一种纤毛虫的染色方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，涉及一种纤毛虫的染色方法，特别涉及一种纤毛虫的固定及蛋白银染色方法。
【背景技术】
[0002]纤毛虫以纤毛作为运动的胞器，在其生命周期中至少在某一阶段生有纤毛，如果不具纤毛，则仍存在表膜下的纤毛系统。纤毛虫具有大核和小核两种核型，具有两种生殖方式，即横二分裂的无性生殖和接合生殖的有性生殖。纤毛虫的生活方式多样，种类繁多。
[0003]纤毛虫是一类十分具有研究意义的生物。纤毛虫是海洋微食物环和经典食物链的重要链接者，在能量流动和物种循环中有重要意义；纤毛虫是许多水产养殖的危害物种，有些种类爆发时会造成赤潮，而由于其周期短，对环境变化反应灵敏，又被用为生物指示种。申请号为200910074535.2的专利中提出，通过对纤毛虫的研究，将纤毛虫应用于对石油的降解中，可大大促进石油污染的治理和原油的微生物开采；申请号为201180022508.6的专利中，利用纤毛虫不仅能产生scFv和Fab、还能够产生全长的免疫球蛋白、以及纤毛虫对病毒不易感等令人惊讶的优势，将纤毛虫作为单克隆抗体、或者其片段或衍生物的表达宿主。
[0004]对纤毛虫的研究，原始的方法是在简单的放大镜下进行活体观察。由于纤毛虫为单细胞的原生动物，其形态学研究相对于大型的多细胞动物而言由于个体小，操作不方便，无法直视等特点，需要借助多种特殊的染色技术来突出某些特殊结构的显示，借此来区分不同的种类。
[0005]银浸技术(Chatton & Lwoff 1930)是研究纤毛虫形态分类特征常用的方法之一，可显示纤毛虫表膜下纤毛系，但该法只能显示银线系，而且对表膜下纤毛系的显示效果很不理想。
[0006]蛋白银染色方法(Shi and Frankel，1990)，是将升汞水溶液固定后进行蛋白银染色的技术，此技术应用于原生动物，在其形态学和分类学方面的研究均取得了一定的效果。此方法可用来显示纤毛虫体的皮层及内部结构，如纤毛下器、毛基体、核器及各种表膜下纤维系统等，但银线系统却不被染色。此方法具有以下缺点:1.固定溶液采用的是饱和升汞水溶液，因溶解度影响，固定效果不佳；2.升汞饱和水溶液固定后需进行多次水洗、滴加蛋白甘油水和火棉胶等许多步骤，步骤繁琐、耗时长；3.在固定和洗涤过程中会损失大量实验样本，纤毛和胞口等关键结构难以清晰显示；4.在梯度酒精脱水的过程中因为染色标本的外部包有火棉胶，脱水时间长；5.此方法对技术掌握度的依赖性很强，需要操作者通过反复练习才能得到好的染色效果:若固定液水洗不彻底，会严重影响染色效果，若火棉胶滴加时机不当，在脱水的过程中容易让染色成功的样本全部随火棉胶脱掉，导致实验失败。
[0007]因此，如何缩短染色时间，简化染色步骤，提高染色效率，并且可以显示胞口、纤毛等常规蛋白银染色所难以显示的结构，是目前亟待解决的问题。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于克服现有技术中所存在的上述不足，提供一种纤毛虫的固定及蛋白银染色方法，此方法操作方便，用时少，样本损失、损坏少，可以显示胞口、纤毛等常规蛋白银染色所难以显示的结构。
[0009]为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案:
一种纤毛虫的染色方法，其特征在于，纤毛虫的固定试剂为饱和酒精升汞溶液；所述的饱和酒精升汞溶液为:无水乙醇为溶剂、氯化高汞为溶质的饱和溶液。
[0010]用饱和酒精升汞溶液代替传统的饱和升汞水溶液，固定效果更佳。
[0011]进一步地，纤毛虫的染色方法中，在用饱和酒精升汞溶液对虫体进行前固定操作之前，进行虫体固着的操作:将待制片的纤毛虫体置于涂有蛋清的载玻片上，并盖上涂有二甲苯饱和石蜡溶液的盖玻片，即完成对虫体的固着。
