亲水的高蛋白结合的低荧光蛋白质印迹膜的制作方法

专利名称：：亲水的高蛋白结合的低荧光蛋白质印迹膜的制作方法亲水的高蛋白结合的低荧光蛋白质印迹膜本申请要求2008年8月18日提交的临时申请系列号61/189，302的优先权，其整体通过援引并入本文。
背景技术：
："印迹"或"电印迹"是指在电场影响下，用于将生物样品从凝胶转移到膜上的方法。该方法需要可固定生物分子样品用于随后检测的膜。这对于膜的表面积、孔隙和蛋白结合能力均提出了特殊要求。蛋白质印迹是对该技术的一种修饰，其包括在使用单克隆或多克隆抗体检测前，将蛋白质在膜上固定。在蛋白质固定到膜上之前，使用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)将样品蛋白分离为天然或变性的蛋白。所述蛋白随后转移或电印迹至膜上，进而采用对靶蛋白特异性的抗体对它们进行探测并最终检测。蛋白质印迹膜通常由硝酸纤维素(NC)或聚偏氟乙烯(PVDF)制备。抗体-抗原作用的特异性能保证在复杂的蛋白混合物中鉴定单个蛋白质。概述而言，蛋白质印迹包括将蛋白质样品(溶胞产物)施用到聚丙烯酰胺凝胶上，随后通过电泳分离所述复杂混合物，并且将分离的蛋白质转移或"电印迹"到第二种基质，通常为硝酸纤维素或聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。转移后，膜被"封闭"以防止抗体与膜表面的非特异性结合。本领域技术人员已知许多抗体标记或加标签策略。在最简单的方案中，转移的蛋白质与用作探针的第一酶标记的抗体孵育或复合，阻断非特异性结合位点后，加入适合的底物以与酶复合，其一起反应形成产色的、化学发光的或可荧光检测的产物，以允许分别进行目测、化学发光或荧光检测。最灵敏的检测方案利用了化学发光或荧光现象。在化学发光检测中，酶-底物复合物产生可检测的光学发射(化学发光)。这些发射被记录并采用适当的检测器例如胶片或光子设备测量。信号存在或不存在表明该溶胞产物中是否有特定的蛋白质存在，信号强度与所关注的蛋白质的水平有关，其在某些情况下是可定量的。硝酸纤维素膜普遍用于免疫检测工作、尤其是蛋白质印迹中。其部分是由于历史原因，部分因为其易用性。硝酸纤维素印迹膜不需要有机液体预湿润步骤(采用疏水膜时需要)。疏水膜在装配到印迹转移组件之前需要首先用醇预湿润，随后用水交换以除去醇的步骤。本质疏水的膜进行该装配的时间有限，该膜的干燥潜能是显著的。干燥后，膜不可被重新润湿，除非重复进行预润湿步骤。一旦膜与凝胶接触，在转移前拿开则会有效损坏凝胶和其含有的分离蛋白样品。预湿润步骤是耗时的，是很不利的步骤。亲水膜将在更长的时间内保持湿润，并且如果其在装配前干燥，可用水重新润湿。硝酸纤维素印迹膜是水可润湿的，在多数印迹应用中均显示了令人满意的性能。但硝酸纤维素并不如PVDF那样在机械性或化学性上稳定。PVDF在相当长的时间内保持其机械完整性，而NC将变脆和掉色。PVDF膜印迹可被剥离抗体并被重新探测，而NC印迹不可。NC有被空气氧化的倾向，这可能是危险的。其需要单独的废物流，当处理时需要用湿润剂(通常为水)湿润。疏水的PVDF印迹膜具有与NC印迹膜相同的蛋白结合能力，但显示出更好的印迹3性能。在同样的条件下，与NC相比，这些PVDF膜能检测到低得多的样品浓度。低背景荧光疏水PVDF印迹膜在使用荧光检测方案的同时表现出同样增强的样品检测能力。因此需要提供亲水的PVDF膜用于诸如蛋白质印迹的免疫检测试验，其可以获得更低的样品检测限和疏水PVDF膜的低背景荧光。本发明满足了这些需要。
