专利名称：马血清淀粉样蛋白a1制备方法及表达载体和基因工程菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及利用DNA重组技术生产蛋白质或多肽的领域，更具体地，本发明涉及 基因工程制备马血清淀粉样蛋白Al (serum amyloid Al，hoSAAl)的方法，还涉及有关的表 达载体和工程菌。
背景技术：
血清淀粉样蛋白Al (serum amyloid A，SAA1)是一种急性期反应载脂蛋白，是由同 一簇基因编码的一组多形性蛋白。主要由肝细胞合成。其N端的特异性结合区与高密度脂 蛋白(HDL)形成SAAl-HDL颗粒，进而调节高密度脂蛋白的代谢，以增强与巨噬细胞亲和力 并输送脂质至炎症部位，SAAl是有效的中性粒细胞激活剂，增强中性粒细胞的抗菌作用、抑 制霉菌感染。另外，SAAl还表现出细胞因子的相似特性，可以诱发白介素Ib(ILlb)产生。 同样，SAAl还上调T淋巴细胞分泌干扰素。SAAl能减少金属蛋白酶的产生，从而引导组织 损伤修复。一般在临床上，人和其他一些哺乳动物均采用CRP (C-反应蛋白)作为炎症的重要 生物检测指标，但马的CRP在炎症反应的临床检测中并不是主要的检测指标，这是因为CRP 在正常马血清中存在较高的浓度，同时CRP相对于感染时期存在着一定的滞后性，即当马 被感染后4-6天才能在病马体内发现其有2-4倍的差异，并且在病马的恢复期，CRP也下降 的很慢。马血清淀粉样蛋白Al (hoSAAl)，分子量约12KD-14KD左右；是一个多态性蛋白，由 几个相关的蛋白家族(SAA1-SAA13)组成。相对于CRP而言，hoSAAl对刺激更敏感、更准确。 在细菌或病毒感染早期(一般感染后48小时)，SAAl受到白介素1 (IL-I)、白介素6 (IL-6) 和肿瘤坏死因子α (TNFa)等炎症因子刺激，在肝细胞中大量合成，在病马血清中含量有 时可达正常浓度的400多倍(正常值一般小于7毫克/升)。同时hoSAAl在病马体内浓 度在感染后3-4天开始快速下降，5天以后基本与正常马的血清浓度相近，其中没有反馈升 高。可见，SAAl更适合作为病马炎症的生物检测指标，及时准确反应病马的感染及康复情 况。因此，hoSAAl的临床应用和意义受到了极大的关注。同样在马的一些相关疾病的诊断和治疗研究中，SAAl蛋白作为重要的生物指标也 有报道，如Toru ANZAI等报道了有关赛马中肺炎引起的血清中SAAl增高(肺炎是引起赛 马死亡的主要原因)；Thoefiner MB等报道的病马手术后因细菌感染引起的血清中SAAl增 高；Narmi. S等报道的有关患关节炎病马血清SAAl的增高等，由于SAAl在应急反应中早期 性、高度敏感性、以及其与多种疾病的相关性，因此在临床上检测马血清中的SAAl含量具 有很高的诊断价值。鉴于hoSAAl在临床治疗及诊断中的重要性，目前国外对hoSAAl的研究越来越重 视。但是由于hoSAAl在体内大部分是与HDL结合形成脂结合蛋白，因此对体内的SAAl进 行分离纯化有较大的难度。同时，关于hoSAAl蛋白的体外表达，国内外均没有相关文献及 专利进行报道。
目前体外表达SAAl蛋白普遍使用两种表达系统大肠杆菌和昆虫表达系统，分别 用于表达重组人GST-SAAl及rSAAl蛋白。其次，对于体外重组表达及纯化SAAl，由于其蛋 白的特性，比如容易体外聚集、表达量低等特性，存在表达获得的可溶性蛋白少，纯化方法 复杂等缺点，这些缺点长期以来一直限制了 SAAl体外研究的进一步开展。另外，通过以上 两种方法获得的大多数重组SAAl蛋白均为包涵体，在纯化过程中必须使用6M尿素或盐酸 胍对纯化目的蛋白采取变复性等复杂手段，由此纯化获得的重组蛋白生物活性较低，并且 活性不稳定。此外，该纯化方法耗时长、得率低、成本高、不利于大量生产。本发明克服以上技术缺陷，通过基因重组技术体外表达并纯化获得高纯度的 hoSAAl蛋白。通过基因人工合成的方法，去除了 hoSAAl前体蛋白的N-端的20个氨基酸， 并在N-端加上多聚组氨酸(6x His)亲和肽标记，进而用大肠杆菌Rosetta-gami作为宿主 菌，获得了可溶的目的蛋白。既避免纯化反应中的变复性步骤，又最大可能地还原hoSAAl 蛋白在体内的折叠结构，保持其有效的生物活性。又通过使用多聚组氨酸来简化其纯化方 法，且纯化得率很高。
发明内容
