专利名称：用于治疗青光眼的血清淀粉状蛋白A的RNAi抑制的制作方法
技术领域：
本发明涉及干扰RNA组合物用于抑制青光眼、尤其是原发性开角型青光眼中血清淀粉状蛋白A(SAA)表达的领域。
背景技术：
青光眼是共有某些临床特征的一组多样的视神经病。青光眼中视力损失的原因是神经视网膜中视网膜神经节细胞的选择性死亡，该选择性死亡在临床上通过视野特征性改变、神经纤维层缺陷和视神经头(ONH)进行性杯化来诊断。青光眼发展的一个主要风险因素是高眼压症(升高的眼内压力，Ι0Ρ)的存在。需要足够的眼内压力以维持眼的形状并提供压力梯度以允许房水流向无血管的角膜和晶状体。IOP似乎还参与正常张力青光眼的发病机制，此时常认为患者具有正常的Ι0Ρ。与青光眼相关的升高的IOP的原因是位于眼前房虹膜角膜角内一小片特化组织-小梁网(TM)中升高的房水流出阻力。TM的青光眼性改变包括TM细胞的损失和胞外残片(包括蛋白斑样物质)沉积和聚集。此外，还发生青光眼性ONH的改变。在青光眼性眼中，ONM神经胶质细胞中存在形态学改变和运动性改变。作为对升高的IOP和/或短暂缺血性损伤的反应，ONH胞外基质组成发生改变以及神经胶质细胞形态学和视网膜神经节细胞轴突形态学发生改变。原发性青光眼因具有解剖学或生理学基础的眼内液体流动紊乱造成。继发性青光眼因眼的外伤或创伤或宿疾发生。原发性开角型青光眼(POAG)，也称作慢性或单纯性青光眼，占全部原发性青光眼的90%。POAG以小梁网的退化为特征，该退化导致对来自眼的液体排出有异常高的阻力。这种阻力的后果是IOP的增加，这种增加为推动由眼正常产生的液体克服这种增加的阻力所需要。目前的抗青光眼疗法包括通过使用房水形成抑制剂或增强葡萄膜巩膜流出的药剂降低Ι0Ρ、激光小梁成型术或作为旨在改善排出的滤过手术的小梁切除术。药物抗青光眼方法已经显示出多种有害副作用。例如，缩瞳药如毛果芸香碱可以引起视力模糊和其它不利的视觉副作用。全身施用的碳酸酐酶抑制剂还可以引起恶心、消化不良、疲劳和代谢性酸中毒。另外，某些β-阻断剂已经日益与严重的肺部副作用相关，其原因是β-阻断剂对肺组织中β-2受体的影响。拟交感神经药引起心动过速、心律不齐和高血压。此类副作用可以导致患者适从性降低或终止治疗。更重要地是，目前的抗青光眼疗法不直接解决持续无法缓解的对小梁网、视神经的病理性损伤以及视网膜神经节细胞和轴突的损失。鉴于青光眼的重要性以及目前治疗方法的不当，拥有对付青光眼发展基础性原因的治疗青光眼的改良方法会受到欢迎。发明简述
本发明涉及靶向SAA mRNA并因此干扰SAA mRNA表达的干扰RNA。本发明的干扰 RNA用于治疗SAA相关性青光眼。本发明的实施方案提供减弱受试者眼中血清淀粉状蛋白A mRNA表达的方法。该方法包括向受试者眼中施用包含有效量的19至49个核苷酸长度的干扰RNA(如双链(ds) siRNA或单链(ss)siRNA)和可药用载体的组合物。双链siRNA包含有义核苷酸序列、反义核苷酸序列和至少19个核苷酸接近完全连续互补的区域。此外，反义序列在生理条件下与对应于SEQID NO :1、SEQ ID NO 2或SEQ ID NO :3的mRNA的一部分杂交，并具有与分别对应于SEQ ID NO =USEQ ID NO :2或SEQ ID NO :3的mRNA的杂交部分有至少19个核苷酸接近完全连续互补的区域，其中SEQ ID NO :1、 SEQ ID NO :2 或 SEQ ID NO 3 是分别编码 SAA1、SAA2 和 SAA4 的 DNA 的有义链(GenBank 参考号NM_000331、BC020795和NM_006512)。此组合物的施用减弱受试者眼中血清淀粉状蛋白A mRNA的表达。当干扰RNA是单链时，干扰RNA包含具有与对应于SEQ ID NO =USEQ ID NO :2或 SEQ ID NO 3的mRNA的杂交部分有至少19个核苷酸接近完全连续互补的区域的核苷酸序列。在本发明的一个实施方案中，将反义siRNA设计成靶向对应于SEQ IDNO :1的mRNA 中在230、357、362、380、447、470、527、531、548或557位核苷酸处起始的核苷酸序列。在本发明另一个实施方案中，将反义siRNA设计成靶向对应于SEQ ID NO 2的mRNA中在43、 170、175、193、沈0、观3、339或370位核苷酸处起始的核苷酸序列。在本发明又一个实施方案中，将反义siRNA设计成靶向对应于SEQ ID NO :2的mRNA中在252、271、276、325或343 位核苷酸处起始的核苷酸序列。在本发明的又一个实施方案中，将反义siRNA设计成靶向对应于 SEQ ID NO 3 的 mRNA 中在 153、166、222、227、251、268、297、335、356、384、390、396、 406或423位核苷酸处起始的核苷酸序列。