发明内容发明概述用于改变基质表面能，尤其是关于意图接触生物系统的表面的表面修饰领域的技术人员将会同意，亲水表面修饰通常显示出低的蛋白质结合性质。本文中公开的实施方案偶然且意料不到地发现，来源自某种单体丙烯酰胺混合物、并且使用自由基聚合反应形成的立体聚合物可获得亲水且显示高蛋白结合水平的表面修饰。许多现有技术描述了含羟基单体、通常为含羰基酯的丙烯酸酯聚合物在制备具有亲水性质和对蛋白结合的高度抗性的膜表面修饰中的应用。然而，已知这类单体的聚合物不耐强碱溶液。例如1.0当量的氢氧化钠溶液将含羰基的丙烯酸酯聚合物水解为含丙烯酸的聚合物。这样的含丙烯酸的聚合物在特定PH条件下是带离子电荷的，并将吸引和结合相反电荷的蛋白或生物分子，由此增加吸着和膜的污染。此外，含丙烯酸的聚合物在水中膨胀至一定的程度，使得孔通道收縮，由此降低了膜通透性和生产率。而且，由含羟基单体构成的聚合物，例如羟基丙烯酸酯进一步在强碱溶液中反应，降解成可溶的低分子量片段，其溶解并暴露了下面的底物多孔介质或膜。在药学和生物技术工业中，试图开发用于过滤或非过滤应用的优化的膜的从业者们需要克服重要的问题。面对严格的费用、性能和安全性需要，从业者必须利用材料，开发生产这样的膜的生产方法其不仅具有优化了的流动和保留特征，还是生产经济、符合清洁标准且对于经常遇到的各种化学环境稳定的，并且依赖于所需的最终目的具有对生物分子吸附的强烈抗性或强力吸附生物分子。这样，在这种情况下，非常需要一种膜修饰，其能产生热稳定的、耐受任何潜在的试剂溶液降解的亲水、生物分子吸附表面，其所能提取出来的材料水平很低。来自混合丙烯酰胺聚合表面修饰早期研究的蛋白质结合结果表明，当用紫外线引发或电子束引发的自由基技术共聚的时候，亲水双丙烯酰胺交联单体和单官能中性或带电丙烯酰胺的某些混合物能产生高蛋白结合亲水表面修饰。然而，在观察到满意的点印迹形态和印迹转移性能前，每种单体的最初起始水平不得不显著的下降。本发明的实施方案克服了现有技术的问题，其提供了一种亲水性膜，尤其适于印迹使用，优选蛋白质印迹。更具体而言，预湿润的疏水膜基质(优选由PVDF制备)与单体溶液相接触，在聚合条件下产生持久亲水性的基质。所形成的膜显示低背景荧光、高蛋白结合、优良的蛋白样品点形态保持以及扩大的动态范围(高信噪比，提高的样品可检测性)。其中使用化学发光进行检测，未修饰亲本膜的固有的背景荧光水平并非是关键的。该膜在蛋白质印迹中，尤其在检测低样品浓度检测中显示了比得上常规硝酸纤维素印迹膜或比常规硝酸纤维素印迹膜更高的性能，其可以直接用水湿润，而不需要使用前用醇预湿润。所述膜与水接触后表现出完全、即刻和均一的湿润，而当与饱和的氯化铝水溶液接触后表现出延迟的湿润。即当所述膜置于该饱和的氯化铝水溶液表面时，其在低于于1秒的最小时间间隔内完全湿润。图1为R实验的蛋白质印迹结果，结果相应于表1提供的实验条件。图2为S实验的蛋白质印迹结果，结果相应于表2提供的实验条件。图3为T实验的蛋白质印迹结果，结果相应于表3提供的实验条件。详细说明根据本公开文本实施方式的亲水性修饰的膜提供了这样的免疫检测试验平台，其具有比得上硝酸纤维素膜或比硝酸纤维素膜更好的印迹性能，尤其是在扩展样品可检测性动态范围下限方面。例如，在图1中，典型试验得到的蛋白质印迹结果表明了本发明的亲水性PVDF印迹膜和对照(FL-疏水PVDF膜，NC-Whatman/S&SBA-85膜)之间的性能差异。图中每个水平条带含有5个分开的蛋白质转移印迹，三个印迹在亲水性PVDF研制的样品上，每个对照膜各一个。5个蛋白质印迹的每个水平条带均为一次电泳和转移实验的结果(每次实验中使用5个凝胶然后5个印迹)。通过设计，电泳和转移前，每次实验在每个具有相同量蛋白样品(每个凝胶应用4个泳道)的凝胶/印迹方面具备同样的条件。