本发明的目的就是提供一种在大肠杆菌中表达可溶，并能通过亲和柱高效制备重 组hoSAAl的方法，及其有关的表达载体和工程菌。本发明提供一种马血清淀粉样蛋白Al (hoSAAl)的基因工程表达载体，该载体含 有马血清淀粉样蛋白Al (hoSAAl)基因序列的质粒载体pET28a(+)，并且hoSAAl编码序列位 于pET28a(+)载体上NdeI和HindIII酶切位点之间。本发明还提供一种基因工程菌，它是大肠杆菌(Escherichia coli) Rosetta-gami,并被本发明所述的表达载体所转化，该基因工程菌为pET28a(+)-hoSAAl/ Rosetta-gami0本发明还提供一种克隆、表达、纯化马血清淀粉样蛋白Al (hoSAAl)的基因工程方 法，所述方法包括如下步骤(1)将 hoSAAl 基因克隆于 pBluescriptll 载体；(2) hoSAAl基因的亚克隆①将获得的pBluescriptll-hoSAAl载体转化到DH5a宿主菌中，筛选并提取包含 目的DNA片段的质粒；②然后经双酶切并通过琼脂糖凝胶电泳分离目的DNA片段；③用胶回收试剂盒纯化目的DNA片段后，直接定向连接到pET_28a(+)载体上；④将连接产物转化到DH5a宿主菌中，提取质粒，用NdeI和HindIII双酶切；⑤得到目的基因；(3)培养和表达基因工程菌 pET28a(+)-hoSAAl/Rosetta_gami ；(4)离心收集基因工程菌；(5)融合蛋白SAAl的亲和柱纯化；(6)透析除盐，得到可溶性目的蛋白，鉴定目的蛋白。本发明通过基因重组技术体外表达并纯化获得高纯度的hoSAAl蛋白。本发明 的制备方法以大肠杆菌(Escherichia coli)Rosetta-gami为宿主菌，所述载体选用含有
4hoSAAl基因序列的质粒载体pET28a(+)，且hoSAAl编码序列位于pET28a (+)载体上NdeI和 HindIII酶切位点之间。通过基因人工合成的方法，针对hoSAAl的成熟肽进行克隆重组，去 除了 hoSAAl前体蛋白的N-端的20个氨基酸，并在其N端加上6个多聚组氨酸(6xHis)亲 和多肽标记，构成hoSAAl-6His融合蛋白，进而用大肠杆菌Rosetta-gami作为宿主菌，通过 镍亲和柱一步纯化法，且用两次不同浓度的洗涤液进行亲和柱的洗涤，获得可溶性的目的 蛋白。本发明首次采用多聚组氨酸融合表达载体(PET28a)来表达去除信号肽后的 hoSAAl蛋白的技术方案，在国内外尚未见有报道。本发明的有益效果在于一是可以在大肠杆菌内表达大量可溶的hoSAAl蛋白；二 是可利用融合蛋白的N端的6个多聚组氨酸多肽的纯化标记，简便高效的纯化获得高纯度 的重组hoSAAl，有利于后续的纯化工艺。同时，本发明利用融合蛋白N端的6个多聚组氨酸 多肽的纯化标记能简便，快速制备高纯度的hoSAAl蛋白，得到纯度90%以上的hoSAAl蛋 白，这一发明内容作为hoSAAl重组蛋白的纯化工艺，在国内外也属首次报道。本发明所述的目的基因亚克隆，是指对已经获得的目的DNA片段进行重新克隆， 其目的在于对目的DNA进行进一步分析，或者进行重组改造等。基因亚克隆的基本过程包 括(1)目的DNA片段和载体的制备；(2)目的DNA片段和载体的连接；(3)连接产物的转 化；(4)重组子筛选。本发明的镍亲和柱一步纯化法，纯化步骤简单，所需时间短，纯化全程时间较短， 优选的纯化全程时间为4-6小时。纯化优化全程时间与纯化的菌液体积的关系一般为1升 (IL)的表达菌液，纯化时间需4小时左右。本发明所述的“SAA1前体蛋白”，是指由SAA IcDNA编码，在细胞内合成的，未切除 信号肽的SAA全长蛋白。本发明所述的“SAA1的成熟肽”，是指在细胞内切除信号肽，分泌 到血清中，具有生物功能的SAAl蛋白。本发明所述的“镍亲和柱一步纯化法”，是指只通过一根镍亲和柱，通过合适方法， 直接从亲和柱上获得所需要的目的蛋白。不需要依赖其他方法，也不需要依赖其他试剂再
进一步纯化。本发明的亲和柱的洗涤是采用两次不同浓度洗涤液的洗涤方法，改进了常规技术 中原核表达系统的一次洗涤方式，得到产物更纯。更优选的是，所述两次不同浓度的洗涤液 分别为IOmM咪唑，30mM咪唑。本发明的有益效果在于(1)采用本发明方法修饰表达的hoSAAl蛋白为可溶性 成熟蛋白，避免纯化反应中的变复性步骤，且最大可能性地还原hoSAAl蛋白在体内的折叠 结构，保持其有效的生物活性；(2)多聚组氨酸的使用可以简化其纯化方法，且纯化得率很 高。通过镍亲和柱一步纯化的方法，在1升工程菌液中可获得高达12mg以上的可溶性重组 hoSAAl 蛋白。
图1 :pET28a(+)-hoSAAl 重组表达质粒的酶切鉴定；其中，M =DNA ladder ；1-14 双酶切鉴定的不同克隆质粒，限制性内切酶为NedLHindIII ；图2 :PET28a-hoSAAl亚克隆方法示意图 3 :PET28a-hoSAAl 重组质粒图谱；图4 15%的SDS-PAGE检测最终获得的重组蛋白；图5 蛋白印迹(Western blot)试验；图6 纯化蛋白的质谱上蛋白分子量分析。hoSAAl蛋白质分子量经质谱分析仪测 定为14. 2KD。
