一种青霉素g钠表面分子印迹聚合物的制备方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于分子印迹材料技术领域，尤其涉及一种青霉素G钠表面分子印迹聚合物的制备方法及其应用。
【背景技术】
[0002]青霉素G钠是最早的内酰胺类抗生素，对革兰氏阳性菌及某些革兰氏阴性菌有较强的抗菌作用。青霉素能破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用，在体内有良好的分散性、低毒性，并且治疗感染的效率高，在临床治疗中具有重要作用。随着青霉素类抗生素在畜牧业的普遍应用，导致青霉素等抗生素在食品中的残留，对人体造成一定的危害。例如食用残留青霉素过多的牛奶会使部分人产生过敏作用，且会引起肠道的正常菌群失调，并引起其它有关疾病，使体内病原菌产生抗药性。另外，乳品加工的牛奶中含有的抗生素会抑制乳酸菌的生长，因此对酸奶和奶酪的加工不利。
[0003]目前，PEN_G(青霉素G)等β-内酰胺类抗生素的测定主要有以下几种方法:(1)微生物法，如氯化三苯基三氮唑法(TTC法)，纸片法(PD)，戴尔沃检测法(SP法)，三磷酸腺苷法，酶比色法，杯碟法等；(2)免疫测定法，如酶联免疫检测法，免疫传感器，荧光免疫测定法(FIA) ;(3)理化检验法，如液相色谱法，液相色谱-质谱法，气相色谱法，薄层色谱法，毛细管电泳法，生物传感器法，凝胶电泳-生物自显影法，荧光光度法等。生物样品中PEN-G的含量较低，样品富集纯化的有效性直接关系到分析方法的有效性，传统的液-液、固-液难以实现对生物样品中微量PEN-G的富集和纯化，难以对样品中PEN-G进行定性和定量分析；色谱法和毛细管电泳法等需将生物检材处理成易于分析的形式，而酶联免疫吸附测定法准确性不够，常出现假阳性事件，抗干扰能力差。
[0004]分子印迹技术(Molecular Imprinting Technology, MIT)是指一种可以用来合成对特定目标分子具有专一识别性的聚合物的新技术。MIT是在化学、材料科学、生物化学等多门学科交叉的基础上发展起来的一种新技术。经MIT制得的聚合物称为分子印迹聚合物(Molecular Imprinted Polymer, MIP)。与天然分子识别系统相比，分子印迹聚合物不但具备可以与之相媲美的分子识别能力，还具有使用寿命长、稳定性好、亲和性和选择性高等良好的物理和化学性质，因而在抗体模拟、仿生催化、生物传感器、药物释放等领域已展现了它的优势，特别是在分离领域有着重要的应用。
[0005]制备分子印迹材料的传统方法是包埋法，该方法对模板分子包埋过深或过紧使洗脱模板分子比较困难，且大部分印迹位点被包埋在聚合物内部，使其吸附量减少，利用率降低，研磨过程中还会造成分子识别位点的破坏，另外得到的聚合物颗粒不规则，用作色谱固定相时其载流量和柱效率都较差。
【发明内容】
[0006]本发明是为了解决上述不足，提供了一种青霉素G钠表面分子印迹聚合物的制备方法及其应用。
[0007]本发明的上述目的通过以下的技术方案来实现:一种青霉素G钠表面分子印迹聚合物的制备方法，即:将青霉素G钠溶于一定的溶液，所述一定的溶剂为二甲基亚砜(DMS0)和甲醇体积比为4:1的混合物；然后，加入功能单体搅拌，再加入交联剂、引发剂，氮气除氧，加热反应；反应结束后洗去模板分子青霉素G钠，干燥，即得青霉素G钠表面分子印迹聚合物。
[0008]作为优选，所述功能单体为α -甲基丙烯酸(ΜΑΑ)。
