大脑；背最长肌；股二头肌；腓肠肌；比目鱼肌；睾丸；附睾脂；背脂；腹脂；胰） 进行了转录鉴定分析。具体方法为：提取7月龄的组织样品RNA，使用阴性猪作为对照，采 用实时定量PCR的方法（PPAR y 2上游引物TCCCGCTGACCAAAGCAAAGGC，PPAR y 2下游引物 CCACGGAGCGAAACTGACACCC)，检测PPAR y 2在各组织的mRNA表达水平。由于PPAR y 2基因是 猪的内源性基因，本身在阴性猪中就有一定水平的转录。经过肌肉特异性启动子MCK超表 达目的基因后，目的基因PPARy2在转基因猪中的部分组织器官中的表达出现了差异。结 果如图7所示，PPARy 2基因在转基因猪脂肪和肌肉组织中出现了明显的上调表达趋势，尤 其是在背最长肌、股二头肌和腓肠肌中达到了显著水平，其中背最长肌上调表达4. 32倍， 股二头肌中上调表达3. 28倍，腓肠肌中上调表达2. 26倍，比目鱼肌中上调表达1. 40倍。 在心、肾、小肠和脑中的表达量也有所提升，在脑中的表达量增加4. 24倍，并达到极显著水 平。在脾、肺和胃等组织中表达量呈下调表达。
[0065] 本发明从转基因猪和野生型猪（非转基因）中各分离并提取了三种骨骼肌组织蛋 白，进行Western Blot检测分析。对PPARy2转基因猪背最长肌中相关蛋白进行表达分 析后发现，相对于阴性对照，PPARy蛋白相对表达量上调，PGC1 a和Tnni I的表达量显著 上调，其中PGC1 a蛋白表达量提高1. 99倍，差异达到极显著水平；Tnni I蛋白表达量提高 1. 56倍，差异达到显著水平（见图8)。
[0066] 对PPAR y 2转基因猪比目鱼肌中相关蛋白的表达进行分析，结果发现，相对于阴 性对照，PPARy蛋白相对表达量显著上调1. 46倍，差异达到显著水平；PGC1 a的表达量略 降低；Myoglobin蛋白表达量提高1. 22倍，差异达到显著水平（图9)。
[0067] 对PPARy 2转基因猪腓肠肌中相关蛋白的表达进行分析，结果发现，相对于阴 性对照，PPARy及与红肌类型相关的PGC1 a和MyHC2A蛋白相对表达量均显著上调，其 中PPARy蛋白表达量相对显著上调1. 58倍，PGC1 a蛋白表达量相对显著上调1. 73倍， MyHC2A上调3. 59倍且差异达到极显著水平；Myoglobin蛋白表达量提高1. 29倍，但差异不 显著（图10)。
[0068] 参考文献
[0069] 1、黄锦亮（Jinliang Huang).猪PPARy 2基因肌肉超表达真核表达载体构建以及 在转基因小鼠中的功能验证.[博士学位论文].武汉：华中农业大学图书馆，2012(http:// www. cnki. net/KCMS/detail/detail. aspx? QuerylD = O&CurRec = l&recid = &filename =1012458081. nh&dbname = CDFD1214&dbcode = CDFD&pr = &urlid = &yx = &v = MTg3MTZWTHZKVkYyNkhMZTlGdEhF cnBFYlBJUjhlffDFMdXhZUzdEaDFUM3FUcldNMUZyQlVSTCtm YitacOZ5bmc = )〇
【主权项】
1. 一种改良猪肌肉品质的方法，包括克隆如SEQ ID NO :1所示序列的PPARy基因，制 备调控PPARy基因的如SEQ ID NO :2所示序列的启动子MCK，构建得到超表达PPAR Y基 因的载体pNl-MCK-PPAR y 2 ;其特征在于，还包括通过体细胞核移植获得转PPAR y基因猪， 其制备步骤如下： (1) 建立大白猪30日龄胎儿成纤维细胞系，通过电转染的方法将SwaI线性化的 pNl-MCK-PPAR 丫 2表达载体转入大白猪30日龄胚胎成纤维细胞内，作为体细胞核移植的供 体细胞； (2) 利用浓度为500 y g/ml的G418对电转染后的猪胎儿成纤维细胞进行毒性筛选； (3) 当阳性PPARy单克隆细胞长满后培养接触抑制2天后，采用消化和离心方法，加入 200 y 1显微操作液重悬细胞沉淀，作为供体细胞进行后续显微操作； ⑷采卵后，挑选形态规则、外围有3层以上的卵丘细胞紧密包围、胞质致密均匀的卵 丘卵母细胞复合体，以50C0Cs/500 y 1的数量进行聚集培养；取出后用卵泡液稀释的0. 1% 浓度的透明质酸酶、消化成熟后的COCs，在体视镜下挑选排出具有第一极体、卵黄膜完整、 卵周隙清晰、胞质均匀的卵母细胞；将浓度为7. 