本发明的又一个实施方案是治疗有此需要的受试者中血清淀粉状蛋白A相关性青光眼的方法。该方法包括向受试者眼中施用包含有效量的19至49个核苷酸长度的干扰 RNA和可药用载体的组合物，其中干扰RNA包含有义核苷酸序列、反义核苷酸序列和至少19 个核苷酸接近完全连续互补的区域。反义序列在生理条件下与对应于SEQ ID NO=USEQ ID NO :2或SEQ ID NO :3的mRNA的一部分杂交，并具有与分别对应于SEQ IDNO =USEQ ID NO: 2或SEQ ID NO 3的mRNA的杂交部分有至少19个核苷酸接近完全连续互补的区域。血清淀粉状蛋白A相关性青光眼因此得到治疗。附图简述
图1提供SAAanRNA/18s rRNA比率的QPCR分析以检查siRNA对用靶向SAA mRNA 的SMARTPOOL SiRNA转染的NTM 765正常小梁网细胞中内源性SAA mRNA的影响。 使用三个不同浓度的Dharmafect#l试剂将小梁网细胞用IOOnM siRNA转染M小时Con 对照；处理1 以0. 05 μ 1/100 μ 1孔处理的处理1 ；处理2 以0. 2 μ 1/100 μ 1孔处理的处理 2 ；处理3 以0.4 μ 1/100 μ 1孔处理的处理3。图2提供SAAanRNA/18s rRNA比率的QPCR分析以检查siRNA对用靶向SAA mRNA 的SMARTPOOL siRNA转染的GTM686青光眼小梁网细胞中内源性SAA mRNA的影响。 使用三个不同浓度的Dharmafect#l试剂将小梁网细胞用IOOnM siRNA转染M小时Con 对照；处理1 以0. 05 μ 1/100 μ 1孔处理的处理1 ；处理2 以0. 2 μ 1/100 μ 1孔处理的处理 2 ；处理3 以0. 4 μ 1/100 μ 1孔处理的处理3。* 通过单因素方差分析和Newman-Keuls多重比较检验，相对于对照和处理Ip < 0. 05。图3提供SAA siRNA处理对正常小梁网细胞(NTM 765-04)和青光眼小梁网细胞(GTM 686-03)的生长和形态学影响的实时电子监测(RE-CES )。使用三个不同浓度的 Dharmafect#l 试剂将细胞用 IOOnM 靶向 SAA mRNA 的SMARTPOOL siRNA 转染 48 小时T1 :0. 05 μ 1/100 μ 1 孔；Τ2 :0. 2 μ 1/100 μ 1 孔；Τ3 :0. 4 μ 1/100 μ 1 孑L。图4提供经siRNA处理的NTM765正常小梁网细胞裂解物中内源性SAA蛋白水平的 ELISA测定结果。使用三个不同浓度的Dharmafect#l试剂将细胞用IOOnM靶向SAA mRNA 的SMARTPOOL SiRNA转染48小时处理1 以0. 05 μ 1/100 μ 1孔处理的处理1 ；处理2 以0. 2 μ 1/100 μ 1孔处理的处理2 ；处理3 以0. 4 μ 1/100 μ 1孔处理的处理3。图5提供经siRNA处理的GTM686青光眼小梁网细胞裂解物中内源性SAA蛋白水平的ELISA测定结果。使用三个不同浓度的Dharmafectiil试剂将细胞用IOOnM靶向SAA mRNA的SMARTPOOL siRNA转染48小时处理1 以0. 05 μ 1/100 μ 1孔处理的处理 1 ；处理2 以0. 2 μ 1/100 μ 1孔处理的处理2 ；处理3 以0. 4 μ 1/100 μ 1孔处理的处理3。 * 通过方差分析和Bonferroni ‘ s多重比较检验，相对于对照ρ < 0. 05 ； * * 相对于对照 ρ < 0. 01。发明详述称作“RNAi”的RNA干扰是用于降低受单链或双链小RNA分子作用的靶基因表达的方法。干扰RNA包括双链或单链的小干扰RNA (ds siRNA或ss siRNA)、微RNA (miRNA)、 小发夹RNA(shRNA)及其它。不希望受理论的约束，RNA干扰似乎在体内发生，伴随着dsRNA 前体被切割成为长度约20至25个核苷酸的小RNA。切割由RNA酶III-RNA解螺旋酶Dicer 完成。siRNA的“有义”链(即与靶mRNA序列完全相同的链)被除去，留下与靶mRNA互补的“反义”链以发挥降低mRNA表达的作用。siRNA的反义链似乎将称作RISC (RNA诱导性沉默复合体)的蛋白质复合体引导至mRNA，该复合体随后通过RISC的Argonaute蛋白质切割 mRNA,因而降低通过该mRNA的蛋白质产生。干扰RNA是催化性的并且降低mRNA的表达可以用相对于mRNA而言亚化学计量数量的干扰RNA实现。mRNA表达的降低还可以通过翻译和转录机制实现。本发明涉及干扰RNA用于在眼病中抑制血清淀粉状蛋白A(SAA)表达的用途。