[0012]进一步地，纤毛虫的染色方法，包括以下内容:
(1)虫体固着:将待制片的纤毛虫体置于涂有蛋清的载玻片上，并盖上涂有二甲苯饱和石蜡溶液的盖玻片，得到固着有虫体的贴片；
(2)前固定:利用饱和酒精升萊溶液对虫体进行前固定，固定时间为l_3min；
(3)脱盖玻片:将前固定处理后的贴片浸没在无水乙醇中，保持带有盖玻片的一面朝下，使盖玻片自然脱落；
(4)洗涤:将脱完盖玻片的贴片放在无水乙醇中洗涤两次，每次洗涤时间为50-70S；
(5)后固定:将贴片放入后固定液中固定30-60s;所述的后固定液为甲醒和无水乙醇等体积比混合的溶液；
(6)漂洗:将后固定的贴片用水漂洗除去多余的后固定液；
(7)氧化:将贴片放入含有氧化剂的溶液中氧化1-1.5min，然后用水漂洗除去多余的氧化剂；
(8)漂白:将氧化后的贴片放入质量浓度为5%的草酸溶液中漂白，然后用50-60°C的热水漂洗除去多余的草酸；
(9)染色:将漂白后的贴片放入质量浓度为1%的蛋白银溶液中，在50-55°C下水浴50_60min ；
(10)显影:用显影液进行显影，在显微镜下显影至虫体的纤维结构显现清晰为止；
(11)定影:将显影后的贴片水洗后放入质量浓度为5%的硫代硫酸钠溶液中，定影50-70s ；
(12)脱水、透明:将定影后的贴片用梯度酒精溶液进行脱水，脱水后用二甲苯进行透明；
(13)封片:将透明后的贴片用树脂封片，即得完成纤毛虫的染色。
[0013]本申请在饱和酒精升汞溶液固定前，就把虫体固定在染色载玻片的固定位置，避免了传统染色方法中在固定后需要多次水洗和滴加火棉胶的操作，大大缩短了实验时间，提闻了染色效率，并提闻了染色效果。
[0014]作为优选，步骤(6)中漂洗所用的水为蒸馏水
作为优选，步骤(7)中所述的氧化剂是质量浓度为1%的高锰酸钾溶液。
[0015]作为优选，步骤(10)中所述的显影液为:将质量浓度为0.01%的对苯二酚溶液和质量浓度为5%的无水亚硫酸钠溶液等体积混合后形成的混合液。
[0016]作为优选，步骤(12)中所述的梯度酒精包括以下体积分数的酒精溶液:50%、70%、80%、90%、95%、100%和100%共计7个梯度的酒精；每个梯度的酒精溶液脱水30s。
[0017]用7个浓度梯度的酒精溶液进行脱水，脱水效果更佳，保护了虫体的完整性。
[0018]作为优选，步骤(12)中所述的透明包括以下内容:脱水后的贴片放入二甲苯中进行两次透明，每次透明的时间为20s。
[0019]与现有技术相比，本发明的有益效果如下:
1.现有的纤毛虫染色过程中，固定时采用的是把所需固定的样本在胚胎皿中用饱和的升汞水溶液固定，因溶解度影响，固定效果不佳；而本申请中采用的是饱和酒精升汞溶液(无水乙醇为溶剂、氯化高汞为溶质的饱和溶液)，可以避免上述问题，对纤毛虫的固定效果更佳。
[0020]2.现有的纤毛虫染色过程中,在用升汞饱和水溶液固定后需进行多次水洗、滴加蛋白甘油水和火棉胶等许多步骤，步骤繁琐、耗时长；而本申请中在用饱和酒精升汞溶液进行前固定操作之前，就将待制片的虫体固着在待染色的载玻片上，省去滴加蛋白甘油水和火棉胶等许多步骤，节约了实验步骤，缩短了实验时间。此外，在将虫体固着在载玻片前，在载玻片上涂蛋清，在盖玻片上涂二甲苯饱和石蜡溶液以形成蜡膜，这些不仅利于虫体的固定，也与后续的其他操作步骤相适应，最大限度地保护了虫体的完整性。
[0021]3.现有的纤毛虫染色过程中，在用升汞饱和水溶液固定后需进行多次水洗的操作，加之饱和升汞水溶液的固定效果不佳，容易造成大量实验样本损失、纤毛虫的纤毛和胞口等关键结构难以显示；而本申请提供的纤毛虫的染色方法中，由于在前固定操作之前就将虫体固着在载玻片上，不需要进行多次水洗的操作，并且饱和酒精升汞溶液的前固定效果好，大大减少了实验样本需求，并且可以显示胞