姜黄素在制备杀灭鱼类体外寄生纤毛虫药物中的应用
【专利摘要】本发明公开一种姜黄素制备杀灭鱼类体外寄生纤毛虫药物中的应用，特别是在制备杀灭多子小瓜虫药物中的应用，属于杀灭寄生虫药物技术领域。本发明首次将姜黄素应用于制备杀灭鱼类体外寄生纤毛虫药物，特别是用于杀灭多子小瓜虫，在有效剂量范围内可完全杀灭寄生虫，达到防治小瓜虫病的效果。本发明的姜黄素来源广泛，价格低廉，原料丰富，制备工艺已经工业化，对环境无残留无污染，对人体无毒无害，其对鱼的半致死浓度(56.8mg/L)为杀灭多子小瓜虫半数有效浓度(0.303mg/L)的187.4倍，对鱼安全；具有开发成新型防治鱼类体外寄生纤毛虫渔药的巨大潜力，应用前景广阔。
【专利说明】
姜黄素在制备杀灭鱼类体外寄生纤毛虫药物中的应用
技术领域
[0001] 本发明属于杀灭寄生虫药物技术领域，涉及姜黄素的新用途，具体涉及一种姜黄 素制备杀灭鱼类体外寄生纤毛虫药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 寄生纤毛虫病是水产养殖中一类危害鱼类的常见病、多发病。多子小瓜虫病属于 寄生纤毛虫病中的一种，俗称"白点病"，在世界范围内分布广泛，从欧亚大陆向北直至北极 圈的附近均有分布。多子小瓜虫寄生在各种鱼类的上皮组织和鳃丝组织中，剥取寄主的上 皮细胞和红细胞，往往可使成千上万的鱼种在几天之内死亡，造成严重的经济损失。几十年 以来，化学药物成为防治多子小瓜虫病的最有效的方式，但这些化学药物具有高残留、污染 环境、对人类健康危害大等副作用，如孔雀石绿和汞制剂等药物被报道出对人体有较强的 致癌和致畸作用，已经被多数国家在食用鱼上禁用。因此，寻找安全而高效的新型药物防治 多子小瓜虫病刻不容缓。
[0003] 我国中草药资源十分丰富，研究发现，部分中草药具有杀灭多子小瓜虫的活性物 质，这些天然物质毒副作用小，易降解，不会对环境造成污染，是开发无公害渔药的理想材 料。
[0004] 姜黄素是从姜科(Zingiberaceae)植物姜黄(Curcuma Ionga)根莖中分离纯化出 的一种多酸化合物。姜黄素为黄色粉末，分子式C2iH2〇〇6，分子量368。姜黄素作为联合国粮食 与农业组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)所规定的天然植物色素之一。它不仅具有重要的经 济价值，而且拥有广泛的药理作用(如抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗菌、降血脂等）。其结构式为：
[0005]
【发明内容】
[0006] 为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种姜黄素在制备杀灭 鱼类体外寄生纤毛虫药物中的应用，特别是在制备杀灭多子小瓜虫药物中的应用。
[0007] 本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0008] 姜黄素在制备杀灭鱼类体外寄生纤毛虫药物中的应用。
[0009] 所述的鱼类寄生纤毛虫指多子小瓜虫（Ichthyophthirius multifiliis)。
[0010] 所述的姜黄素的有效治疗浓度为4~Hmg每升鱼类养殖用水。
[0011] 所述的药物的剂型优选为药液或粉剂。
[0012] 本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：
[0013] (1)本发明首次将姜黄素应用于制备杀灭鱼类体外寄生纤毛虫药物，特别是用于 杀灭多子小瓜虫，在有效剂量范围内可完全杀灭寄生虫，达到防治小瓜虫病的效果。
[0014] (2)本发明的姜黄素来源广泛，价格低廉，原料丰富，制备工艺已经工业化，具有开 发成新型防治鱼类体外寄生纤毛虫渔药的巨大潜力，应用前景广阔。
[0015] (3)姜黄素对环境无残留无污染，对人体无毒无害，其对鱼的半致死浓度(56.Smg/ L)为杀灭多子小瓜虫半数有效浓度(0.303mg/L)的187.4倍，对鱼安全。
【具体实施方式】
[0016] 下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0017] 实施例中用到的寄主模型鱼为草鱼(Ctenopharyngodon idellus)，来源于广州市 花都区五星村鱼苗场。寄生虫模型为多子小瓜虫（Ichthyophthirius multifiIiis)，来源 于广州市花地湾花鸟鱼虫市场。
[0018] 实施例1:姜黄素对多子小瓜虫感染性幼虫的杀灭作用