[0009]作为优选，所述交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)。
[0010]作为优选，所述引发剂为偶氮二异丁腈(ΑΙΒΝ)。
[0011]本发明的青霉素G钠表面分子印迹聚合物的性能研究实验方法:包括以下步骤:
[0012]a、青霉素G钠标准溶液的配制:
[0013]将青霉素G钠溶于一定的溶液，配制成不同浓度的青霉素G钠标准溶液。
[0014]作为优选，所述溶剂采用甲醇溶剂。
[0015]b、标准曲线的绘制:
[0016]将不同浓度的青霉素G钠溶液，于264nm波长下，以不含青霉素G钠溶液的甲醇溶液为空白对照，分别测定吸光度。以吸光度为纵坐标，青霉素溶液的浓度为横坐标，绘制标准曲线。
[0017]c、结合动力学实验:
[0018]分别称取MIP和NIP，加入青霉素G钠溶液，室温下振荡，24h内取出混合液离心，取上清液用紫外分光光度计测定其吸光度，根据标准曲线计算不同吸附时间青霉素G钠的浓度。计算聚合物对青霉素G钠的结合量Q( μ g/mg)。
[0019]Q = (C-Q.V/m
[0020]其中C。、Q分别表不吸附前后溶液中模板分子的浓度(yg/mL) ;V表不溶液的体积(mL) ;m表不加入的分子印迹聚合物的质量(mg)。绘制结合量与结合时间关系的动力学曲线。确定分子印迹聚合物的结合量Q、印迹因子α和最佳结合平衡时间。
[0021]a = Q (MIP)/Q (NIP)
[0022]其中Q(MIP)表示分子印迹聚合物的饱和结合量；Q(NIP)表示非分子印迹聚合物的饱和结合量。印迹因子α的大小代表了 MIP的特异吸附性质，其数值越大，特异性越好，印迹效果就越强。
[0023]d、吸附等温曲线:
[0024]称取MIP，置于离心管中，不同浓度的青霉素G钠溶液。室温下振荡20h达到吸附平衡后，将混合液离心，取上清液测定吸光度，计算分子印迹聚合物饱和结合量Q，绘制吸附等温线。
[0025]e、特异性识别实验:
[0026]选取青霉素V钾、阿莫西林、头孢地尼、头孢克肟、头孢拉定、盐酸左氧氟沙星作为目标分子。分别称取MIP和NIP，置于试管中，加入青霉素G钠溶液。室温下振荡达到吸附平衡后，将各混合液离心，取上清液，测定吸光度，依据标准曲线计算结合前后溶液浓度的变化。采用选择因子(SelectinG Factor，β )来描述MIP的选择识别能力，计算出模板印迹因子和模板类似物的印迹因子α 2，根据公式计算选择因子β:
[0027]β = α / α 2
[0028]选择因子β的大小代表了 ΜΙΡ对模板类似物的选择分离能力，β数值越大，越容易使模板分子和模板类似物分离开。
[0029]本发明的青霉素G钠表面分子印迹聚合物检测牛奶中一定范围内的青霉素G钠残留的方法，包括以下步骤:
[0030](1)牛奶样品的提取:
[0031]取牛奶样品置于离心管中，加入提取溶剂混匀，离心，重复上述操作，合并提取液，加入另一种提取溶液，调节ΡΗ，加热搅拌，得提取后的牛奶。
[0032]作为优选，所述提取溶剂为乙腈。
[0033]作为优选所述提取溶液为磷酸盐缓冲溶液(pH)。
[0034](2)方法学验证:
[0035]a、准确度与批内精密度:
[0036]将牛奶样品均分到9支离心管中并标记，分别向其中加入青霉素G钠的标准溶液混匀，在溶液中分别加入准确称重的分子印迹聚合物，在室温下震荡达到吸附平衡后，将溶液离心。过滤，干燥，称重。根据聚合物前后质量差，计算回收率和相对标准偏差RSD。
[0037]回收率(％ )=测得量/加入量X 100%
[0038]b、检测限 L0D:
