一种制备雄性不育辣椒的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于辣椒育种技术领域，具体地，涉及一种制备雄性不育辣椒的方法。
【背景技术】
[0002] 辣椒（Ca/wicwa? a/Mi/a?)属于前科（Solanaceae)辣椒属一年或多年生草本植物，其 果实是一种世界性的蔬菜和加工调味品。辣椒为常异花授粉植物，杂种优势非常明显，优良 杂种一代比常规品种可增产30% ~50%。杂种优势的利用，已成为辣椒生产上提高产量和 增加经济效益的重要手段。但目前我国杂交制种多采用蕾期人工去雄、授粉，不但制种成本 高而且很难保证种子纯度。利用雄性不育系配制一代杂种，不仅可以简化制种程序，降低种 子生产成本，而且可以提高杂种的纯度。因此，雄性不育系的选育及其应用研究越来越受到 人们的重视。
[0003] 花粉败育是植物雄性不育发生的表型体现，弄清花粉发育的全过程和分子机理是 研究植物雄性不育的基础和关键所在。花粉发育涉及众多基因的表达调控，对花粉发育相 关基因的研究不仅可以了解花粉发育的分子机制，还可以为人工创制雄性不育提供理论基 础。这些基因的敲除能导致植物部分或完全不育，然而在辣椒中对花粉发育相关基因的研 究甚少。可以通过RNA干扰技术敲除辣椒花粉发育中的相关基因，创制雄性不育的辣椒材 料。
【发明内容】
[0004] 本发明针对现有技术的不足，提供了一种制备雄性不育辣椒的方法，该方法通过 构建含有花药特异基因的重组载体，制备出花粉活力降低的材料，通过对该材料的的改进 与优化可进一步制备出辣椒雄性不育材料，对辣椒新品种的选育有重要价值。
[0005] 本发明的上述目的是通过以下技术方案予以实现的。
[0006] -种制备雄性不育辣椒的方法，包括如下步骤： 51. 构建含有如SEQ ID N0:1~2所示基因的重组RNAi干扰载体； 52. 将S1得到的重组RNAi干扰载体转化农杆菌，得到重组农杆菌； 53. 用重组农杆菌转染辣椒外植体，经培养获得转化植株，筛选得到雄性不育辣椒。
[0007] 将S1所述基因的cDNA序列如SEQ ID NO: 1所示，长1919bp;基因的 开放阅读框序列如SEQ ID N0:2所示，长1758bp。
[0008] 优选地，S1所述RNAi干扰载体的构建方法为： 511. 利用SEQ ID N0:3~4所示正义引物扩增得到基因的正义片段，利用SEQ ID N0:5~6所示反义引物扩增得到^#57基因的反义片段； 512. 将正义片段和反义片段先后连接到同一 RNAi干扰载体，制得^#57基因的重组 RNAi干扰载体。
[0009] 步骤S11克隆该基因正义片段的引物对如SEQ ID N0:3~4所示，克隆该基因反义 片段的引物对如SEQ ID N0:5~6所示。正、反义序列的引物对分别为： UP-SP4-1 :5, -CGGATTTAAATAGTCAGTGGAGCAAGCAA-3,， UP-SP4-2 ：5r - CGCGGATCCAGTCAGTGGAGCAAGCAA-3'； DW-SP4-1：5r -CATGCCATGGTTAGCCCTGGAATGTGGA-3r， DW-SP4-2：5r -TCCCCCGGGTTAGCCCTGGAATGTGGA-3'。
[0010] 优选地，所述RNAi干扰载体为PFGC5941载体。
[0011] 优选地，在正义片段的两端引入和Afcol限制性内切酶切位点，在反义片段的 两端引入和你遍1限制性内切酶切位点，通过酶切连接反应将正义片段和反义片段先 后连接到PFGC5941载体中。
[0012] 优选地，S3所述辣椒外植体为：将培养的无菌苗的一侧子叶从叶柄基部连同顶芽 及周围分生组织全部切去，只留一侧子叶。
[0013] 优选地，S3所述重组农杆菌转染农杆菌辣椒外植体时的0D6。。为0. 4~0. 8,转染时 间为12min。
