专利名称：用于鉴定黄瓜黑星病抗性的引物序列及其鉴定方法
技术领域：
本发明涉及生物技术中的DNA序列，及其利用DNA序列鉴定黄瓜黑星病抗性的方法。
背景技术：
黄瓜黑星病是危害黄瓜、影响黄瓜品质和产量的一个重要因素。它是随着黄瓜种子的引进而产生出的一种新的危险性病害。70年代以前，仅在东北温室零星发生，80年代后，随着保护地栽培的发展，首先在东北三省不少城市的保护地黄瓜上严重发病，并逐年扩展，危害加重，发病率高达90％-100％，产量损失轻者20％-30％，重者达78％。后来在山西、甘肃、内蒙、海南、河北、山东、北京等地相继发生。它主要发生在保护地黄瓜上，严重影响黄瓜的商品性。病菌侵染幼苗，在子叶上产生黄白色圆形斑点，进而腐烂，严重时整株腐烂死亡。由于黄瓜黑星病是种传病害，所以被列为检疫对象。
培育抗黑星病黄瓜新品种是解决问题的关键。随着分子标记及相关技术的迅速发展，分子标记辅助育种已经成为目前研究的热点之一。而且与常规育种相比，分子标记辅助育种具有准确、快速、效率高等优点。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种用于鉴定黄瓜黑星病抗性的引物序列；本发明的另一个目的是提供一种鉴定黄瓜黑星病抗性的方法。
本发明的技术方案概述如下一种用于鉴定黄瓜黑星病抗性的引物序列，它由上游引物和下游引物组成，所述上游引物具有序列表中SEQ ID No1所述的核苷酸序列，所述下游引物具有序列表中SEQ ID No2所述的核苷酸序列。
一种鉴定黄瓜黑星病抗性的方法，它包括如下步骤(1)提取黄瓜基因组DNA；(2)进行PCR扩增，在PCR扩增专用薄壁管中放入所述黄瓜基因组DNA15～30ng、序列表中SEQ ID No1所述的核苷酸序列20～40ng、序列表中SEQ ID No2所述的核苷酸序列20～40ng、dNTP0.15～0.25mM、Mg2+1.2～2.0mM、1倍的PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶0.8～1.2单位，加无菌重蒸馏水至20μl，将所述PCR扩增专用薄壁管放入PCR仪中扩增，扩增条件为94℃预变性180～300秒，94℃变性60秒，50～59℃退火40～60秒，72℃延伸60～120秒，25～35个循环，再72℃延伸300～420秒，扩增完成；
(3)PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析将扩增产物采用2％琼脂糖凝胶进行电泳分离；在扩增产物中加入凝胶上样缓冲液，混匀，然后点样于事先准备好的含有0.5μg/ml溴化乙锭的琼脂糖凝胶上，采用5V/cm的电压进行电泳使溴酚蓝泳至凝胶的2/3，紫外观察箱观察照相；(4)依据各被鉴定样品在凝胶上条带的有无，鉴定黄瓜黑星病的抗性。
本发明鉴定结果与田间抗病吻合率达95％，(数据见表1)而且具有快速、准确、不受环境条件影响等优点，在黄瓜黑星病抗性筛选上具有很大的应用价值。
图1为鉴定黄瓜黑星病抗性的电泳图；图2显示了19bp的DNA片段的核苷酸序列(SEQ ID No1)；图3显示了19bp的DNA片段的核苷酸序列(SEQ ID No2)；具体实施方式
下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步的说明，下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1一种鉴定黄瓜黑星病抗性的方法，包括如下步骤(1)提取黄瓜基因组DNA，提取的方法为常规方法；(2)进行PCR扩增，在PCR扩增专用薄壁管中放入黄瓜基因组DNA20ng、序列表中SEQ ID No1所述的核苷酸序列30ng、序列表中SEQ ID No2所述的核苷酸序列30ng、dNTP0.2mM、Mg2+1.5mM、1倍的PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶1.0单位，加无菌重蒸馏水至20μl，将所述PCR扩增专用薄壁管放入PCR仪中扩增，扩增条件为94℃预变性200秒，94℃变性60秒，55℃退火50秒，72℃延伸90秒，30个循环，再72℃延伸350秒，扩增完成；(3)PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析将扩增产物采用2％琼脂糖凝胶进行电泳分离，在扩增产物中加入凝胶上样缓冲液，混匀，然后点样于事先准备好的含有0.5μg/ml溴化乙锭的琼脂糖凝胶上，采用5V/cm的电压进行电泳使溴酚蓝泳至凝胶的2/3，紫外观察箱观察照相；(4)依据各被鉴定样品在凝胶上条带的有无，鉴定黄瓜黑星病的抗性。由于抗病单株经扩增以后产生分子量大小约为120bp的DNA片段，而感病单株没有该条带，因此很容易通过特异条带的有无对黄瓜黑星病材料的抗性进行快速鉴定。如图1所示P1和P2分别为抗病亲本和感病亲本，1为指示DNA标准条带的分子量200bp；2为指示DNA标准条带的分子量200bp，1～7为抗病单株；8～14为感病单株，M为DNA标准，抗性株有带，感性株无带。