显示的结果为记录(化学发光)的转移印迹，用于从复杂的样品混合物(溶胞产物)中检测2种蛋白(HSP70和GAPDH)。使用递减的样品浓度，每片凝胶上从左到右相应于5yg、2.5yg、1.25iig、0.67iig。适当的多孔膜包括那些由芳香砜聚合物、聚四氟乙烯、全氟热塑聚合物、聚烯烃聚合物、超高分子量聚乙烯、聚酰胺类(包括尼龙6和尼龙66)以及聚偏氟乙烯形成的多孔膜，尤其优选聚偏氟乙烯。多孔膜包括微孔膜和超滤膜，优选是片的形式。通常平均孔大小包括那些在0.001和10微米之间的。印迹膜通常是0.45iim孔大小的材料。优选的起始膜具有的孔隙率(空体积)范围为68-73%。印迹膜通常是对称的，然而，也可对不对称的膜应用涂层。聚合涂层可以是共聚物或三元共聚物，所述共聚物或三元共聚物由至少一种用至少一种亲水性官能团修饰的多官能单体形成，所述亲水性多官能单体选自多官能丙烯酰胺、多官能异丁烯酰胺和二丙烯基哌嗪，和由至少一种用至少一种亲水性官能团修饰的单官能单体形成，所述亲水性单官能单体选自单官能丙烯酰胺、单官能异丁烯酰胺和丙烯基哌嗪。已发现多孔疏水膜，优选由涂层了交联丙烯酰胺_亚甲基双丙烯酰胺共聚物的聚偏氟乙烯制备的膜，可制成高度亲水性的。进一步的，在本发明的早期重复中应用于多孔PVDF膜样品的共聚物水平下，IgG结合试验表明蛋白结合的水平在400iig/cm2左右。该水平是典型的亲本疏水PVDF膜和常规硝酸纤维素膜的水平。第一个令人惊讶的结果是由此制备的膜均为亲水性的，并且是高蛋白结合的。然而，这些最初样品(表现该高水平蛋白结合的那些)的蛋白质印迹性能在维持小样品印迹尺寸(印迹形态)和印迹转移中的样品捕获方面是不令人满意的。通过改变共聚物涂层水平，实现了满意的印迹性能。在这些改变的水平下，蛋白质结合水平减少至250和325(00)iig/cm2之间，但蛋白质印迹性能升高至硝酸纤维素和优选的亲本疏水PVDF膜之间的水平。令人惊讶的，本发明人发现该蛋白质结合水平并非最佳或唯一的蛋白质迹膜性能的预测者。通过修饰基质上的涂层水平牺牲某些蛋白质结合能力可导致改善的印迹性能。这样，修饰制剂的成分水平和相对浓度对于获得可接受的免疫检测试验性能是重要的。高度特异性的成分比例中低的总固体浓度平衡了水湿润性能和印迹性能之间的关系。基质膜非常低的背景荧光水平也得以保留。但是，如果表面修饰化学的水平太低，其结果是膜的水可湿润性不能达到可接受程度。如果表面修饰的水平太高，所得到的膜具有非常高的表面能。如前所述，在较高水平的表面修饰化学下，测定的蛋白质结合能力基本上与硝酸纤维素和疏水PVDF膜相同，但得到的电印迹性能较差。根据特定的实施方案，修饰/反应物溶液中的总固体水平调节为按重量计0.90%和1.10%之间。该范围内的总固体浓度与特定的成分比例一起导致了最佳的印迹性能。该制剂包括紫外光引发剂成分。在反应物溶液中，适量的丙烯酰胺单官能单体和双丙烯酰胺交联单体为按重量计0.20和2.00%之间(各自)，优选量为按重量计O.30%和0.60%之间(各自)，最优选为按重量计0.40%和0.50%之间(包含端点的，各自)。单体反应物溶液优选的丙烯酰胺和双丙烯酰胺比例为约i:1(质量/质量)。优选的，丙烯酰胺亚甲基双丙烯酰胺单体反应物溶液中的总单体浓度为按质量计0.5%和1.5%之间。适当的紫外光引发剂成分为按重量计0.01%到0.20%，优选按重量计0.05%到0.15%，最优选为按重量计0.09%到0.11%。适当的紫外光引发剂包括Irgacure500、754、2959和819DW。