂。该潜在的缓冲剂的列表仅用于 说明性目的。选择用于本文所公开组合物和方法的缓冲剂的pH通常经酸滴定在2-7的范 围内。
[0022] 固体基质的一个或多个实施方案包含至少一种蛋白变性剂和至少一种酸或 酸-滴定的缓冲试剂，其以干燥状态漫布于其中，其中所述基质配置为当水化时提供酸性 pH。所述基质还配置为从样品提取核酸和在环境温度下以基本上干燥的状态保存核酸。如 本文所使用的，术语"基本上干燥的状态"指进一步干燥样品至具有约小于2%的水含量。
[0023] 用于从样品提取和储存核酸的固体基质包含呈干燥状态的至少一种酸或酸-滴 定的缓冲剂和蛋白变性剂。术语"基质"在本文中与"提取基质"可交换地使用。如本文所 使用的术语"固体基质"指不可溶的基质。所述基质使得能够不溶解基质材料而收集、提取 和储存核酸。所述固体基质包括，但不限于，诸如纤维素、醋酸纤维素、硝酸纤维