具体实施例方式以下结合实施例和附图，来进一步阐述本发明。以下各实施例是为说明本发明而 非为限制本发明范围。实施例IhoSAAl编码基因的克隆、构建重组表达质粒pET28a(+)_hoSAAl基因克隆、质粒构建的步骤如下(l)hoSAAl基因，如SEQ ID NO. 1所示的，由Invitrogen公司合成，并克隆于 pBluescriptll 载体中；(2)hoSAAl基因的亚克隆；①将获得的pBluescriptll-SAAl载体转化到DH5 a宿主菌中，筛选并提取包含目 的DNA片段的质粒；②然后经双酶切并通过琼脂糖凝胶电泳分离目的DNA片段；③用胶回收试剂盒纯化目的DNA片段后，直接定向连接到pET_28a(+)载体上；④再将连接产物转化到DH5a宿主菌中，提取质粒，用NdeI和HindIII双酶切鉴 定。其中，酶切片段大小与预期设计片段大小一致的，即约为300个核苷酸的片段，为阳性克隆。hoSAAl基因的亚克隆方法，如图1所示。反应产物用琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示，插入片段的酶切位点为Ndel/Hindlll，酶切片段的大小约为340bp，图2中所示得到的基因片段与预期设 计的基因大小相符。以上常规实验方法，见Sambrooks等编著的《分子克隆实验指南》第二 版，科学出版社1998年出版。(3)将阳性克隆进行DNA序列测定。将筛选得到的阳性克隆进行测序，如序列1，SEQ NO. 1所示。SEQ NO. 1序列 为hoSAAl (from nt 61 to stop code)，该序列中已经除去信号肽的序列部分。全长 PET28a-hoSAAl重组质粒图谱，见图3所示。全长PET28a-hoSAAl重组质粒核甘酸序列，如 序列2，SEQ NO. 2所示，其中，SEQ N0. 2中的黑体划线部分为插入hoSAAl基因序列。其测序 结果与其基因库已报道hoSAAl序列的比较(NM_001081853)，序列比较一致，如序列3，SEQ N0. 3所示。实施例2基因重组菌的大规模表达及纯化方法重组hoSAAl-多聚组氨酸融合蛋白在大肠杆菌宿主中的表达1)将PET28a_hoSAAl转化到Rosetta-gami大肠杆菌中在带有卡那霉素抗性 (50ng/ml)的LB培养板上，37°C培养过夜；2)挑取一个单菌落在50ml含有50微克/毫升卡那霉素的LB培养基中，在37°C， 250转/分钟的条件下，培养过夜；
6
3) 2%接种培养到IL LB培养基中(包括50ug/ml卡那霉素)，在37°C 250转/分 钟的条件下培养细菌至A600，0. D值为0. 5 ；4)加入IPTG至终浓度ImM然后在37°C，300转/分钟条件下诱导培养3小时；5)高速离心4000rpm 20分钟，收集沉淀并保存在_80°C。纯化重组hoSAAl-多聚组氨酸融合蛋白的试剂(1)裂解液:50mM Tris-HCl pH 8. 0,400mM NaCl,5mM imidazole, ImM PMSF, IOmM 2-Me(2)洗涤液 1 :50mM Tris-HCl pH 8. 0,400mM NaCl, IOmM imidazole, ImM PMSF, IOmM 2-Me(3)洗涤液 2:50mM Tris-HCl pH 8. 0,400mM NaCl,30mM imidazole, ImM PMSF, IOmM 2-Me(4)洗脱液 2:50mM Tris-HCl pH 8. 0,150mM NaCl,200mM imidazole, ImM PMSF, IOmM 2-Me纯化步骤1.将1升LB培养基表达的hoSAAl重组融合蛋白的大肠杆菌悬浮在50ml裂解液 中；2.在冰上超声4-5次，30秒/次；3. IOOOOg高速离心30分钟；4.取上清上柱到3ml镍柱中；5.用60ml洗涤液1清洗镍柱；
6.用60ml洗涤液2清洗镍柱；7.用6ml洗脱液2从镍柱上洗脱目的蛋白，每11滴收集一个试管；8.将洗脱的样品混合在一起，并用IXPBS，4°C透析三次过夜；9.将透析好的样品保存在_80°C。通常情况下，镍亲和柱纯化蛋白时往往使用一种浓度imidazole洗涤液洗涤亲和 柱，而本发明纯化方法在裂解菌液离心过柱后，对亲和柱用两次不同浓度imidazole洗涤， 从而获得高纯度hoSAAl重组蛋白。基因重组菌的表达及纯化结果，如附图4所示，其中， lanel :IPTG诱导以前总菌裂解液，lane2 :IPTG诱导以后总菌裂解液，lane3 镍柱纯化后的产物。实施例3蛋白印迹法对重组蛋白的证明1) 15%丙稀酰胺胶，90V，3小时；2)通过Tris-glycine缓冲液将丙稀酰胺胶上的蛋白片段电转到PVDF膜上，条件 为IX Tris-glycine缓冲液，20%甲醇，70V电压室温下转移3小时；3)将电转后的PVDF膜取出，用IX PBST清洗30分钟；4)用含有5%脱脂奶粉的PBST封闭45分钟；
5)用IX PBST漂洗PVDF膜3次，10分钟/次；6)加入含1 2000稀释的抗His抗体的PBST 8mL,室温反应1小时；7)用IX PBST洗涤PVDF膜三次，15分钟/次；8)加入含1 1000稀释的抗小鼠的抗体，室温反应40分钟；