根据特定的实施方案，用于制备所述修饰的多孔膜基质的方法包括下列步骤提供多孔膜基质，使所述多孔膜基质的表面与包含丙烯酰胺、亚甲基双丙烯酰胺以及适当的光引发剂的反应物溶液接触，从溶液中除去膜，以及通过在适当的时间间隔内将膜基质暴露于适当波长和强度的辐射下在膜基质上原位聚合所述涂层。优选的所述与反应溶液接触的多孔膜用紫外光源照射。可以使用滤光器来减少或消除对该多孔膜有害的波长。在紫外光下的暴露时间及其强度对于本领域技术人员是熟知的。在本发明优选的实施方案中，反应物单体溶液的实验室规模制备如下进行将1.OOg丙烯酰胺[H2C=CH-C(0)-NH2]单官能单体，O.80g亚甲基双丙烯酰胺[H2C(-NH-C(0)CH=CH2)2]交联单体和0.20gIrgacure2959光引发剂溶解于198.OOgMilli-Q⑧水中。需要约2小时的延长的混合间隔来使得所述交联物和光引发剂完全溶解。更具体而言，所述多孔疏水起始膜通过浸入有机液体或其水溶液中进行预湿润，所述有机液体或其水溶液不使多孔膜膨胀或溶解，并且预湿润膜的整个多孔表面。所述液体可以是低分子量醇，或水和可混合的有机液体的混合物。合适的液体或组合物包括具有足够低的表面张力的甲醇、乙醇、异丙醇、其水混合物、丙酮/水混合物以及四氢呋喃/水混合物，以影响对整个膜表面的湿润。该预湿润步骤的目的是保证整个膜表面变成通过水以及随后的所述水性反应物单体溶液可湿润的。该预湿润步骤必须紧跟严格的与水的交换步骤，以除去有机溶剂。这些预湿润溶剂或其水混合物会对所需的反应物单体聚合作用产生不利影响。随后将所述水-湿润的多孔膜浸入反应物溶液中，并轻柔搅拌，使得该多孔膜的整个表面被反应物溶液湿润。只要在浸入反应物溶液前从膜上除去过量的水，不会发生反应物溶液的显著稀释。短时间(2分钟)后取出样品，从膜样品中除去过量的反应物溶液。该反应物溶6液湿润的膜在无氧条件下暴露于紫外光辐射下，使得聚合反应直接发生在整个多孔膜表面上。所得的被涂层的膜表现出当与水表面接触时，被迅速、完全和彻底均匀湿润；高水平的蛋白质印迹性能；以及高水平的蛋白质结合(>250g/cm2IgG)、由放射标记检测测定；以及低背景的荧光(约2000rf满485nm/535nm激发/发射波长，采用TECANGENiosFL荧光读数器，检测器放大设定为86，使用Magellan5.0软件包)、其约为同样测量条件下未处理(未修饰的亲本疏水)膜背景荧光的2倍。当置于饱和的氯化铝水溶液表面时，所述膜将在最小时间间隔(不低于1秒)和最大时间间隔(可超过60秒)内完全湿润。具体实施方式实施例1来自Millipore公司的可商业获得的疏水PVDF膜(IPFLOOOOO)浸于甲醇中。取出该膜，浸入水中搅拌1分钟以提取甲醇。取出膜，浸入新鲜水中另外2分钟，随后在浸入反应物单体溶液之前再次置于新鲜水中。从膜上除去过量的水，随后将膜浸入反应物单体溶液中，轻柔搅拌2分钟。随后在紫外光处理过程中，将膜从两侧暴露于紫外光下，线速度为15-25fpm。回收膜，置于水浴中除去未反应的单体和未附着的寡聚物和聚合物。样品通过以下方式干燥在室温下空气中干燥过夜，或在静力空气烘箱中于6(TC和8(TC之间干燥10分钟，或在冲击式干燥器(imipngementdryer)上以15_25fpm的线速度在90-110。C下干燥。由室内TOC(总有机碳)方法测定的平均膜可提取物为约1.44iig/cn^，如表1所示。表1-总有机碳(TOC)_五(5)个47mm的盘<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>用HPLC测定平均可提取的残余单体水平。表2中提供了3个样品的测定值。表2.HPLC测定的可提取单体水平_与表1中所示同样的样品。