5 y g/ml的细胞松弛素B溶解于操作液中， 制成显微操作滴；同时采用纺锤体成像系统定位极体，用注射针去核，并将供体细胞注入 透明带下；将重构卵移入盖有石蜡油的胚胎培养液PZM-3中进行平衡，于38°C，5% 0)2和 100%相对湿度的培养箱中平衡IOmin ; (5) 向细胞融合仪施加一个30 y s，120V/mm，2D的直流电脉冲诱导融合并同时激活重 构卵，然后进行胚胎移植，获得转PPAR y 2基因克隆猪； (6) 在形态学、DNA、RNA和蛋白水平上对转PPAR y 2基因猪的肌内脂肪含量和肌肉肉质 性状进行检测分析； 其中： 步骤⑴中所述的超表达PPAR丫基因的pNl-MCK-PPAR丫 2载体包含有如序列表SEQ ID NO :1所述的序列和SEQ ID NO : 2所述的序列； 步骤（3)所述的显微操作液按如下方法配制：在600ml的去离子水中，按顺序加入 9. 500g 的 TCM-199,0. 050g 的碳酸氢钠，0? 750g 的 HEPES，I. 855g 的氯化钠、0? 050g 的青霉 素、0. 060g的链霉素、3. Og的牛血清白蛋白，使用前现加；溶解后将pH调至7. 2-7. 4,用去 离子水定容至1L，保持渗透压为280m0sm，接着用0. 22 ym滤器过滤，用封口膜封存后于4°C 备用； 步骤（4)中所述的胚胎培养液PZM-3按如下方法配制：在60mL的去离子水中，按顺序 加入0? 6312g的氯化钠、0? 0746g的氯化钾、0? 0048g的磷酸二氢钾、0? 0099g的七水硫酸 镁、0. 2106g的碳酸氢钠、0. 0022g的丙酮酸钠、0. 0617g的五水乳酸钙、0. 0146g的谷氨酰 胺、0.0546g的亚牛磺酸、5mg的庆大霉素、fatty acid free牛血清白蛋白0.3g;调pH至 7. 2-7. 4,用去离子水定容至100ml，保持渗透压为286-290m0sm，接着用0. 22 y m滤器过滤 除菌，分装后用封口膜封存于4°C下保藏。2. 根据权利要求1所述的一种改良猪肌肉品质的方法，其特征在于，步骤（1)中所述的 电转染方法如下：取出培养的大白猪30日龄胎儿成纤维细胞，经消化、漂洗并离心后，加入 350 y 1的OPTI-MEM培养基，再加入5 y g线性化的pNl-MCK-PPAR y表达载体，混合均匀，置 于Bio-rad Gene Pulser Xcell电击杯中，避免出现气泡，保持10-30Q正常电阻，用于电 击程序的电压为260V，电容为900 y F，比色皿为2mm，电击处理后将剩余的底部液体全部转 移至六孔板中进行常规细胞培养。3. -种超表达PPARy基因的表达载体pNl-MCK-PPARy2在转基因猪中的应用，其特征 在于，该表达载体包含有在猪肌肉组织中超表达PPARy基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示，及其调控该基因的启动子MCK，其核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示。4. 权利要求1所述的启动子MCK在培育转基因猪或猪肌肉组织中超表达转化中的应 用。5. 权利要求1所述的PPARy基因在培育转基因猪或猪肌肉组织中超表达转化中的应 用。6. 如权利要求5所述的的应用，其中还包括在改良猪肉质性状中的应用。7. 如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的猪肉质性状包括肌内脂肪含量、嫩 度、大理石纹评分、滴水损失、肉的亮度和增加氧化型肌纤维类型。
【专利摘要】本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及一种改良猪肌肉品质的方法。本发明的特证是：将PPARγ基因作为提升肌肉品质的重要候选基因，建立大白猪30日龄胎儿成纤维细胞系，通过电转染的方法将SwaI线性化的pN1-MCK-PPARγ2表达载体转入大白猪30日龄胚胎成纤维细胞内，使用体细胞核移植的方法制备PPARγ转基因猪，在转基因猪中验证肌肉组织超表达PPARγ基因对肌内脂肪沉积等肉质性状的影响，克服了传统的动物育种中同时选择肉质和肉量的矛盾，为培育出良好肌肉品质的瘦肉猪新品种提供一种新的方法。
【IPC分类】C12N15/85, A01K67/027, C12N15/873
【公开号】CN105039402
【申请号】CN201510467453
【发明人】熊远著, 周颖, 左波, 徐德全, 任竹青, 夏晓亮, 马志远
【申请人】华中农业大学
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年8月3日