[0039]用空白样品即不加牛奶样品的青霉素G钠，按方法学验证中准确度和批内精密度的方法计算标准偏差SD，再将3倍空白的SD作为检测限的估算值。
[0040]LOD = 3S (S为空白样品的标准偏差)
[0041](3)牛奶样品的测定:
[0042]离心管中加入分子印迹聚合物MIP，加入提取后的牛奶样品，室温震荡，离心，过滤，干燥，称重，计算青霉素G钠的含量。
[0043]本发明与现有技术相比的优点是:本发明的青霉素G钠表面分子印迹聚合物制备过程简单，可操作性强，制备成本低廉，对青霉素钠分子结合速度快、特异性强、结合容量高、吸附平衡时间短。所制备的青霉素G钠分子印迹聚合物对目标样品选择性高，专属性强，模板分子可回收重复使用等优点，可用于检测牛奶中一定范围内的青霉素G钠残留。
【附图说明】
[0044]图1为本发明实施例所得的表面分子印迹聚合物的青霉素G钠吸附动力学曲线图。
[0045]图2为本发明实施例所得的表面分子印迹聚合物的青霉素G钠吸附等温曲线图。
[0046]图3为本发明实施例所得的表面分子印迹聚合物对青霉素G钠、青霉素V钾、阿莫西林、头孢地尼、头孢克肟、头孢拉定、盐酸左氧氟沙星特异性识别柱状图。
【具体实施方式】
[0047]下面结合实施例对本发明进一步详述。
[0048]—种青霉素G钠表面分子印迹聚合物的制备方法，即:将青霉素G钠溶于一定的溶液，所述一定的溶剂为二甲基亚砜(DMS0)和甲醇体积比为4:1的混合物；然后，加入功能单体搅拌，再加入交联剂、引发剂，氮气除氧，加热反应；反应结束后洗去模板分子青霉素G钠，干燥，即得青霉素G钠表面分子印迹聚合物。
[0049]作为优选，所述功能单体为α -甲基丙烯酸(ΜΑΑ)。
[0050]作为优选，所述交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)。
[0051]作为优选，所述引发剂为偶氮二异丁腈(ΑΙΒΝ)。
[0052]本发明的青霉素G钠表面分子印迹聚合物的性能研究实验方法:包括以下步骤:
[0053]a、青霉素G钠标准溶液的配制:
[0054]将青霉素G钠溶于一定的溶液，配制成不同浓度的青霉素G钠标准溶液。
[0055]作为优选，所述溶剂采用甲醇溶剂。
[0056]b、标准曲线的绘制:
[0057]将不同浓度的青霉素G钠溶液，于264nm波长下，以不含青霉素G钠溶液的甲醇溶液为空白对照，分别测定吸光度。以吸光度为纵坐标，青霉素溶液的浓度为横坐标，绘制标准曲线。
[0058]c、结合动力学实验:
[0059]分别称取MIP和NIP，加入青霉素G钠溶液，室温下振荡，24h内取出混合液离心，取上清液用紫外分光光度计测定其吸光度，根据标准曲线计算不同吸附时间青霉素G钠的浓度。计算聚合物对青霉素G钠的结合量Q( μ g/mg)。
[0060]Q = (Co-Q).V/m
[0061]其中C。、Q分别表不吸附前后溶液中模板分子的浓度(yg/mL) ;V表不溶液的体积(mL) ;m表不加入的分子印迹聚合物的质量(mg)。绘制结合量与结合时间关系的动力学曲线。确定分子印迹聚合物的结合量Q、印迹因子α和最佳结合平衡时间。
[0062]a = Q (MIP)/Q (NIP)
[0063]其中Q(MIP)表示分子印迹聚合物的饱和结合量；Q(NIP)表示非分子印迹聚合物的饱和结合量。印迹因子α的大小代表了 MIP的特异吸附性质，其数值越大，特异性越好，印迹效果就越强。
[0064]d、吸附等温曲线:
[0065]称取MIP，置于离心管中，不同浓度的青霉素G钠溶液。