[0019] ⑴药物的配制：称取姜黄素粉末2mg，用20yL二甲基亚砜(DMSO)促溶，加入761.25 yL纯水，配成2560mg/L的一级储备液。取150yL-级储备液和1350yL纯水配成1.5mL 256mg/ L的二级储备液。用二倍梯度稀释法依次配制成128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125和 〇mg/L(对照组）的药液各1.5mL。以实验用最高浓度药液中DMSO的含量(0.13 % )为标准，配 制含0.13 % DMSO的对照组处理液。
[0020] (2)取96孔板，将含有大约500个幼虫的IOOyL水溶液加入各孔中，接着在各孔中加 入IOOyL不同浓度的药液，使各孔中最终姜黄素的浓度依次为64、32、16、8、4、2、1、0.5、 0.25、0.125、0.06和Omg/L(对照组），各药物浓度设置3个平行。在显微镜(放大倍数4 X )下 记录不同药物浓度下幼虫的致死时间，并计算致死率和半数有效浓度(EC5q)，计算公式如 下：
[0021 ] 致死率（％ ) = (1-实验组幼虫个数/对照组幼虫个数）X 100%。
[0022] 结果显示：lmg/L浓度下，姜黄素可在21.7 ± 1.5min完全杀灭多子小瓜虫感染性幼 虫;随着姜黄素浓度的升高，杀虫时间明显缩短。
[0023]实施例2:姜黄素对多子小瓜虫成虫的杀灭作用 [0024] (1)药物配制：同实施例1。
[0025] (2)向24孔板各孔中加入200yL约含60个成熟成虫的虫液并准确统计各孔成虫数， 再分别加入200yL不同浓度的姜黄素药液，使最终药物的浓度依次为64、32、16、8、4、2、1和 〇mg/L(对照组），各药物浓度设置3个平行。实验温度保持为23 ±0.5°C，4倍物镜下记录各孔 虫体5h内的致死时间和各孔存活成虫数，计算5h死亡率和半数有效浓度(EC5q)。上述计数完 毕后，计算6h各孔形成包囊的个数，并将24孔板静置于23±0.5°C的恒温培养箱中，经16h分 裂孵化，记录各孔孵化幼虫数，并计算各浓度平均每个包囊孵化的幼虫数量，计算公式如 下：
[0026] 死亡率（％ ) = (1-实验组成虫个数/对照组成虫个数）X 100%。
[0027] 平均每个包囊孵出幼虫数=各孔幼虫数/各孔的包囊数。
[0028] 结果显示：浓度在Smg/l时，姜黄素在31.0 ± 1.0 min可完全杀死多子小瓜虫成虫， 并且无幼虫释放。姜黄素的浓度越高，完全杀死成虫的时间越短。尽管姜黄素浓度在4、2和 lmg/L时，虽不能完全杀灭小瓜虫成虫，但与对照组相比，仍具有显著的杀灭效果。
[0029] 实施例3:姜黄素对多子小瓜虫包囊的杀灭作用
[0030] (1)药物配制：同实施例1。
[0031] (2)在24孔板的各孔中加入200yL约含30个成熟小瓜虫成虫的虫液，静置6h，待其 形成包囊后，统计各孔包囊数，再分别加入200yL不同浓度的药液，使最终药物的浓度依次 为64、32、16、8、4、2、1和0mg/L(对照组），各药物浓度设置3个平行。加药后，将24孔板置于23 °C恒温培养箱中静置16h，在4倍显微镜下观察孵化情况，统计各孔孵化幼虫数，并计算平均 每个包囊孵化的幼虫数，计算公式如下：
[0032] 平均每个包囊孵出幼虫数=各孔幼虫数/各孔的包囊数。
[0033]结果显示:姜黄素的浓度越高，抑制小瓜虫包囊孵化的效果越明显。姜黄素浓度在 4mg//L时可完全抑制包囊孵化。浓度在2和lmg/1时，虽不能完全抑制小瓜虫包囊孵化，但与 对照组相比，仍具有显著的抑制效果。
[0034]实施例4:低浓度姜黄素对多子小瓜虫幼虫感染力的影响
[0035] (1)药液配制:根据实施例1的方法，配制成2、I、0 · 5、0 · 25、0 · 125和Omg/L(对照组） 的药液各120mL。
[0036] (2)取40mL大约含200000个感染性幼虫的水溶液加入IOOmL烧杯中，再加入40mL不 同浓度的姜黄素溶液，混匀，使感染性幼虫于最终浓度分别为1、0.5、0.25、0.125、0.06和 〇mg/L的姜黄素药液中处理30min，每个浓度组设置3个平行。取18个水族箱，事先加入5L曝 气自来水，平均每个水族箱分配10尾健康的草鱼苗，共180尾，将姜黄素不同浓度处理过的 幼虫倒入各水族箱中，让其感染草鱼，感染2h后，将每个水族箱的水加至IOL，水温控制在23 ± 0.5 °C，由充气栗供氧。第七天，用150mg/L的麻醉剂(MS222)麻醉草鱼，统计每尾草鱼体表 的白点数，计算感染率和感染强度。
[0037]感染率（％ )=(体表存在白点的鱼数/总鱼数）X 100% ;
[0038]感染强度=体表白点总数/体表存在白点的鱼数；
[0039]结果：lmg/L的姜黄素可以完全阻止多子小瓜虫感染草鱼，感染强度为0。姜黄素浓 度在0.5mg/L和0.125mg/L之间处理组的感染强度和感染率与对照相比均有显著的差异。浓 度为0.06mg/L的姜黄素虽然不能完全阻止多子小瓜虫感染草鱼，但该浓度下多子小瓜虫的 感染强度显著低于对照组。