9)用IX PBST洗涤PVDF膜三次，15分钟/次；10)用含0. 3% H202和6mg 二氨基联苯胺的显色液，显色15秒。实验结果如图5所示，其中，Ianel 镍柱纯化后的产物，M 标准分子量蛋白。实施例4质谱对纯化蛋白的蛋白分子量进行分析将以上实施例中所获得的纯化蛋白在质谱上进行分子量分析，按常规质谱分析方 法，重组hoSAAl蛋白质分子量经质谱分析仪测定为14. 2KD，其结果如附图6所示，与从氨 基酸序列计算得到的分子量相吻合。序列表<110>德赛诊断系统(上海)有限公司<120>马血清淀粉样蛋白Al制备方法及表达载体和基因工程菌<160>3<210>1<211>344<212>DNA<213>人工序列<400>1catatgttgttatcgttccttggagaggctgctcgagggacttgggacatgctaagagcttacaatgac atgagagaagccaattacataggtgcagacaaatacttccacgcccgcgggaactatgacgctgcaaagaggggccctgggggcgcctgggctgctaaagtca tcagcgatgccagagagaatgttcagagat tcacagaccgtttcagttttggaggcagcggccgtggagcagaggactcgagagccgaccaggctgcca atgaatggggccggagtggcaaagaccccaatcacttcagacctcatggcctgcctgacaagtactgaagctt<210>2<211>5642<212>DNA<213>人工序列<400>2atccggatatagttcctcctttcagcaaaaaacccctcaagacccgtttagaggccccaaggggttatg ctagttattgctcagcggtggcagcagccaactcagcttcctttcgggctttgttagcagccggatctcagtggtggtggtggtggtgctcgagtgcggccgc AAGCTTCAGTACTTGTCAGGCAGGCCATGAGGTCTGAAGTGATTGGGGTCTTTGCCACTCCGGCCCCATTCATTGGCAGCCTGGTCGGCTCTCGAGTCCTCTGCTCCACGGCCGCTGCCTCCAAAACTGAAACGGTCTGTGAATCTCTGAACATTCTCTCTGGCATCGCTGATGACTTTAGCAGCCCAGGCGCCCCCAGGGCCCCTCTTTGCAGCGTCATAGTTCCCGCGGGCGTGGAAGTATTTGTCTGACCTATGTAATTGGCTTCTCTCATGTCATTGTAAGCTCTTAGCATGTCCCAAGTCCCTCGAGCAGCCTCTCCAAGGAACGATAACAACATATGgctgccgcgcggcaccaggccgctgctgtgatgatgatgatgatg gctgctgcccatggta
tatctccttcttaaagttaaacaaaattatttctagaggggaattgttatccgctcacaattcccctat agtgagtcgtattaatttcgcgggatcgagatctcgatcctctacgccggacgcatcgtggccggcatcaccggcgccacaggtgcggttgctggcgcctatatcgcc gacatcaccgatggggaagatcgggctcgccacttcgggcteatgagcgcttgtttcggcgtgggtatggtggcaggccccgtggccgggggactgttg ggcgccatctccttgcatgcaccattccttgcggcggcggtgctcaacggcctcaacctactactgggctgcttcctaatgcaggagtcgcataagggagag cgtcgagatcccggacaccatcgaatggcgcaaaacctttcgcggtatggcatgatagcgcccggaagagagtcaattcagggtggtgaatgtgaaacc agtaacgttatacgatgtcgcagagtatgccggtgtctcttatcagaccgtttcccgcgtggtgaaccaggccagccacgtttctgcgaaaacgcgggaaa aagtggaagcggcgatggcggagctgaattacattcccaaccgcgtggcacaacaactggcgggcaaacagtcgttgetgattggcgttgccacctccag tctggccctgcacgcgccgtcgcaaattgtcgcggcgattaaatctcgcgccgatcaactgggtgccagcgtggtggtgtcgatggtagaacgaagcggcg tcgaagcctgtaaagcggcggtgcacaatcttctcgcgcaacgcgtcagtgggctgatcattaactatccgctggatgaccaggatgccattgctgtgg