根据本发明，外源提供的siRNA在眼结构中引起SAA mRNA沉默。本发明人先前已经证实在青光眼性TM组织和细胞中血清淀粉状蛋白A(SAA)mRNA和蛋白质的表达显著上调(于2003 ip 12 ^ 17 HiItiiW^^ "Use of Serum Amyloid A Gene in Diagnosis and Treatment ofGlaucoma and Identification of Anti-Glaucoma Agents" W^M^i^W^H^^JΦ 请USSN 60/530, 430) 0本发明人已经证实使用Affymetrix基因芯片通过实时定量聚合酶链式反应(QPCR)观察到差异性mRNA表达并通过SAA ELISA观察到增加的SAA蛋白质水平 (如上提及的悬而未决的美国专利申请，本文中完整地引用作为参考)。除非另外说明，本文中提及的核酸序列以5'至3'方向书写。术语“核酸”，如本文中所用，指DNA或RNA或其修饰的形式，包含存在于DNA中的嘌呤或嘧啶碱基(腺嘌呤 “A”、胞嘧啶“C”、鸟嘌呤“G”、胸腺嘧啶“T”)或存在于RNA中的嘌呤或嘧啶碱基(腺嘌呤“A”、胞嘧啶“C”、鸟嘌呤“G”、尿嘧啶“U”)。虽然“T”碱基未天然地存在于RNA中，但本文中提供的干扰RNA包含“T”碱基，尤其在端包含“T”碱基。“核酸”包括术语“寡核苷酸” 和“多核苷酸”并且可以指单链分子或双链分子。双链分子通过A和T碱基、C和G碱基以及A和U碱基之间的Watson-Crick碱基配对形成。双链分子的链可以具有彼此部分的、大部分的或完全的互补性并且形成杂种双链体，其结合强度取决于碱基序列互补性的性质和程度。mRNA序列通过获知编码该mRNA的DNA的有义链或反义链序列容易地加以确定。例如，SEQ ID NO 1提供对应于血清淀粉状蛋白Al mRNA的DNA的有义链序列。mRNA的序列与将“T”碱基换成“U”残基后的DNA有义链的序列完全相同。因此，血清淀粉状蛋白Al的 mRNA序列从SEQ ID NO 1中获知，血清淀粉状蛋白A2的mRNA序列从SEQ ID NO :2中获知， 血清淀粉状蛋白A4的mRNA序列从SEQ ID NO 3中获知。血清淀粉状蛋白A mRNA 人血清淀粉状蛋白A包含众多差异性表达的小的脱脂载脂蛋白，其由位于11号染色体短臂上的基因编码。SAA存在四种同种型。在ncbi.nlm.nih.gov上的国立生物技术信息中心GenBmk数据库提供血清淀粉状蛋白Al的信使RNA的相应DNA序列，参考号NM—000331，作为SEQ ID NO :1提供如下。血清淀粉状蛋白Al的编码序列来自核苷酸 2邪-593。SAAl :SEQ ID NO 1
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aaggctcagt cagcacagat ctttcccaac taccattctg gcctggtttt gcgaggcttt attacatcgg gacctggggg tctttggcca gtggcaaaga cttcactctg gagagggtac aa
ataaatagca caggtgagga aagattatca aaggtgtctt ctgctccttg tgatggggct ctcagacaaa tgcctgggct tggtgcggag ccccaatcac ctctcaggag acaatgggta
gccaccgctc gcacaccaag tttcctttaa atctcctctg gtcctgggtg cgggacatgt tacttccatg gcagaagtga gactcgctgg ttccgacctg atctggctgt
cctggcaggc gagtgatttt aaaaaatagt atctagagag tcagcagccg ggagagccta ctcgggggaa tcagcgatgc ctgatcaggc ctggcctgcc gaggccctca acttaagagg
agggacccgc taaaacttac tatcctgggg caccatgaag aagcttcttt ctctgacatg ctatgatgct cagagagaat tgccaatgaa tgagaaatac gggcagggat tggaaaaaaa
