血清淀粉样蛋白a的荧光免疫层析检测方法及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种血清淀粉样蛋白A的检测方法及试剂盒，尤其涉及血清淀粉样蛋白A的荧光免疫层析检测方法及其检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]血清淀粉样蛋白A(serum amyloid Aprotein，SAA)是一类多基因编码的多形态蛋白家族，是组织淀粉样蛋白A的前提物质，属于急性时相反应蛋白，其相对分子量约12000。在急性时相反应中，如炎症或感染急性期，经IL-1、IL-6和TNF刺激，SAA在肝脏中由被激活的巨噬细胞和纤维母细胞合成，在48?72小时内浓度迅速升高，可升高到最初浓度的100?1000倍，但其半衰期短，只有50分钟左右，并在疾病恢复期迅速下降。某些疾病，如病毒感染、移植排斥反应、冠心病等，SAA的敏感性尚于C反应蛋白(CRP)，可为临床提供更好的参考价值，作为一个新的检测指标，SAA受到人们越来越多的关注。
[0003]—方面，SAA的重要特性对在急性排异方面有很大的诊断价值。SAA的降解产物能以淀粉样蛋白A(AA)原纤维的方式沉积在不同的器官中，在慢性炎症疾病中这是一种严重的并发症。正常人血清SAA浓度平均值为2.33mg/L，SAA浓度的测定对于肾移植急性排异反应的诊断比血清Cr更为敏感。例如在排除感染的情况下，SAA的异常升高对诊断肾移植急性排异反应具有很大价值。
[0004]另一方面，SAA反应灵敏，尤其对“正常”与微小急性相反应可提供更好的鉴别。通常人体炎性反应约8h后SAA开始升高，且超过参考范围上限时间早于CRP，CRP健康人体中位数值与参考范围上限的差距大约10倍，而在SAA中仅有5倍。如许多病毒感染等轻微感染，SAA升高要比CRP更为常见，在感染性等疾病，SAA的绝对上升要高于CRP。又如，通常约2/3感冒患者SAA升高，但少于1/2的患者相同表现CRP升高，在病毒感染病例中，SAA和CRP浓度升高见于腺病毒感染者。在其他疾病方面，如在红斑狼疮和溃疡性结肠炎SAA并不升高。恶性肿瘤转移阶段SAA升高通常比肿瘤局限于器官阶段显示较高的数值。在移植排异方面，对一项肾移植受者的研究中，97%的发生排异的检查是依据SAA的升高，在不可逆转的移植排异检测中，其平均浓度达690 ± 29mg/L，而可逆排异发作病例的相关水平为271 ± 3 lmg/L。在类风湿性关节炎、结核病或麻风病方面，SAA浓度的慢性升高，是合成AA-淀粉纤维的先决条件，也被用来诊断继发性淀粉样变性病变。因此SAA的测定为临床提供更好的参考价值。
[0005]目前国内国外已有的的SAA检测方法多样化，如采用酶联免疫吸附试验、放射性免疫测定法、乳胶增强比浊法等方法进行SAA检测。但这些方法检测步骤多，需要相关的生化仪器进行检测，成本较高，不适用于一般的小型或中型医院。相对于上述检测方法，荧光层析免疫分析方法是一种微量分析方法，具有高灵敏度、设备简单易得和操作简便等优点。
[0006]中国专利CN10376455B公开了一种免疫胶体金法定量检测血清淀粉样蛋白A的试剂盒，通过抗SAA免疫胶体金和包被在反应板上的另一 SAA单抗或多抗与待测样品中的SAA结合，将胶体金固定在反应板上，通过金标定量仪测定SAA含量。该方法需要将免疫胶体金进行冻干保存，检测之前进行复溶，反应板在反应之前需要进行封闭，然后加入样品进行反应，反应结束后反应板需要洗涤完毕才能进行检测。该法整个检测过程较长，操作较多，需要相关的设备，检测成本高。
[0007]中国专利CN104569414A公开了一种胶体金免疫层析法联合检测降钙素原/血清淀粉样蛋白A(PCT/SAA)的试纸条，在硝酸纤维素膜上包被抗SAA单克隆抗体，与样品中的SAA和标记有配对的抗SAA单克隆抗体的胶体金相结合，配合免疫层析读数仪，快速检测SAA。该方法快速、简便，检测结果易于判断，适用于定性检测，对于SAA含量的准确定量仍然不能满足需求。