aagctgcctgcactaatgttccggcgttatttcttgatgtctctgaccagacacccatcaacagtattattttctcccatgaagacggtacgcgactgggcgtgg agcatctggtcgcattgggtcaccagcaaatcgcgctgttagcgggcccattaagttctgtctcggcgcgtctgcgtctggctggctggcataaatatctcac tcgcaatcaaattcagccgatagcggaacgggaaggcgactggagtgccatgtccggttttcaacaaaccatgcaaatgctgaatgagggcatcgttcccac tgcgatgctggttgccaacgatcagatggcgctgggcgcaatgcgcgccattaccgagtccgggctgcgcgttggtgcggatatctcggtagtgggatacga cgataccgaagacagctcatgttatatcccgccgttaaccaccatcaaacaggattttcgcctgctggggcaaaccagcgtggaccgcttgctgcaactc tctcagggccaggcggtgaagggcaatcagctgttgcccgtctcactggtgaaaagaaaaaccaccctggcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcg cgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtaagttagctcactcattaggc accgggatctcgaccgatgcccttgagagccttcaacccagtcagctccttccggtgggcgcggggcatgactatcgtcgccgcacttatgactgtcttct ttatcatgcaactcgtaggacaggtgccggcagcgctctgggtcattttcggcgaggaccgctttcgctggagcgcgacgatgatcggcctgtcgcttgcggt attcggaatcttgcacgccctcgctcaagccttcgtcactggtcccgccaccaaacgtttcggcgagaagcaggccattatcgccggcatggcggccccacgg gtgcgcatgatcgtgetcctgtcgttgaggacccggctaggctggcggggttgccttactggttagcagaatgaatcaccgatacgcgagcgaacgtgaagcgactgctgctgcaaaacgtctgcgacctgagcaacaacatgaatggtcttcggtttccgtgtttcgtaaagtctggaaacgcggaagtcagcgccctg caccattatgttccggatctgcatcgcaggatgctgctggctaccctgtggaacacctacatctgtattaacgaagcgctggcattgaccctgagtgattttt ctctggtcccgccgcatccataccgccagttgtttaccctcacaacgttccagtaaccgggcatgttcatcatcagtaacccgtatcgtgagcatcctctctcgt tteatcggtatcattacccccatgaacagaaatcccccttacacggaggcatcagtgaccaaacaggaaaaaaccgcccttaacatggcccgctttatcagaagc cagacattaacgcttctggagaaactcaacgagctggacgcggatgaacaggcagacatctgtgaatcgcttcacgaccacgctgatgagctttaccgcag ctgcctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaag cccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggcgcagccatgacccagtcacgtagcgatagcggagtgtatactggcttaactatgcgg catcagagcagattgtactgagagtgcaccatatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgctcttccgcttcc tcgctcactgactcgctgcgctcggtcgtteggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgca ggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagca tcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgtt ccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtc gttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgactt atcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactag aaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtgg tttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactca cgttaagggattttggtcatgaacaataaaactgtctgcttacataaacagtaatacaaggggtgttatgagccatattcaacgggaaacgtcttgctctaggc cgcgattaaattccaacatggatgetgatttatatgggtataaatgggctcgcgataatgtcgggcaatcaggtgcgacaatctatcgattgtatgggaagcccg atgcgccagagttgtttctgaaacatggcaaaggtagcgttgccaatgatgttacagatgagatggtcagactaaactggctgacggaatttatgcctcttc cgaccatcaagcattttatccgtactcctgatgatg
catggttactcaccactgcgatccccgggaaaacagcattccaggtattagaagaatatcctgattcag gtgaaaatattgttgatgcgctggcagtgttcctgcgccggttgcattcgattcctgtttgtaattgtccttttaacagcgatcgcgtatttcgtctcgctcag gcgcaatcacgaatgaataacggtttggttgatgcgagtgattttgatgacgagcgtaatggctggcctgttgaacaagtctggaaagaaatgcataaacttttgc cattctcaccggattcagtcgtcactcatggtgatttctcacttgataaccttatttttgacgaggggaaattaataggttgtattgatgttggacgagtcggaat cgcagaccgataccaggatcttgccatcctatggaactgcctcggtgagttttctccttcattacagaaacggctttttcaaaaatatggtattgataatcctga tatgaataaattgcagtttcatttgatgctcgatgagtttttctaagaattaattcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgc gcacatttccccgaaaagtgccacctgaaattgtaa acgttaatattttgttaaaattcgcgttaaatttttgttaaatcagctcattttttaaccaataggccg aaatcggcaaaatcccttataaatcaaaagaatagaccgagatagggttgagtgttgttccagtttggaacaagagtccactattaaagaacgtggactccaacgtcaa agggcgaaaaaccgtctatcagggcgatggcccactacgtgaaccatcaccctaatcaagttttttggggtcgaggtgccgtaaagcactaaatcggaacc ctaaagggagcccccgatttagagcttgacggggaaagccggcgaacgtggcgagaaaggaagggaagaaagcgaaaggagcgggcgctagggcgctggcaa gtgtagcggtcacgctgcgcgtaacc ACAAT ACAAT ACTAT ACTAT CCAGA
accacacccgccgcgcttaatgcgccgctacagggcgcgtcccattcgcca <210>3 <211>338 <212>DNA <213>人工序列 <400>3 报道序列 123
64 TTGTTATCGTTCCTTGGAGAGGCTGCTCGAGGGACTTGGGACATGCTAAGAGCTT
测序序列 141
报道序列 183
测序序列 201
报道序列 243
82 TTGTTATCGTTCCTTGGAGAGGCTGCTCGAGGGACTTGGGACATGCTAAGAGCTT 124 GACATGAGAGAAGCCAATTACATAGGTGCAGACAAATACTTCCACGCCCGCGGGA
IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII
142 GACATGAGAGAAGCCAATTACATAGGTGCAGACAAATACTTCCACGCCCGCGGGA 184 GACGCTGCAAAGAGGGGCCCTGGGGGCGCCTGGGCTGCTAAAGTCATCAGCGATG
11
测序序列202 GACGCTGCAAAGAGGGGCCCTGGGGGCGCCTGGGCTGCTAAAGTCATCAGCGATG CCAGA261报道序列244 GAGAATGTTCAGAGATTCACAGACCGTTTCAGTTTTGGAGGCAGCGGCCGTGGAG CAGAG303IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII测序序列262 GAGAATGTTCAGAGATTCACAGACCGTTTCAGTTTTGGAGGCAGCGGCCGTGGAG CAGAG321报道序列304 GACTCGAGAGCCGACCAGGCTGCCAATGAATGGGGCCGGAGTGGCAAAGACCCCA ATCAC36311111111111111111111111111111111111111111111111111111111111测序序列322 GACTCGAGAGCCGACCAGGCTGCCAATGAATGGGGCCGGAGTGGCAAAGACCCCA ATCAC381报道序列364 TTCAGACCTCATGGCCTGCCTGACAAGTACTGAAGCTT 401I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I测序序列382 TTCAGACCTCATGGCCTGCCTGACAAGTACTGA-GCTT 418
权利要求
一种马血清淀粉样蛋白A1(hoSAA1)的基因工程表达载体，其特征在于，该载体含有血清淀粉样蛋白A1基因序列的质粒载体pET28a(+)，并且血清淀粉样蛋白A1编码序列位于pET28a(+)载体上Nde I和HindIII酶切位点之间。
2.一种基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为pET28a⑴-hoSAAl/ Rosetta-gami，宿主菌为大肠杆菌Escherichia coli Rosetta-gami，被权利要求1所述的 表达载体所转化。
3.一种制备马血清淀粉样蛋白Al的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤(1)将人工合成的SEQID NO. 1所示的马血清淀粉样蛋白Al基因克隆于 pBluescriptll 载体；(2)马血清淀粉样蛋白Al基因的亚克隆①将获得的pBluescriptll-hoSAAl载体转化到DH5a宿主菌中，筛选并提取包含目的 DNA片段的质粒；②然后经双酶切并通过琼脂糖凝胶电泳分离目的DNA片段；③用胶回收试剂盒纯化目的DNA片段后，直接定向连接到pET-28a(+)载体上；④将连接产物转化到DH5a宿主菌中，提取质粒，通过用NdeI和Hindi11双酶切筛选鉴定；⑤得到重组目的基因的表达载体；(3)培养和表达基因工程菌pET28a(+)-hoSAAl/Rosetta-gami ；(4)离心收集基因工程菌；(5)融合蛋白SAAl的亲和柱纯化；(6)透析除盐，得到可溶性目的蛋白。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中以大肠杆菌Escherichia coliRosetta-gami为宿主菌，以含有马血清淀粉样蛋白Al基因序列的质粒载体pET28a(+) 为载体。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)是通过镍亲和柱一步纯化法， 并且用两次不同浓度的洗涤液进行亲和柱的洗涤。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述两次不同浓度的洗涤液分别为IOmM咪 唑，30mM咪唑。
全文摘要
本发明提供一种可溶的基因工程马血清淀粉样蛋白A1(hoSAA1)的制备方法，及其表达载体和基因工程菌。本发明提供的表达载体为含有hoSAA1基因序列的质粒载体pET28a(+)，并且hSAA1编码序列位于pET28a(+)载体上Nde I和HindIII酶切位点之间。本发明提供的基因工程菌是大肠杆菌，为pET28a(+)-hoSAA1/Rosetta-gami，可表达可溶性目的蛋白。本发明制备方法采用镍交联亲和柱一步法，且用两次不同浓度的咪唑(imidazole)进行洗涤亲和柱，操作简便、得率高、耗时短，适于工业化大规模生产。
文档编号C12N15/12GK101921799SQ20101002292
公开日2010年12月22日 申请日期2010年1月18日 优先权日2010年1月18日
发明者吴峻, 张艳, 王荣芳, 钱震斌 申请人:德赛诊断系统(上海)有限公司