[0014] 优选地，S3所述培养包括如下步骤： 531. 外植体与菌液摇匀接种至分化培养基中，在25±1°C条件下恒温黑暗培养2~3d ; 532. 抑菌培养：再接种于抑菌培养基中27 °C培养4~5d ; 533. 筛选培养：再接种于PPT筛选培养基上，每两周继代一次，继代2~3次；直到只 有少许外植体能在筛选培养基上长出抗性芽，而大部分外植体在含PPT的筛选培养基上褪 绿，变黄焦化为止； 534. 生根培养：当分化的不定芽伸长至1.5~2. 5 cm时，将其自基部切下，接种于生 根培养基中诱导其生根，再炼苗2~3 d，移栽获得雄性不育辣椒。
[0015] 上述分化培养基、抑菌培养基、筛选培养基、生根培养基采用辣椒组培领域常见的 培养基即可。
[0016] 优选地，S33中筛选培养基的PPT浓度为2 mg/L。
[0017] 优选地，菌液浸染前，将所述辣椒外植体放入所述分化培养基中，于27°C黑暗预培 养2~3 d〇
[0018] 优选地，获得辣椒无菌苗的方法为：将辣椒种子经75%酒精、2%次氯酸钠消毒后， 用无菌水浸泡，倒去无菌水，吸去种子表面的水分，在25~28°C黑暗条件下培养5~6d，然 后把种子取出放到27°C、光照2000 lx 14 h/d培养条件下培养，待辣椒小苗长出两片子叶 并且生长点即将露出时即获得辣椒无菌苗。
[0019] 与现有技术相比，本发明有益效果在于：提供了一种制备雄性不育辣椒的方法，该 方法通过构建含有花药特异基因的重组载体，制备出花粉活力降低的材料，通过对该材料 的的改进与优化可进一步制备出辣椒雄性不育材料，对辣椒新品种的选育有重要价值。本 发明经过2~3代筛选，获得抗性辣椒，T。代转基因阳性率达39. 6%，Ti代转基因阳性率达 29. 2% ;T。代干扰植株的花粉萌发率为21. 84%，而野生型对照为52. 63%，说明制备得 到的转基因植株有一定的雄性不育性。
【附图说明】
[0020] 图1为提取的辣椒可育株或不育株八个等级混合花蕾RNA普通琼脂糖凝胶电泳 图；其中，F为可育株，S为不育株。
[0021 ] 图2为的cDNA全长和推导的氨基酸序列；起始密码子和终止密码子用黑体 表示；双画线部分为FAR-N-SDR-e保守域；单下划线部分为STERILE保守域。
[0022] 图3为在辣椒花蕾不同发育时期的表达；a. RT-PCR分析，Jc (ii?为内参基 因；b. qRT-PCR分析；Fl~8, Sl~8分别为可育株和不育株1~8级花蕾。
[0023] 图4为在辣椒不同组织部位的表达分析；a. RT-PCR分析，如仏?为内参基 因；b. qRT-PCR分析；Fl~8, Sl~8分别为可育株和不育株根、茎、叶、开放花、花萼、花瓣、花 药以及雌蕊。
[0024] 图5为正、反义片段PCR电泳图；M :DL2000 Marker ;1-正义片段；2-反义 片段。
[0025] 图6为的正义片段测序结果。
[0026] 图7为的反义片段测序结果。
[0027] 图8为的目的片段测序blastn比对结果。
[0028]图9为pFGC5941-B质粒的酶切电泳图（及I、I);M :DL2000 ;1~5 为重组质粒。
[0029] 图10为的RNAi载体转化农杆菌的菌液PCR电泳图；M :DL2000 ;CK:阴性对 照：1 ~13 为 pFGC5941-B 菌液。
[0030] 图11为T。代转化植株的PCR检测（Bar基因引物);M :DL2000 Marker;1-阳 性对照；2-空白对照；3-阴性对照；4~24为T。代抗性植株。
[0031] 图12为T。代转化植株的PCR检测（35S启动子引物）；M :DL2000 Marker; 1-阳性对照；2-空白对照；3-阴性对照；4~24为T。代抗性植株 图13为转基因植株扩增片段序列比对结果。
[0032] 图14为转基因植株与对照生长状况。
[0033] 图15为干扰植株与对照花器官形态。
[0034] 图16为花粉离体萌发显微视图；A_G#57沉默植株；B-野生型。
[0035] 图17为T0代转化植株的