agctcagcta tctgttttct catacagcca cttctcacgg tcgttccttg agagaagcca gccaaaaggg atccagagat tggggcagga tgagcttcct acaaagcggg上述SAAlmRNA序列的等效物是可变剪接形式、等位基因形式或其同族形式。同族形式是来自另一个哺乳动物物种的与SEQ ID N0:1同源的血清淀粉状蛋白AlmRNA。 与SEQ ID NO 1相关的SAAl核酸序列是具有GenBank登录号NM_009117 (来自小鼠)、NM_199161 (人转录变体 2)、BC007022. 1、BG533276. 1、BG567902. 1、BQ691948. 1、 CD102084. 1、M10906. 1、M23698. 1、X51439. 1、X51441. 1、X51442. 1、X51443. 1 和 X56652. 1 的那些SAAl核酸序列。GenBank数据库提供血清淀粉状蛋白A2的信使RNA的相应DNA序列，参考号NM_ BC020795 JtSSEQ ID NO :2提供如下。血清淀粉状蛋白A2的编码序列来自核苷酸38-406。SAA2 :SEQ ID NO 2
1agggacccgcagctcagctacagcacagatcagcaccatgaagcttctcaCgggCCtggt
61tttctgctccttggtcctgagtgtcagcagccgaagcttcttttcgttccttggcgaggc
121ttttgatggggctcgggacatgtggagagcctactctgacatgagagaagccaattacat
181cggctcagacaaatacttccatgctcgggggaactatgatgctgccaaaaggggacctgg
241gggtgcctgggccgcagaagtgatcagcaatgccagagagaatatccagagactcacagg
301ccatggtgcggaggactcgctggccgatcaggctgccaataaatggggcaggagtggcag
361agaccccaatcacttccgacctgctggcctgcctgagaaatactgagcttcctcttcact
421ctgctctcaggagacctggctatgaggccctcggggcagggatacaaagttagtgaggtc
481tatgtccagagaagctgagatatggcatataataggcatctaataaatgcttaagaggtc
541上述SAA2mRNA序列的等效物是可变剪接形式、等位基因形式或其同族形式。同族形式是来自另一个哺乳动物物种的与SEQ ID N0:2同源的血清淀粉状蛋白A2mRNA。与 SEQ ID NO 2相关的SAA2核酸序列是具有GenBank登录号NM_0307M (人)、BC058008. 1、 J03474.1、L05921.1、M23699.1、M23700.1、M26152. 1、X51440. 1、X51444. 1、X51445. 1 和 X56653. 1的那些SAA2核酸序列。SEQ ID NO :1禾口 SEQ ID NO 2的蛋白质产物(SAA1和SAA2)称作急性期反应物并且类似于C反应蛋白，它们由促炎症细胞因子显著上调。SAAl和SAA2蛋白质在氨基酸水平 93. 5%相同并且基因在核苷酸水平96. 7%相同。GenBank数据库提供血清淀粉状蛋白A4的信使RNA的相应DNA序列，参考号 NM_006512，作为SEQ ID NO :3提供如下。血清淀粉状蛋白A4的编码序列来自核苷酸 76-468。SAA4:SEQ ID NO3
1tatagctccacggccagaagataccagcagctctgcctttactgaaatttcagctggaga
61aaggtccacagcacaatgaggcttttcacaggcattgttttctgctccttggtcatggga
121gtcaccagtgaaagctggcgttcgtttttcaaggaggctctccaaggggttggggacatg
181ggcagagcctattgggacataatgatatccaatcaccaaaattcaaacagatatctctat
241gctcggggaaactatgatgctgcccaaagaggacctgggggtgtctgggctgctaaactc
301atcagccgttccagggtctatcttcagggattaatagactactatttatttggaaacagc
361agcactgtattggaggactcgaagtccaacgagaaagctgaggaatggggccggagtggc
421aaagaccccgaccgcttcagacctgacggcctgcctaagaaatactgagcttcctgctcc
481tctgctctcagggaaactgggctgtgagccacacacttctccccccagacagggacacag
541ggtcactgagctttgtgtccccaggaactggtatagggcacctagaggtg