[0040]实施例5:姜黄素对多子小瓜虫的在体预防与治疗实验
[0041] (1)药液配制:根据实施例1方法，称取2.25g姜黄素配制成20000和Omg/L(对照组） 的药液各112.5mL。
[0042] (2)选取75尾轻度感染多子小瓜虫的草鱼苗(体表白点数20 ±8个)和180尾未感染 多子小瓜虫的健康鱼随机分配到15个水族箱中（事先加入IOL曝气自来水），平均每个水族 箱放入5尾已感染多子小瓜虫的草鱼苗和10尾健康的草鱼苗。随后向各水族箱中加入上述 配制的药液，混匀，使姜黄素的最终浓度分别处于4、2、1、0.5和Omg/L，每组3个平行。试验期 间，每天更换相同体积的新鲜曝气自来水并加药，保持各水族箱药物浓度与第一天相同，持 续用药10天，停药5天，记录死亡的草鱼数，并及时清理。各缸由供氧栗供氧，温度控制在23 ±0.5°C。在第15天，用150mg/L的麻醉剂(MS222)麻醉草鱼，记录姜黄素各浓度组草鱼体表 的白点个数，统计感染率、感染强度和存活率。
[0043] 感染率（％ )=(体表存在白点的鱼数/总鱼数）X 100% ;
[0044] 感染强度=体表白点总数/体表存在白点的鱼数；
[0045] 存活率（％ )=(实验后存活鱼数/实验前总鱼数）X 100% ;
[0046] 结果显示:浓度为1和0.5mg/L时患病鱼与健康鱼的存活率与对照组相比均有显著 的差异。随着浓度的升高，患病鱼与健康鱼的感染率和感染强度显著降低。姜黄素在4mg/L 浓度下，十天内可完全治愈多子小瓜虫病。2mg/L浓度下患病鱼和健康鱼的存活率分别为 93.3±11.5%和100.0±0.0%。说明在此浓度下，211^/1的姜黄素起到了明显的治疗作用和 完全的预防作用(表1)。
[0047] 表1姜黄素对多子小瓜虫在体治疗与预防实验
[0049] 注："Γ表示实验前已感染多子小瓜虫的草鱼；"N"表示实验前未感染多子小瓜虫 的草鱼；"一"表示15天后所有的鱼都死亡；同一纵栏内数值右上角标有相同字母表示差异 不显著(P>0.05)，标有不同字母则表示差异显著(P〈0.05)。
[0050] 实施例6:姜黄素对草鱼的急性毒性实验
[0051] (1)预实验:测定实验草鱼在24h内全部死亡的姜黄素浓度为60mg/L，96h内不发生 死亡浓度为50mg/L。
[0052] (2)将210尾草鱼分别放入21个水族箱中（平均每个水族箱10尾，事先加入5L曝气 自来水），水温控制在23 ±0.5 °C，并用充气栗供氧。在预实验的基础上设置60、58、56、54、 52、50和Omg/L (对照组)七个姜黄素浓度组进行急性毒性实验。实验期间随时观察实验鱼的 中毒情况，如发现草鱼死亡，立即捞出，以免破坏水质，影响实验结果。96h统计实验结果，计 算半致死浓度(LC 5q )和95 %置信区间。
[0053]结果表明：急性毒性实验中，姜黄素处理组草鱼未出现死亡的浓度为54mg/L;浓度 为56mg/L时，12h开始出现死亡，而后到48h草鱼对环境逐渐适应，未见鱼死亡;浓度为58mg/ L时，12h内鱼出现急性中毒死亡;浓度为60mg/L时，12h内草鱼全部中毒死亡(表2)。
[0054]姜黄素的毒性低，对草鱼的96h半致死浓度(LC5q)为56.8mg/L，是其4h杀幼虫的半 有效浓度(EC5q)O · 303mg/L的187 · 4倍，是其5h杀成虫的半有效浓度(EC5Q)2 · 891mg/L的19 · 6 倍，对鱼安全(表3)。
[0055]表2姜黄素对草鱼的急性毒性实验
[0057] 注：同一纵栏内数值右上角标有相同字母表示差异不显著(P>0.05)，标有不同字 母则表示差异显著(P〈〇. 05)。
[0058] 表3姜黄素杀多子小瓜虫幼虫和成虫效果（EC5q)以及对草鱼的急性毒性实验 (LC50)
[0060] 注:95% CI表示95 %置信区间。
[0061] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 姜黄素在制备杀灭鱼类体外寄生纤毛虫药物中的应用。2. 根据权利要求1所示的应用，其特征在于：所述的鱼类寄生纤毛虫指多子小瓜虫 (Ichthyophthirius multifiliis)〇3. 根据权利要求1所示的应用，其特征在于:所述的姜黄素的有效治疗浓度为4~Hmg 每升鱼类养殖用水。4. 根据权利要求1所示的应用，其特征在于:所述的药物的剂型为药液或粉剂。
【文档编号】A61K31/12GK105943524SQ201610327472
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年5月16日
【发明人】张其中, 刘彦甍
【申请人】暨南大学