[0008]因此，如何开发检测时长短、操作方便、检测结果精确的血清淀粉样蛋白A检测方法和检测产品成为亟待解决的问题。
【发明内容】
[0009]为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种灵敏度高、准确度高、操作简单、成本低的血清淀粉样蛋白A的检测方法及试剂盒。
[0010]本发明一种血清淀粉样蛋白A的荧光免疫层析检测方法，包括以下步骤:
[0011]步骤I)探针固定垫制备:将血清淀粉样蛋白A单克隆抗体按比例与活化白蛋白荧光胶乳微粒偶联反应制得血清淀粉样蛋白A单克隆抗体荧光胶乳微粒，再将所述血清淀粉样蛋白A单克隆抗体荧光胶乳微粒与羊抗兔IgG荧光胶乳微粒按一定比例混合得到混合荧光胶乳微粒，所述混合荧光胶乳微粒用荧光探针微球稀释液稀释后喷在玻璃纤维上制得探针固定垫；
[0012]步骤2)免疫层析试纸条制备:将样品垫、探针固定垫、层析膜、吸水纸依次贴在PVC衬板上，将所述血清淀粉样蛋白A单克隆抗体包被在层析膜的检测线上，将羊抗兔IgG包被在层析膜控制线上，进而制得免疫层析试纸条，所述层析膜优选硝酸纤维素膜；
[0013]步骤3)样品稀释液制备:将包括有牛血清白蛋白、表面活性剂、分散剂和防腐剂的混合物与缓冲液混合均匀制得样品稀释液；
[0014]步骤4)样品检验:取血清样品混合至所述样品稀释液，加入免疫层析试纸条进行免疫层析反应，层析反应结束后经荧光检测器荧光检测。
[0015]本发明进一步地，步骤I)中，所述活化白蛋白荧光胶乳微粒的制备是先将荧光胶乳微粒与活化剂反应制得活化荧光胶乳微粒，再与白蛋白按比例偶联反应得白蛋白荧光胶乳微粒，所述白蛋白与活化荧光胶乳微粒的比例为0.05:100?0.2:100，所述白蛋白荧光胶乳微粒进一步与活化剂反应制得所述活化白蛋白荧光胶乳微粒。
[0016]本发明更进一步地，步骤I)中，所述羊抗兔IgG荧光胶乳微粒的制备是将羊抗兔IgG按比例与活化荧光胶乳微粒偶联反应制得，所述羊抗兔IgG与活化荧光胶乳微粒的混合比例为0.05:100 ?0.2:100。
[0017]本发明更进一步地，步骤I)中，所述活化剂包括1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺，二者重量比为1:6?1:1，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与荧光胶乳微粒的重量比为1:100?5:100。三者混合后可在室温下反应0.5?lh。
[0018]本发明进一步地，所述白蛋白的种属包括人、牛、羊或鼠。
[0019]本发明进一步地，步骤I)中，所述血清淀粉样蛋白A单克隆抗体与活化荧光胶乳微粒的混合比例为0.05:100?0.2:100，混合后可在室温下偶联反应I?5h;所述血清淀粉样蛋白A单克隆抗体荧光胶乳微粒和羊抗兔IgG荧光胶乳微粒相混合的比例2:1?6:1，混合后室温下偶联反应I?5h。
[0020]本发明进一步地，步骤I)中，将混合荧光胶乳微粒用荧光探针微球稀释液稀释2?6倍，以2?6ul/cm的速度均匀喷在宽度为0.7?1.3cm的玻璃纤维上，在30?55°C下干燥2?24h后制得探针固定垫。
[0021]本发明进一步地，所述荧光探针微球稀释液为含有蔗糖、牛血清白蛋白和表面活性剂的缓冲液，所述缓冲液包括PBS缓冲液、Tr i s缓冲液、MES缓冲液、HEPES缓冲液中的一种或几种，所述表面活性剂为吐温20或吐温80。
[0022]本发明进一步地，步骤3)中，所述缓冲液包括PBS缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、MES缓冲液、HEPES缓冲液中的一种或几种，所述表面活性剂为吐温20、吐温80、曲拉通X-100或聚乙二醇，所述防腐剂为叠氮钠或proclin，所述分散剂为聚乙烯吡咯烷酮10K、聚乙烯吡咯烷酮40K或聚乙烯醇。
[0023]另一方面，本发明一种血清淀粉样蛋白A的荧光免疫层析检测试剂盒，包括试剂盒体以及稀释液瓶，所述试剂盒体包括，所述免疫层析检测卡包括PVC衬板以