601gtttgtcaaattgaSAA4是低水平组成型表达的基因。上述SAA4mRNA序列的等效物是可变剪接形式、 等位基因形式或其同族形式。同族形式是来自另一个哺乳动物物种的与SEQ ID N0:3同源的血清淀粉状蛋白A4mRNA。与SEQID NO :3相关的SAA4核酸序列是具有GenBank登录号 BC007026、M81349. 1 和 S48983. 1 的那些 SAA4 核酸序列。减弱mRNA的表达短语“减弱mRNA的表达”，如本文中所用，意指施用一定量的干扰RNA以在细胞中引起靶基因的全长mRNA水平减少，因而与具有杂乱序列的对照mRNA相比，减少mRNA翻译成为蛋白质。降低mRNA表达通常称作“敲低”mRNA。通过本文中实施方案预期敲低的表达量包括并且在50%至100%之间。然而，为了本发明的目的，无需实现此敲低水平。此外，两套干扰RNA可以各自适度有效地进行敲低，然而共同施用时，可以显著更有效地进行敲低。 在一个实施方案中，单个ds siRNA有效地敲低达70%。在另一个实施方案中，两种或多种 ds siRNA共同有效地敲低达70%。敲低通常由通过定量聚合酶链式反应(QPCR)扩增测定的mRNA水平或通过蛋白质印迹或酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定的蛋白质水平测量。蛋白质水平的分析提供对因 RNA诱导性沉默复合体(RISC)和翻译抑制所致的mRNA降解的评估。其它用于测量敲低的技术包括RNA溶液杂交、核酸酶保护、RNA印迹杂交、逆转录、用微阵列监测基因表达、抗体结合、放射免疫测定和荧光激活的细胞分析。 SAA的抑制还在人或哺乳动物中因观察到青光眼症状的改善，例如眼内压力的改善、视野损失的改善或视神经头改变的改善加以推测。本发明实施方案的干扰RNA以催化方式起作用，即干扰RNA能够以化学计量的量实现靶mRNA的抑制。与反义治疗相比，需要显著较少量的干扰RNA以产生治疗效果。双链干扰RNA 双链干扰RNA(又称作ds siRNA)，如本文中所用，具有有义核苷酸序列和反义核苷酸序列，有义序列和反义序列包含至少19个核苷酸接近完全连续互补的区域。干扰RNA 的长度包含19至49个核苷酸，并且可以包含19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、 32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48 或 49 个核苷酸。ds siRNA 的反义序列在生理条件下与SEQ ID NO =USEQ ID NO :2或SEQ ID NO :3的一部分杂交，并且具有与分别对应于SEQ ID NO =USEQ ID NO :2或SEQ ID NO :3的mRNA的杂交部分有至少19 个核苷酸接近完全连续互补的区域。siRNA的反义链是siRNA活性的定向剂，因为反义链结合至细胞内的RISC复合体， 并引导结合的复合体在与反义RNA序列互补的序列处特异性地结合至mRNA，因而允许随后通过结合的复合体切割mRNA。用来选择siRNA 的靶序列的技术通过 Tuschl，Τ.等“The siRNA UserGuide”(2004 年5月6日修订，在洛克菲勒大学网站上可获得)、通过Ambion公司网站上的506号技术公报“siRNA Design Guidelines”、通过 Invitrogen 网站(使用参数G/C 含量最小 35%，最大55% )以及通过Dharmacon网站提供。靶序列可以位于mRNA的编码区内或5'或3'非翻译区内。用于SAAl的DNA靶序列的实施方案存在于SEQ ID NO 1的核苷酸531至549处5' -TGGGGCAGGAGTGGCAAAG-3‘ SEQ ID NO :4。用于靶向SEQ DD NO 4的相应mRNA序列并在每一链上具有3' UU突出端的本发明双链siRNA是5' -UGGGGCAGGA⑶GGCAAA⑶U-3‘ SEQ ID NO 53' -UUACCCCGUCCUCACC⑶UUC-5‘ SEQ ID NO :6。该3'突出端可以具有多个“U”残基，例如在2、3、4、5和6间并包含2、3、4、5和6 个的多个“U”残基。5'端还可以具有5'核苷酸突出端。用于靶向SEQ DD NO :4的相应mRNA序列并在每一链上具有3' TT突出端的本发明双链siRNA是5' -UGGGGCAGGA⑶GGCAAAGTT-3‘ SEQ ID NO 73' -TTACCCCGUCCUCACC⑶UUC-5‘ SEQ ID NO :8。双链siRNA的链可以通过发夹环连接以形成如下单链siRNA
权利要求