实施例2一种鉴定黄瓜黑星病抗性的方法，包括如下步骤(1)提取黄瓜基因组DNA，提取的方法为常规方法；(2)进行PCR扩增，在PCR扩增专用薄壁管中放入黄瓜基因组DNA15ng、序列表中SEQ ID No1所述的核苷酸序列20ng、序列表中SEQ ID No2所述的核苷酸序列20ng、dNTP0.15mM、Mg2+1.2mM、1倍的PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶0.8单位，加无菌重蒸馏水至20μl，将所述PCR扩增专用薄壁管放入PCR仪中扩增，扩增条件为94℃预变性180秒，94℃变性60秒，50℃退火60秒，72℃延伸60秒，25个循环，再72℃延伸300秒，扩增完成；(3)PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析将扩增产物采用2％琼脂糖凝胶进行电泳分离，在扩增产物中加入凝胶上样缓冲液，混匀，然后点样于事先准备好的含有0.5μg/ml溴化乙锭的琼脂糖凝胶上，采用5V/cm的电压进行电泳使溴酚蓝泳至凝胶的2/3，紫外观察箱观察照相；(4)依据各被鉴定样品在凝胶上条带的有无，鉴定黄瓜黑星病的抗性。
实施例3一种鉴定黄瓜黑星病抗性的方法，包括如下步骤(1)提取黄瓜基因组DNA，提取的方法为常规方法；(2)进行PCR扩增，在PCR扩增专用薄壁管中放入黄瓜基因组DNA30ng、序列表中SEQ ID No1所述的核苷酸序列40ng、序列表中SEQ ID No2所述的核苷酸序列40ng、dNTP0.25mM、Mg2+2.0mM、1倍的PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶1.2单位，加无菌重蒸馏水至20μl，将所述PCR扩增专用薄壁管放入PCR仪中扩增，扩增条件为94℃预变性300秒，94℃变性60秒，59℃退火40秒，72℃延伸120秒，35个循环，再72℃延伸420秒，扩增完成；(3)PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析将扩增产物采用2％琼脂糖凝胶进行电泳分离，在扩增产物中加入凝胶上样缓冲液，混匀，然后点样于事先准备好的含有0.5μg/ml溴化乙锭的琼脂糖凝胶上，采用5V/cm的电压进行电泳使溴酚蓝泳至凝胶的2/3，紫外观察箱观察照相；(4)依据各被鉴定样品在凝胶上条带的有无，鉴定黄瓜黑星病的抗性。
表1 F2单株田间抗病表现及标记分离统计
续表2
注R抗病；S感病；+有条带；-无条带；*交换单株由表中可以看出，共有交换单株7株，所以吻合率为140/147＝95.2％。
权利要求
1.一种用于鉴定黄瓜黑星病抗性的引物序列，其特征是它由上游引物和下游引物组成，所述上游引物具有序列表中SEQ ID No1所述的核苷酸序列，所述下游引物具有序列表中SEQ ID No2所述的核苷酸序列。
2.一种鉴定黄瓜黑星病抗性的方法，其特征是它包括如下步骤(1)提取黄瓜基因组DNA；(2)进行PCR扩增，在PCR扩增专用薄壁管中放入所述黄瓜基因组DNA15～30ng、序列表中SEQ ID No1所述的核苷酸序列20～40ng、序列表中SEQ ID No2所述的核苷酸序列20～40ng、dNTP0.15～0.25mM、Mg2+1.2～2.0mM、1倍的PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶0.8～1.2单位，加无菌重蒸馏水至20μl，将所述PCR扩增专用薄壁管放入PCR仪中扩增，扩增条件为94℃预变性180～300秒，94℃变性60秒，50～59℃退火40～60秒，72℃延伸60～120秒，25～35个循环，再72℃延伸300～420秒，扩增完成；(3)PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析将扩增产物采用2％琼脂糖凝胶进行电泳分离；在扩增产物中加入凝胶上样缓冲液，混匀，然后点样于事先准备好的含有0.5μg/ml溴化乙锭的琼脂糖凝胶上，采用5V/cm的电压进行电泳使溴酚蓝泳至凝胶的2/3，紫外观察箱观察照相；(4)依据各被鉴定样品在凝胶上条带的有无，鉴定黄瓜黑星病的抗性。
全文摘要
本发明公开了一种用于鉴定黄瓜黑星病抗性的引物序列及其鉴定方法，引物序列是由具有序列表中SEQ ID No1所述的核苷酸序列的上游引物和具有序列表中SEQ ID No2所述的核苷酸序列的下游引物组成；一种鉴定黄瓜黑星病抗性的方法，其步骤(1)提取黄瓜基因组DNA；(2)用序列表中SEQ ID No1所述的核苷酸序列及SEQ ID No2所述的核苷酸序列进行PCR扩增；(3)PCR扩增产物的凝胶电泳分析；(4)依据各被鉴定样品在凝胶上条带的有无鉴定黄瓜黑星病的抗性，本发明鉴定结果与田间抗病吻合率达95％，且具有快速、准确、不受环境条件影响等优点，在黄瓜黑星病抗性筛选上具有很大的应用价值。
文档编号C12N15/11GK1727496SQ200510014669
公开日2006年2月1日 申请日期2005年7月29日 优先权日2005年7月29日
发明者张桂华, 李淑菊, 孙小红, 杜胜利, 王慧哲, 韩毅科, 魏爱民, 张厉 申请人:天津科润农业科技股份有限公司