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>实施例2采用实施例1中所述步骤处理PVDF膜，其洗明、处理条件和反应物溶液见表3A-D、4A-D禾卩5A-D所示。COC9CMCMCMCOCOCO彬<z<z<驟驟瞎如<a啦啦4口啦啦<n4n啦如■lisnffl一S^^5S^一起始膜性质I流动时间I翁BblPt(psi)孔隙率(%)厚度(Wn)淫抑继干燥器温度(F)紫鹏批数据长■ml啦驟批次#I登记号戦薪适邀slf塌&gf5細daAd长嵌蹈磁啦瞎拔银SA歐》-5t^啦驟w-^s寸I.zlzool.zo,lIldl寸一.212SHZ0,-;ldlKzl卜ool.卜o,l:kJ一90zl200I.zo.ucil9021200l.zoldd一902卜22H卜01dcJI9S1200Co1Jdl9031Z00l.zcndd一90SlZ00U01:ldlS031/00I.201Jd一902卜22HZ0J!id一寸I.zlZOO1.20l匕d一6§卜C29§2C2i8<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表3D亲水性PVDF蛋白质印迹膜的修饰数据<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>表5B亲水性PVI)F蛋A质印迹膜的修饰数据<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>部分l:诊断部分2:干燥器温度&线速度变化部分3:孔隙率和厚度变化一起始膜<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>[OO54].蛋白质样品使用Bis:Tfis(4-12%)midi梯度凝胶(Invitrogen，WG1402B0X)电泳分离。.使用BioRadtank转移仪(CriterionBlotter#165_6024)在45V下电印迹样品1小时15分钟至实施例1中制备的亲水膜上。将印迹在TBS-T(0.1%吐温)中洗涤2次(每次3分钟)。RT下将印迹在含3%NFM(脱脂奶，Carnation)的TBS-T中封闭1小时。将印迹在TBS-T(0.1%吐温)中洗涤2次(每次3分钟)。将印迹与第一抗体在TBS-T中孵育1小时。将印迹在TBS-T(0.1%吐温)中洗涤3次(每次5分钟)。将印迹与第二抗体在TBS-T中孵育1小时。将印迹在TBS-T(0.1%吐温)中洗涤4次(每次5分钟)。采用ECL(MilliporeImmobilon-HRP)禾PX射线胶片可视化蛋白条带。该方案用于实施例2中制备的样品，印迹结果示于图1、2和3中。典型的研发实验的蛋白质印迹结果表明了本发明亲水性PVDF印迹膜和对照(FL-疏水PVDF膜，和NC-Whatman/S&SBA-85膜)的性能差异。图中每一水平条带含有5个分开的蛋白质转移印迹；三个印迹位于亲水PVDF开发的样品上，每个对照膜上一个。每一条带的5个蛋白质印迹均来自一个电泳和转移实验(每次试验使用5个凝胶)。通过设计，电泳和转移前每次试验条件相同，蛋白质样品的量也相同(对于每个凝胶应用于4个泳道)。显示的结果是从复杂的样品混合物(溶胞产物)中检测2种蛋白(HSP70和GAPDH)的转移印迹，使用递减的样品固体(浓度)，从左到右相应于5iig、2.5iig、1.25iig和0.67iig。注意在每一排(单次电泳和电印迹试验的结果)中，本发明的三片亲水性印迹膜与两片对照印迹膜相比较。一片对照由硝酸纤维素印迹膜(NC)组成，另一对照是疏水PVDF印迹膜(FL)。在每次单独试验的情况下，对于4个滴度的分析蛋白质溶液，FL膜显示最高的信号强度，NC膜显示了最低的信号强度。