1.包含有效量的19至49个核苷酸长度的干扰RNA以及可药用载体的组合物在制造用于治疗有此需要的受试者中血清淀粉状蛋白A相关性青光眼的药物中的用途；所述干扰 RNA包含有义核苷酸序列、反义核苷酸序列以及在有义序列和反义序列间有至少19个核苷酸接近完全连续互补的区域；其中反义序列在生理条件下与对应于SEQ ID NO=U SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :3的mRNA的一部分杂交，并具有与分别对应于SEQ IDNO =USEQ ID NO: 2或SEQ ID NO 3的mRNA的杂交部分有至少19个核苷酸接近完全连续互补的区域。
2.如权利要求1中所述的用途，其中组合物经局部途径、玻璃体内途径或经巩膜途径施用。
3.如权利要求1中所述的用途，其中将干扰RNA设计成靶向对应于SEQID N0:1的 mRNA中在230、357、362、380、447、470、527、531、548或557位核苷酸处起始的核苷酸序列。
4.如权利要求1中所述的用途，其中将干扰RNA设计成靶向对应于SEQID NO 2的 mRNA中在43、170、175、193、260、283、339或370位核苷酸处起始的核苷酸序列。
5.如权利要求1中所述的用途，其中将干扰RNA设计成靶向对应于SEQID NO :2的 mRNA中在252、271、276、325、343位核苷酸处起始的核苷酸序列。
6.如权利要求1中所述的用途，其中将干扰RNA设计成靶向对应于SEQID NO 3的 mRNA 中在 153、166、222、227、251、洸8、四7、335、；356、384、390、396、406 或 423 位核苷酸处起始的核苷酸序列。
7.如权利要求1中所述的用途，其还包括向受试者眼中施用第二干扰RNA，所述第二干扰RNA具有19至49个核苷酸长度，并包含有义核苷酸序列、反义核苷酸序列以及在有义序列和反义序列间有至少19个核苷酸接近完全连续互补的区域；其中第二干扰RNA的反义序列在生理条件下与对应于SEQ ID NO =USEQ ID NO :2或SEQ ID NO 3的mRNA的第二部分杂交，并且具有与分别对应于SEQ ID NO :1、SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 3的mRNA的第二杂交部分有至少19个核苷酸接近完全连续互补的区域。
8.如权利要求1中所述的用途，其中组合物包含有效量的至少四种干扰RNA的混合物和可药用载体，其中每一干扰RNA具有19至49个核苷酸长度，并且每一干扰RNA包含有义核苷酸序列、反义核苷酸序列以及在四种干扰RNA的每一干扰RNA的有义序列和反义序列间有至少19个核苷酸接近完全连续互补的区域；其中混合物的反义序列在生理条件下与对应于SEQ ID NO :2的mRNA中分别在175、252、276和325位核苷酸处起始的一部分杂交， 并具有与对应于SEQ ID NO 2的mRNA中分别在175、252、276和325位核苷酸处起始的杂交部分有至少19个核苷酸接近完全连续互补的区域。
9.包含有效量的19至49个核苷酸长度的干扰RNA和可药用载体的组合物在制造用于治疗有此需要的受试者中血清淀粉状蛋白A相关性青光眼的药物中的用途；其中干扰RNA 包含具有与对应于SEQ ID NO :1、SEQID NO 2或SEQ ID NO 3的mRNA中的杂交部分有至少19个核苷酸接近完全连续互补的区域的核苷酸序列。
10.如权利要求9中所述的用途，其中组合物经局部途径、玻璃体内途径或经巩膜途径施用。
11.如权利要求9中所述的用途，其中将干扰RNA设计成靶向对应于SEQID NO=I的 mRNA中在230、357、362、380、447、470、527、531、548或557位核苷酸处起始的核苷酸序列。
12.如权利要求9中所述的用途，其中将干扰RNA设计成靶向对应于SEQID NO 2的mRNA中在43、170、175、193、260、283、339或370位核苷酸处起始的核苷酸序列。
13.如权利要求9中所述的用途，其中将干扰RNA设计成靶向对应于SEQID NO 2的 mRNA中在252、271、276、325、343位核苷酸处起始的核苷酸序列。
14.如权利要求9中所述的用途，其中将干扰RNA设计成靶向对应于SEQID NO :3的 mRNA 中在 153、166、222、227、251、洸8、四7、335、；356、384、390、396、406 或 423 位核苷酸处起始的核苷酸序列。
15.如权利要求9中所述的用途，其还包括向受试者眼中施用第二干扰RNA，所述第二干扰RNA具有19至49个核苷酸长度，并包含具有与对应于SEQ ID NO =USEQ ID NO :2或 SEQ ID NO 3的mRNA中的第二杂交部分有至少19个核苷酸接近完全连续互补的区域的第二核苷酸序列。
