一种评估海水鱼类粘液凝集素抑制盾纤毛虫的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于水产病害防治技术领域，具体地涉及一种评估海水鱼类粘液凝集素 Lily-type lectin(LTL)抑制盾纤毛虫的方法。
【背景技术】
[0002] 近年来，随着水产养殖集约化程度的不断提高，养殖密度的不断加大，鱼类寄生虫 病的发生率和危害性不断提高，给渔业生产造成很大损失。鱼类体表分泌的大量粘液广泛 覆盖在鱼体表面构成与外界接触的第一道门户，在保护鱼体抵抗养殖环境变化以及抵御外 界病原生物侵袭起着至关重要的作用，尤其是对寄生虫的抵御功能已受到国内外学者的广 泛关注。其中粘液凝集素（lectin)做为鱼类体表粘液中的重要天然免疫因子，但对其病原 生物的免疫防御机制研究较少。根据鱼类体表粘液凝集素结构，目前共鉴定了四种类型凝 集素，即：半乳凝集素、C型凝集素、Lily型凝集素及L-鼠李糖结合凝集素，表现出广泛的分 子多样性。其中第三种类型是一种从红鳍东方飩(Takifugu rubripes)中提取的特异性甘 露糖凝集素(pufflectin)，其与单子叶植物凝集素(MMB)具有高度同源性，Suzuki将其命名 为Lily-type lectin(LTL)〇
[0003] 本发明做出之前，植物凝集素在鱼类寄生虫病原中的机理研究较为深入，其为寄 生虫防治提供基础资料;而作为鱼类自身分泌的粘液凝集素 Lily-type lectin，具有与单 子叶植物凝集素(MMB)高度同源性，对其开展寄生虫抑制机理研究将会在提高鱼体自身免 疫提供新的研究思路。而目前Lily-type lectin对寄生虫活力抑制性却没有相关研究。
[0004] 在海水养殖鱼类的寄生虫病害中，近年来由原生动物尤其是一种嗜组织的纤毛虫 所引起的疾病逐渐为人们所注意，由其引发的疾病死亡率高，流行范围广，因而纤毛虫病被 认为是工厂化养殖鱼类中最重要的疾病之一。
[0005] 本发明是对凝集素进行盾纤毛虫活力抑制的评估，该方法国内外尚未有报道;该 评估方法将为海水鱼类抗纤毛虫药物的研发发挥积极、重要的推动作用。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的技术问题在于提供一种评估海水鱼类粘液凝集素抑制盾纤毛虫 的方法。以评价海水鱼类粘液凝集素是对盾纤毛虫的抑制效果。
[0007] 本发明是按照以下操作技术方案完成的：
[0008] -种评估海水鱼类粘液凝集素抑制盾纤毛虫的方法，它包括Lily-type lectin蛋 白对盾纤毛虫的活力抑制评估和结合评估；
[0009] 所述的活力抑制评估:轻轻晃动盾纤毛虫虫体收集液，吸取盾纤毛虫虫体收集液， 转移到EP管中，向EP管中加入不同浓度的LTL蛋白孵育于26-28°C。对照组实验无 LTL蛋白， 在显微镜下，不同的时间点观察不同浓度条件下虫子的存活和死亡的数量，每个浓度条件 下，设置三个重复组，其死亡率取其平均数；
[0010]所述的结合评估①荧光标记蛋白FITC-LTL制备：将待交联的LTL蛋白放入交联反 应液透析三次;将FITC溶于DMSO中，浓度为lmg/ml;按蛋白质:FITC= lmg: 150yg的比例将 FITC缓慢加入于LTL蛋白溶液中，轻轻晃动使其与蛋白混合均匀，暗处反应;加入NH4C1溶液 至其终浓度50mmol/L，终止反应;将交联物在PBS中透析四次以上，至透析液清亮;透析结束 后，收蛋白加入BSA，至BSA的终浓度为10mg/ml，加的硫柳汞溶液至其终浓度0.02% (质量百 分比），加入肌氨酸钠至其终浓度0.2 % (质量百分比）；
[0011]②FITC-LTL与盾纤毛虫结合:取盾纤毛虫虫体收集液，与标记的100mg/ml FITC-LTL按照体积比1:4的比例稀释，混合液室温孵育过夜;混合液过滤并用灭菌海水冲洗三遍， 以去除掉多余的凝集素，吸取冲洗后的混合液置于玻璃载玻片上，荧光显微镜下观察虫体 上的焚光强度，以证明海水鱼类Lily-type lectin(LTL)蛋白是否与虫体结合。
[0012] 进一步，所述的交联反应液成份及其终浓度为：7.56g/L NaHC03，1.06g/L Na2C〇3， 7.36g/L NaCl。
[0013] 进一步，所述的荧光显微镜的观察波长450-490nm，滤镜515nm〇
[0014] 本发明与现有技术相比的有益效果：
[0015]第一，通过采用本发明的方法，可以较为简便的对海水鱼类Lily-type lectin (LTL)蛋白具有抑制盾纤毛虫活力的抑制性进行评估，并通过荧光显微镜清晰的观察到LTL 蛋白与盾纤毛虫结合现象；
[0016] 第二，FITC-LTL的制备方法提高了FITC标记LTL蛋白的效率，标记效率达到90%以 上，蛋白流失较低，由于盾纤毛虫体积较小仅有20-50μπι，在结合过程中，盾纤毛虫虫体收集 液与标记的FITC-LTL按照体积比1:4的比例稀释，即保证盾纤毛虫与标记蛋白结合的效率， 又同时保证FITC-LTL仍然具有与盾纤毛虫结合活性及抑制性。
【附图说明】
[0017] 图1为本发明实施例提供的FITC-SmLTL蛋白与盾纤毛虫结合现象:箭头表示为被 荧光标记的盾纤毛虫；
[0018] 图2为本发明实施例提供的加入D-甘露糖后，FITC-SmLTL蛋白与盾纤毛虫结合现 象:箭头表示为被荧光标记的盾纤毛虫。
【具体实施方式】
[0019] 下面通过实施例结合附图详细叙述本发明在大菱鲆体表粘液凝集素 Lily-type lect in(SmLTL)蛋白抑制盾纤毛虫的评估方法中的应用。
[0020] 实施例一、盾纤毛虫虫体收集液制备
[0021 ] 1.剪取健康大菱鲆的脑组织和肌肉组织，按照1:1的比例混合，加入经滤膜过滤后 的灭菌海水，用组织匀浆机制备成肉泥；
[0022] 2.加入50倍的过滤后的灭菌海水，70°C水浴2-3个小时后制备成盾纤毛虫活体培 养基，制备好的培养基放置在4°C条件下长期保存。
[0023] 3.剪取感染盾纤毛虫病的大菱鲆鱼体部分病灶组织，无菌操作在培养皿中剪碎， 滴入15-20倍体积的过滤后的灭菌海水，置于18-20 °C恒温培养箱内静置培养过夜；
[0024] 4.在显微镜下（100X)，用移液器吸取静置后的培养皿内液体中游离的虫体，滴入 50ml离心管中，