可以发现，当比较NC对照印迹膜和本发明的亲水性PVDF印迹膜的信号强度时，在最高的分析样品滴度下(每个印迹的左侧端)，NC和亲水性PVDF膜显示了类似的信号强度。然而，随着分析样品滴度(从左到右进行)的降低，NC膜的信号强度下降更快，这表明所述亲水性PVDF膜允许检测的样品蛋白质浓度比NC膜更低。20权利要求一种包括聚合基质膜的多孔膜，所述聚合基质膜表面被包含丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺的交联聚合涂层修饰，其中所述涂层使所述表面成为亲水性的，并且其中所述表面具有蛋白质结合能力，其通过IgG结合试验测定为约250-325μg/cm2。2.权利要求1的多孔膜，其中所述膜的平均总有机碳水平低于1.5iig/cn^，并且其中由HPLC测定的可提取单体水平对于丙烯酰胺来说低于0.02g/cn^，对于亚甲基双丙烯酰胺来说低于O.15iig/cm2。3.权利要求l的多孔膜，其中所述基质具有背景荧光值，并且其中所述修饰的膜在同样测量条件下显示约两倍于所述基质背景荧光值的背景荧光。4.权利要求1或3的多孔膜，其中所述膜基质包含聚偏氟乙烯。5.权利要求1或3的多孔膜，其中单体反应物溶液中丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺的比例约为1:1(质量/质量)。6.权利要求1或3的多孔膜，其中丙烯酰胺亚甲基双丙烯酰胺单体反应物溶液中总的单体浓度在按质量计0.5%-1.5%之间。7.权利要求1或3的多孔膜，其中光引发剂水平在0.01%-0.20%之间。8.—种制备亲水性、低背景荧光、高蛋白结合多孔膜的方法，所述膜包含疏水、低背景荧光、高蛋白结合的多孔膜基质，以及低背景荧光表面修饰，所述方法包括提供疏水、低背景荧光、高蛋白结合的多孔膜基质；使所述多孔膜的表面与单体反应物溶液接触，所述溶液包含丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺以及光引发剂；从反应溶液中除去所述膜；除去过量的反应物溶液；在无氧条件下将所述丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺反应物溶液直接聚合至整个疏水多孔膜表面，形成连续的亲水低背景荧光背景涂层；以及干燥所述膜。9.权利要求8的方法，其中所述反应溶液中丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺的量分别为0.50%和0.40%。10.权利要求8的方法，其中所述反应溶液中光引发剂Irgacure2959的量为0.10%。全文摘要本发明涉及亲水的高蛋白结合的低荧光蛋白质印迹膜，所述膜特别适于印迹应用、优选蛋白质印迹。优选由PVDF制备的预湿润疏水膜基质与单体溶液接触，进行紫外光起始的自由基聚合步骤，使得该基质具有持久的亲水性。所形成的膜显示低背景荧光、高蛋白结合、优良的蛋白样品印迹形态保留以及扩大的动态范围(高信噪比，提高的样品可检测性)。该膜在蛋白质印迹应用中，尤其在低样品浓度蛋白检测中显示了比得上常规硝酸纤维素蛋白质印迹膜或比常规硝酸纤维素蛋白质印迹膜更高的性能，其可以直接用水湿润，而不需要使用前用醇预湿润。文档编号B01J20/285GK101703923SQ20091017338公开日2010年5月12日申请日期2009年8月17日优先权日2008年8月18日发明者A·彼得斯,A·德代奥,D·布鲁斯特,J·查库迪安,N·索伊斯,P·戈达申请人:米利波尔有限公司