16.如权利要求9中所述的用途，其中组合物包含有效量的至少四种干扰RNA的混合物，每一干扰RNA具有19至49个核苷酸长度，并且混合物包含具有与对应于SEQ ID NO 2 的mRNA中的分别在175、252、276和325位核苷酸处起始的杂交部分有至少19个核苷酸接近完全连续互补的区域的第一、第二、第三和第四核苷酸序列。
17.包含有效量的19至49个核苷酸长度的干扰RNA以及可药用载体的组合物在制造用于减弱受试者眼中血清淀粉状蛋白A mRNA表达的药物中的用途；所述干扰RNA包含有义核苷酸序列、反义核苷酸序列以及在有义序列和反义序列间有至少19个核苷酸接近完全连续互补的区域；其中反义序列在生理条件下与对应于SEQ ID NO=U SEQ ID NO :2或 SEQID NO :3的mRNA的一部分杂交，并具有与分别对应于SEQ ID NO =USEQ ID NO :2或SEQ ID NO 3的mRNA的杂交部分有至少19个核苷酸接近完全连续互补的区域。
18.如权利要求17中所述的用途，其中受试者患有青光眼。
19.如权利要求17中所述的用途，其中受试者具有发展成为青光眼的风险。
20.如权利要求17中所述的用途，其中反义序列具有与对应于SEQIDNO :1、SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 3的mRNA的杂交部分有至少21至23个核苷酸接近完全连续互补的区域，并且在有义序列和反义序列各自的3’端包含额外的TT序列。
21.如权利要求17中所述的用途，其中有义核苷酸序列和反义核苷酸序列由核苷酸序列环连接。
22.如权利要求17中所述的用途，其中将组合物制备成用于经局部途径、玻璃体内途径或经巩膜途径的施用。
23.如权利要求17中所述的用途，其中将反义序列设计成靶向对应于SEQID NO :1的 mRNA中在230、357、362、380、447、470、527、531、548或557位核苷酸处起始的核苷酸序列。
24.如权利要求17中所述的用途，其中将反义序列设计成靶向对应于SEQID NO :2的 mRNA中在43、170、175、193、260、283、339或370位核苷酸处起始的核苷酸序列。
25.如权利要求17中所述的用途，其中将反义序列设计成靶向对应于SEQID NO :2的 mRNA中在252、271、276、325、343位核苷酸处起始的核苷酸序列。
26.如权利要求17中所述的用途，其中将反义序列设计成靶向对应于SEQID NO :3的 mRNA 中在 153、166、222、227、251、洸8、四7、335、；356、384、390、396、406 或 423 位核苷酸处起始的核苷酸序列。
27.如权利要求17中所述的用途，其中反义序列包含CUUUGCCA⑶CCUGCCCCA(SEQID NO 37)、UCGGAAGUGAUUGGGGUCU (SEQ ID NO 38)、UUUGUCUGAGCCGAUGUAA (SEQ IDNO 39)、AACCAGGCCCGUGAGAAGC(SEQ ID NO :40)、CUGAGCCGAUGUAAUUGGC(SEQIDNO41)、GCCACUCCUGCCCCAUUUA(SEQ IDNO:69)、CCCCCGAGCAUGGAAGUAU (SEQIDNO42)、CUCUGGCAUUGCUGAUCAC(SEQ IDNO:43)、GCCUGUGAGUCUCUGGAUA(SEQIDNO44)、GCCACUCCUGCCCCAUUUA(SEQ IDNO:45)、GCCAGCAGGUCGGAAGUGA(SEQIDNO46)、AGUCUCUGGAUAUUCUCUC(SEQ IDNO:47)、UUUAUUGGCAGCCUGAUCG (SEQIDNO48)、UUGCUGAUCACUUCUGCGG (SEQIDNO 49)、CUGGAUAUUCUCUCUGGCA(SEQIDNO:50)、UCUGCCACUCCUGCCCCAU(SEQIDNO:51)、AACCCCUUGGAGAGCCUCC(SEQIDNO:52)、UGCCCAUGUCCCCAACCCC(SEQIDNO:53)、AUAGAGAUAUCUGUUUGAA(SEQIDNO:54)、CGAGCAUAGAGAUAUCUGU(SEQIDNO:55)、CUUUGGGCAGCAUCAUAGU(SEQIDNO :56)、AGACACCCCCAGGUCCUCU(SEQIDNO:57)、CCUGGAACGGCUGAUGAGU(SEQIDNO ；:58)、CCAAAUAAAUAGUAGUCUA(SEQIDNO:59)、UCCAAUACAGUGCUGCUGU(SEQIDNO:60)、CUCAGCUUUCUCGUUGGAC(SEQIDNO:61)、CCAUUCCUCAGCUUUCUCG(SEQIDNO :62)、CCGGCCCCAUUCCUCAGCU(SEQIDNO 63)、CUUUGCCACUCCGGCCCCA(SEQ ID NO :64)或UCUGAAGCGGUCGGGGUCU(SEQ ID NO :65)。
28.如权利要求17中所述的用途，其中干扰RNA包含在碱基部分、在糖部分或在磷酸部分上的修饰。
29.如权利要求17中所述的用途，其中组合物还包含第二干扰RNA，所述第二干扰RNA 具有19至49个核苷酸长度，并包含有义核苷酸序列、反义核苷酸序列以及在有义序列和反义序列间有至少19个核苷酸接近完全连续互补的区域；其中第二干扰RNA的反义序列在生理条件下与对应于SEQ ID NO :1、SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 3的mRNA的第二部分杂交， 并且具有与分别对应于SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2或SEQ IDNO 3的mRNA的第二杂交部分有至少19个核苷酸接近完全连续互补的区域。
30.如权利要求17中所述的用途，其中组合物包含有效量的至少四种干扰RNA的混合物和可药用载体，其中每一干扰RNA具有19至49个核苷酸长度，并且每一干扰RNA包含有义核苷酸序列、反义核苷酸序列以及在四种干扰RNA的每一干扰RNA的有义序列和反义序列间有至少19个核苷酸接近完全连续互补的区域；其中混合物的反义序列在生理条件下与对应于SEQ ID NO :2的mRNA中分别在175、252、276和325位核苷酸处起始的一部分杂交，并具有与对应于SEQ ID NO :2的mRNA中分别在175、252、276和325位核苷酸处起始的杂交部分有至少19个核苷酸接近完全连续互补的区域。
31.包含有效量的19至49个核苷酸长度的干扰RNA和可药用载体的组合物在制造用于减弱受试者眼中血清淀粉状蛋白A mRNA表达的药物中的用途；其中干扰RNA包含具有与对应于SEQ ID NO :1、SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 3的mRNA中的杂交部分有至少19个核苷酸接近完全连续互补的区域的核苷酸序列。
32.如权利要求31中所述的用途，其中将组合物制备成用于经局部途径、玻璃体内途径或经巩膜途径施用。
33.如权利要求31中所述的用途，其中将干扰RNA设计成靶向对应于SEQID N0:1的 mRNA 中在 230、357、362、380、447、470、527、531、548 或 557 处开始的核苷酸序列。
34.如权利要求31中所述的用途，其中将干扰RNA设计成靶向对应于SEQID NO :2的mRNA中在43、170、175、193、260、283、339或370位核苷酸处起始的核苷酸序列。
35.如权利要求31中所述的用途，其中将干扰RNA设计成靶向对应于SEQID NO :2的 mRNA中在252、271、276、325、343位核苷酸处起始的核苷酸序列。
36.如权利要求31中所述的用途，其中将干扰RNA设计成靶向对应于SEQID NO :3的 mRNA 中在 153、166、222、227、251、268、297、3；35、356、384、390、396、406 或 423 位核苷酸处起始的核苷酸序列。
37.如权利要求31中所述的用途，其中组合物还包含第二干扰RNA，所述第二干扰RNA 具有19至49个核苷酸长度，并包含具有与对应于SEQID NO =USEQ ID NO :2或SEQ ID NO: 3的mRNA中的第二杂交部分有至少19个核苷酸接近完全连续互补的区域的第二核苷酸序列。
38.如权利要求31中所述的用途，其中组合物包含有效量的至少四种干扰RNA的混合物，每一干扰RNA具有19至49个核苷酸长度，并且混合物包含具有与对应于SEQ ID NO 2 的mRNA中的分别在175、252、276和325位核苷酸处起始的杂交部分有至少19个核苷酸接近完全连续互补的区域的第一、第二、第三和第四核苷酸序列。
39.权利要求17至38中任一项所述的用途，其中受试者患有血清淀粉状蛋白A相关性青光眼。
全文摘要
本发明涉及用于治疗青光眼的血清淀粉状蛋白A的RNAi抑制。本发明提供用于在涉及SAA表达的青光眼中抑制血清淀粉状蛋白A mRNA表达的RNA干扰。
文档编号C12N15/113GK102172407SQ20111003534
公开日2011年9月7日 申请日期2005年12月19日 优先权日2004年12月23日
发明者A·F·克拉克, L·麦克纳特, 王万恒 申请人:爱尔康公司